专利名称：一种新型表面展示质粒的制作方法
技术领域：
生物技术
背景技术：
把有关的基因在酵母细胞表达之后目的蛋白分泌并固定在酵母菌细胞表面上，把这种技术叫做酵母表面展示技术。利用酵母细胞进行表面展示有许多优点。首先由于酵母菌被广泛应用在食品、药品和饮料生产
中，如用于生产蛋白质和各种发酵产品；第二因为固定在细胞表面上的蛋白质是通过共价键连接在细胞壁的葡聚糖上，所以这些蛋白质能牢固地固定在细胞表面上；第三由于许多酵母菌是最安全的生物，可以通过口服使用，所以含有表面表达蛋白质的酵母细胞可以安全地用在食品和药物产品中，如可以安全地作为口服疫苗使用等；第四酵母菌很容易通过发酵大规模生产；第五许多种酵母细胞壁蛋白的基因已经被克隆，并且克隆和表达系统已经齐全。目前酵母菌表面展示技术已经用在活疫苗(展示抗原和抗体)生产、淀粉、纤维素和其他多糖的转化生产葡萄糖，油脂转化生产燃料，淀粉转化生产燃料酒精，超高通量筛选各种催化剂等。目前用于表面展示的酵母菌主要有酒精酵母菌、;;aWoWs、yf7u77ero/z7yces iac"s和/fe"se"u_/a / o」'//zrar/ Aa0但是这些表面展示系统有许多缺点
1. 克隆到酒精酵母菌细胞中的目的基因表达和分泌时需要用大量的乳糖进行诱导，所以无法用在大规模生产上。
2. 所用的克隆、表达和展示的质粒是游离在酵母细胞中，在细胞增殖过程中很容易丢失。
3. 用于这些酵母菌展示的质粒中含有氨苄青每素基因，对环境具有潜在的危害性。
4. 陆地酵母菌，如酒精酵母菌不存在于任何海洋环境中，并且来自于陆地的酒精酵母菌在海洋环境中存活的时间非常短，所以这种酵母菌不能用在海洋生物技术中。
5. 因为所用的宿主是实验室菌株，从营养价值和大规模培养方面根本不适合作为工业生产菌株。
比较完美的酵母表面展示系统应该是
1. 必须利用正常培养基成分进行诱导的表达质粒，而不需用特殊物质进行诱导表达。
2. 为了重组质粒能在每个宿主细胞中稳定遗传，并在每个细胞中具有多拷贝，这种质粒必须是整合型的,这样可以把目的基因插入到宿主染色体上。
3. 最终整合到染色体中的DNA片段不应含有抗生素抗性基因。
4. 质粒多克隆位点上可以插入多个基因，以便表达和展示多种蛋白质。
5. 如果用在海洋环境中所用的宿主应该是海洋酵母菌。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型表面展示质粒、该质粒的构建方法和它的特性。本发明构建了可以用于解脂耶罗维亚酵母菌表面展示外源蛋白的表面展示质粒，大小为5729 bp，该
表面展示质粒已经转化到大肠埃希氏菌细胞中，该转化菌株的保藏单位简称CGMCC，保藏号为
CGMCCNo. 2190。
本发明的特点是首次构建了可以用于解脂耶罗维亚酵母菌展示外源蛋白的表面展示质粒，大小为5729bp,该表面展示质粒碱基序列见附图
，携带有尿嘧啶正常基因(ura3dl)、多克隆位点(Sfil， HindIII，BamHI和Aorl3)和用于表面展示的DNA插入片段Y1CWP130;在解脂耶罗维亚酵母菌细胞中该表面展示质粒是利用正常培养基成分进行诱导的表达质粒；重组质粒在每个细胞中具有多拷贝；这种质粒是整合型的，可以把目的基因插入到宿主染色体上；最终整合到染色体中的DNA片段不含有抗生素抗性基因；该表面展示质粒可以在海洋解脂耶罗维亚酵母菌中表达和进行外源蛋白表面展示。
具体实施例方式
1. 化株和培养基
WT质粒冋收和克隆的细菌是火肠埃希氏菌DH5a,生长该细齒的培养基是LB培养基。转化后的大肠埃希氏齒DH5ot是培养在添加有30 )xg/ml卡那霉素的LB培养基中。转化所用的酵母齒株是解脂耶罗维亚酵母幽。酵母W生K在YPD培养基上[1.0% (w/v)酵母齒提取物，2.0% (w/v)蛋白胨，2.0% (w/v〉葡萄糖]。酵母齒转化子生L々在YNB-N咖。培养基上[O. 17% (w/v)不含氨基酸和硫酸氨的YNB培养基，1.0% (w/v)葡萄糖，0.5% (w/V)硫酸氨]。把目的基闪与表面展示质粒pINA1317-130连接后分别转化大肠埃希氏齒和解脂耶罗维亚酵母齒齒株。
2. 质粒
川r表面展示质粒的基础质粒pY11317来tlT本实验室。STMPLE-18fcoRV/BAP购X丁TaKaRa公司(曰本)。
3. PCR扩增
用丁PCR扩增的反应体系总体积50 lU (PCR仪购买T美国Perkin-Elmer公司的GeneA卿PCR系统2400)， 其中含有l.O ulDNA模板，1 X />ro6e"缓冲液Il (加有MgCh), 200 uMdNTP混合物，0. 5 uM引物，禾ll 1.25 U /y/uteW DNA聚合酶(购买-丁-日本的TaKaRa公司)。PCR扩增的条件是94°CIO分钟，26个循环94。C 45秒，60°C 30秒，72°C 45秒，最后延伸条件为72。C IO分钟。
4. 基闪组DNA和人肠埃希氏齒质粒的提取
按照Sambrook ^人(1989)提供的方法提取解脂耶罗维亚酵母菌酵母菌株总基冈組DNA，并进行纯化。利MJQIApr印Spin Minipr印t式剂盒(德国Qiagen公司)提供的方法从大肠埃希氏齒转化子中分离和提取质粒。
5. 表面展示质粒的构建
首先利WKyte and DooliUle hydropathy软件分析解脂耶罗维亚酵母菌K/CWW基闵(基因登陆S: AY084077)编码的细胞壁蚩白YlOlp，以便选择合适人小的WCW^ 基rac-末端，在本研究中我们选用333个碱基对的WCFWC-末端，然后利用PCR技术扩增该片段，扩增WCWV基因O末端片段的正向引物是Y1CWP110F: 5' -GGCCGTTCTGGCC|AAGCTT|gGA7m^GGC八ACGGTTACGCCGT-3，(卜"划线、方框、粗体和斜体的碱基分别编码5/j'I,y/j';MII，feMn禾ll力a ^JHI限制性酶切位点)，反向引物是YICWPR:5' -GGTACCTTA愿AGGAGAGCGGC-3'(下划线的碱基编码限制性酶切位点)。PCR扩增的方法和条件如上面所述。利W解脂耶罗维亚酵母齒菌株的基因组DNA作为PCR扩增的模板。利用TaKaRa琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒Ver.2.0 (TaKaRa,日本)通过琼脂糖凝胶电泳纯化该PCR产物(361 bp)。利用DNA激酶试剂盒对冋收的PCR产物5'-端进行磷酸化，并插入到质粒pSIMPLE-18 & RV/BAP (TaKaRa, 口本)中。获得的歪组质粒利用6Y7I和《p/71限制性内切酶进行消化，消化产物连接到利用同样酶消化的pINA1317质粒上。迮接产物WT转化人肠埃希氏齒DH5a。从该转化子提取重组质粒，为了证实WCW7基因O末端是否已经迮接到提取的重组质粒上，利用该fi组质粒作为模板，利用上面描述的引物和条件通过PCR技术扩增 7CWl C-末端，根据扩增的PCR产物大小和碱基序列验证表明f7CWW基因C-末端己经连接到提取的重组质粒上。我们把携带有WCW7C末端(361 bp)的质粒pY113i7命名为pINA1317-130，火小为5729 bp。
pINA1317-130碱基序列(共5729 bp)<formula>formula see original document page 5</formula>AGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCA
二TTCGGGAAGCGTG
GCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGT
GGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTA GGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTAT CTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACC ACCGCTGGTAGCGGCGGTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGA
TTCAGGTGGAACAGGACACCTCCCTTGCACTTCTTGGTATATCAGTATAGGCTGATGTATTCATAGTGG
TGATATCTTCTGACGCATTGACCACCGAGAAATAGTGTTAGTTACCGGGTGAGTTATTGTTCTTCTACA
CAGGCGACGCCCATCGTCTAGAGTTGATGTACTAACTCAGATTTCACTACCTACCCTATCCCTGGTACG
CACAAAGCACTTTGCTAGATAGAGTCGACAAAGGCCTGTTTCTCGGTGTACAGAGCTTGGTCCTCCTT
GAAGTTGCGACACATGTCTTGATAGTATCTTGGCTTCTCTCTCTTGAGCTTTTCCATAACAAGTTCTTCT
GCCTCCAGGAAGTCCATGGGTGGTTTGATCATGGTTTTGGTGTAGTGGTAGTGCAGTGGTGGTATTGT
GACTGGGGATGTAGTTGAGAATAAGTCATACACAAGTCAGCTTTCTTCGAGCCTCATATAAGTATAAGT
AGACCATGCGGATACACAGGTTGTGCAGTACCATACATACTCGATCAGACAGGTCGTCTGACCATCAT
GATCTCGGTTCTGGCCGTACAGACCTCGGCCGACAATTATGATATCCGTTCCGGTAGACATGACATCCT
CGGCCAGCATGAGCAGACCTCTGGCCAGCTTCTCGTTGGGAGAGGGGACTAGGAACTCCTTGTACTG GGAGTTCTCGTAGTCAGAGACGTCCTCCTTCTTCTGTTCAGAGACAGTTTCCTCGGCACCAGCTCGCA
TGACACCGGTACTGGTGCTTGACAGTGTTGCCAATATCTGCGAACTTTCTGTCCTCGAACAGGAAGAA TCGATATGGGTCTTGATCATGCACACATAAGGTCCGACCTTATCGGCAAGCTCAATGAGCTCCTTGGTG
CAAAGGCGGACTTGTGGACGTTAGCTCGAGCTTCGTAGGAGGGCAITTTGGTGGTGAAGAGGAGACT GAAATAAATTTAGTCTGCAGCCC
6.利W pINA1317-130把绿色荧光蛋白展示在解脂耶罗维亚酵母菌细胞表面上
根据绿色荧光蛋白的基因(基因登陆号U55761 )设计PCR引物，正向引物为 egfpF: 5' -GGCCGTTCTGGCCATGGTGAGCAAGGGCG-3，(标记有下划线的碱基编码5/il限制性酶切位点)，反向引物 是egfpR: 5' -GGATCCCTTGTACAGCTCGTCCATGC-3'(下划线碱基编码fe/^I限制性酶切位点).PCR扩增的条 f卜和方法如上述，所用的模板为质粒PEGFP。 PCR产物(736 bp)的纯化和它的5'-端磷酸化按上述的方法进行。把磷酸化产物插入到pSIMPLE-18 fcoRV/BAP载体中，重组的质粒用6YYI和ife/dn消化，消化产物连 接到W同样酶消化的pINA1317-130载体中，连接产物用于转化大肠埃希氏菌DH5a。为了证实绿色荧光蛋白 的基闪是否已经连接到提取的重组质粒pINA1317-130上，利用该重组质粒作为模板，利用上面描述的引物 和条件通过PCR技术扩增绿色荧光蛋白的基因，根据扩增的PCR产物人小和碱基序列验证表明绿色荧光蛋白 的基闪已经迕接到提取的重组质粒pINA1317-130上。我们把携带有绿色炎光蛋白基因的pINA1317-130命名 为pINA1317-130-EGFP。为了把目的基因转化到解脂耶罗维亚酵母菌细胞中，利用AbfI酶切 pINA1317-130-EGFP质粒，利用琼脂糖凝胶电泳分离和利用TaKaRa琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒Ver. 2. 0 (TaKaRa，日本)纯化携带有130-EGFP的/totl片段。利用醋酸法把该片断转化到解脂耶罗维亚酵母菌菌株(包 括海洋解脂耶罗维亚酵母菌)中，在YNB-N5。。。平板上选择培养和纯化转化菌株，转化菌株在YPD液体培养 基培养96h。利用炎光显微镜(Olympus BH-2)在492 nm下观察转化细胞表面上的绿色荧光蛋白，并进行拍 照。把从空pINA1317-130载体上获得的不带有绿色荧光蛋白基因的Abtl片段转化到解脂耶罗维亚酵母菌 细胞中，获得的转化子作为对照。
权利要求
1、一种新型表面展示质粒pINA1317-130该质粒转化到大肠埃希氏菌中，大肠埃希氏菌其保藏号为CGMCCNo.2190。
2、 如权利要求1所述的表面展示质粒pINA1317-130，其特征是该表面展示质粒大小为5729 bp，该表面展示质粒碱基序列见附图，携带有尿嘧啶正常基因(ura3dl)、多克隆位点(Sfil， HindIII, BamHI禾口 Aorl3)和用于表面展示的DNA插入片段Y1CWP130。
3、 一种使用权利要求l所述的表面展示质粒在解脂耶罗维亚酵母菌细胞中的表达方法，该表 面展示质粒是利用正常培养基成分进行诱导的表达质粒；重组质粒在每个细胞中具有多拷贝； 这种质粒是整合型的，可以把目的基因插入到宿主染色体上；最终整合到染色体中的DNA片 段不含有抗生素抗性基因。
全文摘要
本发明构建了可以用于解脂耶罗维亚酵母菌表面展示外源蛋白的表面展示质粒pINA1317-130，大小为5729bp，该表面展示质粒碱基序列见附图，携带有尿嘧啶正常基因(ura3d1)、多克隆位点(Sfi1，HindIII，BamHI和Aor13)和用于表面展示的DNA插入片段YlCWP130；在解脂耶罗维亚酵母菌细胞中该表面展示质粒是利用正常培养基成分进行诱导的表达质粒；重组质粒在每个细胞中具有多拷贝；这种质粒是整合型的，可以把目的基因插入到宿主染色体上；最终整合到染色体中的DNA片段不含有抗生素抗性基因；该表面展示质粒可以在海洋解脂耶罗维亚酵母菌中表达和进行外源蛋白表面展示。该质粒转化到大肠埃希氏菌中，大肠埃希氏菌保藏单位简称CGMCC，保藏号为CGMCCNo.2190。
文档编号C12N15/10GK101457220SQ20071019889
公开日2009年6月17日 申请日期2007年12月13日 优先权日2007年12月13日
发明者岳礼溪, 静 李, 池振明, 芳 王, 麟 王, 王祥红 申请人:中国海洋大学