专利名称：一种在细胞表面展示外源蛋白的方法及产品的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种在细胞表面展示外源蛋白
的方法及产品。
背景技术：
随着生物工程技术的发展，具有某些功能活性的蛋白被越来越多地应用于各领 域。然而，蛋白作为有生物活性的物质，其本身极易于失活，稳定性差，保存很困难，且难以 回收利用。并且，尽管目前蛋白的大规模重组制备已经变得可能，然而表达后的蛋白的分离 和提纯还存在诸多的困难，纯化步骤复杂。因此本领域人员致力于寻找提高蛋白的稳定性， 简化蛋白的纯化，固定化蛋白以及使得蛋白回收利用的方法。 此外，作为一种具体的例子，有机磷或氨基甲酸酯类杀虫剂是在农业生产中常用 的一类农药，因其具有种类多样、杀虫谱广、价格低廉等特点，在农业生产上被广泛使用，为 粮食丰产和农业发展提供保证。但由于农药的不合理使用，许多食品中有机磷或氨基甲酸 酯类农药残留超标，导致急性中毒事件时有发生，严重威胁着人们的身体健康和农产品在 国际市场的竞争力，目前已经引起了各国政府和社会各界的广泛关注。目前常用的有机磷 或氨基甲酸酯类农药检测方法有免疫学检测方法和酶抑制法。传统的免疫学检测技术因其 抗体特异性，不能同时检测多种不同种类的农药，在实际应用中受到限制。而酶抑制法主要 利用了乙酰胆碱酯酶对有机磷或氨基甲酸酯类农药的敏感性，具有简便、灵敏等优势，成为 应用较为普遍的农药残留快速检测技术。乙酰胆碱酯酶能够专一性的被有机磷或氨基甲酸 酯类农药抑制，但游离形式的乙酰胆碱酯酶稳定性差，极易失活，并且其来源有限，纯化过 程复杂，这些都大大地限制了其在生产实践中的应用。因此，本领域需要找到更为有效的获 得和利用乙酰胆碱酯酶的方法，特别是提供乙酰胆碱酯酶稳定性，简化乙酰胆碱酯酶纯化 技术的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基因构建物，所述的基因构建物在被导入适当的细胞 后可在细胞表面表达外源蛋白。 本发明的另一目的在于提供一种细胞，所述的细胞表面展示有外源蛋白。 在本发明的第一方面，提供一种基因构建物，所述基因构建物从5'到3'依次包括
以下操作性相连的元件 (a)葡萄糖淀粉酶信号肽编码序列；
(b)外源蛋白的编码序列；禾口 (c)酵母a凝集素基因C端锚定信号的编码序列。 在另一优选例中，所述的外源蛋白选自(但不限于)受体蛋白、配体蛋白、酶蛋白 或抗体蛋白等。 在另一优选例中，所述的外源蛋白是长度是20-1200aa;较佳的是50-1000aa ;更
3佳的是80-800aa，如约lOOaa， 200aa， 300aa， 500aa， 700aa。
在另一优选例中，所述的构建物中，外源蛋白是乙酰胆碱酯酶。 在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶是不带信号肽和锚定信号的乙酰胆碱酯 酶。 在另一优选例中，所述的葡萄糖淀粉酶信号肽编码序列是SEQ ID NO:l所示序列 中第1-75位的序列；或 所述的乙酰胆碱酯酶编码序列是SEQ ID NO :1所示序列中第76-1824位的序列； 或 所述的酵母a凝集素基因C端锚定信号的编码序列是SEQ ID NO :1所示序列中 第1858-2817位的序列。 在另一优选例中，在元件(b)和元件(c)之间，包括一标签蛋白编码序列。
在另一优选例中，所述的标签蛋白是Flag蛋白。 在另一优选例中，所述的元件(a) 、 (b)和(c)之间包括或不包括连接肽编码序列，
所述的连接肽具有l-15aa ;较佳地具有l-10aa ;更佳地具有1-5aa。 在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶是黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶。 在另一优选例中，所述的基因构建物具有SEQ ID NO :1所示的序列。 在本发明的二方面，提供一种重组的表达载体，所述表达载体含有所述的基因构建物。 在另一优选例中，所述的表达载体的骨架质粒是pYES-DEST52。 在本发明的第三方面，提供一种细胞，所述的细胞是酵母细胞，所述细胞中含有所
述的表达载体；或其基因组中整合有所述的基因构建物。 在另一优选例中，所述的酵母细胞选自酿酒酵母或毕赤酵母。 在另一优选例中，所述的基因构建物中，外源蛋白的编码序列是乙酰胆碱酯酶的 编码序列。 在另一优选例中，所述的酵母细胞是酿酒酵母细胞，其表面上展示表达有乙酰胆 碱酯酶。 在本发明的第四方面，提供一种在细胞表面展示表达外源蛋白的方法，所述方法 包括 (i)将所述的基因构建物导入到酵母细胞中，获得重组细胞；
(ii)培养(i)的重组细胞，从而在细胞表面展示表达外源蛋白。
在另一优选例中，在步骤(i)中，所述的基因构建物中，外源蛋白的编码序列是
乙酰胆碱酯酶的编码序列；从而在步骤(ii)中，在细胞表面展示乙酰胆碱酯酶。 在本发明的第五方面，提供一种检测待测样品中有机磷或氨基甲酸酯类农药的试
剂盒，所述试剂盒中包括 细胞，所述的细胞中带有一基因构建物，所述的基因构建物中外源蛋白的编码序 列是乙酰胆碱酯酶的编码序列；或 固相载体，以及吸附或包埋在固相载体中的细胞，所述的细胞中带有一基因构建
物，所述的基因构建物中外源蛋白的编码序列是乙酰胆碱酯酶的编码序列。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括(但不限于)磷酸胆碱酯酶的底物(如乙酰胆碱或碘化乙酰胆碱)，显色剂(如DTNB)，微量滴定板(如96孔板)，使用说明书。
在本发明的第六方面，提供一种检测待测样品中有机磷或氨基甲酸酯类农药的方 法，所述方法包括 (1)将细胞固定于固相载体或悬浮于与所述细胞相容性的介质中，形成检测体系； 所述的细胞中带有一基因构建物，所述的基因构建物中外源蛋白的编码序列是乙酰胆碱 酯酶的编码序列； (2)在(1)的检测体系中加入待测样品，混合；禾口 (3)检测(2)的体系中乙酰胆碱酯酶的活性，从而确定待测样品中是否含有有机 磷或氨基甲酸酯类农药或其含量。 在另一优选例中，在步骤(3)中，包括向步骤(2)的检测体系中加入乙酰胆碱酯 酶的底物，通过检测乙酰胆碱酯酶对底物的水解情况确定待测样品中是否含有有机磷或氨 基甲酸酯类农药或其含量。 在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶的底物是乙酰胆碱(ATch)，或碘化乙酰胆 碱(AtchI)。 在另一优选例中，在步骤(2)中，还包括设置对照体系，所述的对照体系中不加 入待测样品；步骤(3)中，还包括将检测体系中乙酰胆碱酯酶活性与对照体系中乙酰胆碱 酯酶活性比较；若检测体系中乙酰胆碱酯酶活性显著降低(如降低10%，优选降低20%;更 优选降低40%或更低)；则表明待测样品中含有有机磷或氨基甲酸酯类农药(定性方法)。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
图l.pYES-S-AChE-fag-Aga重组质粒的构建流程和图谱。 图2.载体pYES-S-AchE-f lag-Ag a酶切鉴定，其中 泳道M :DNA Marker,由HindIII、 BamHI和EcoRI消化的入DNA ; 泳道1 :由PvuII和BglII酶消化的pYES-S-AchE-f lag-Ag a 。 图3.乙酰胆碱脂酶酶活力的测定，其中 图3A.空白对照酵母反应体系酶活力测定； 图3B.未诱导的转化子酵母反应体系酶活力测定； 图3C.诱导后的转化子酵母反应体系酶活力测定。
具体实施例方式
本发明人经过深入的研究，首次设计得到一种基因构建物，所述的基因构建物在 导入到细胞中后，可使得重组表达的细胞表面展示表达外源蛋白(如乙酰胆碱酯酶)，且外 源蛋白在细胞表面上的展示表达效果特别优异，可保留良好的蛋白活性。采用本发明的基 因构建物以及表达系统，可方便地实现外源蛋白的固定化，并可简化蛋白纯化的繁琐步骤。
在本发明的优选方式中，在细胞表面展示表达乙酰胆碱酯酶，可直接利用所述表 面展示有乙酰胆碱酯酶的细胞来检测待测样品中有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在与否 或存在量。与采用游离形式的乙酰胆碱酯酶检测相比，展示在细胞表面的乙酰胆碱酯酶性
5质更为稳定，且无需繁琐的纯化过程即可使用，有效地简化了检测步骤，提高了检测准确 性。 如本文所用，所述的"操作性相连"或"可操作地连于"指这样一种状况，即线性DNA 序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控 制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。 如本文所用，所述的"含有"，"具有"或"包括"包括了"包含"、"主要由......构
成"、"基本上由......构成"、和"由......构成"；"主要由......构成"、"基本上
由......构成"和"由......构成"属于"含有"、"具有"或"包括"的下位概念。 构建物 为了能够实现将外源蛋白展示在酵母细胞表面的目的，本发明人曾经尝试了多种 基因构建方法，最后获得了最佳的基因构建物，从而实现外源蛋白的良好展示表达。因此， 本发明提供了一种基因构建物，所述构建物从5'到3'依次包括以下操作性相连的元件 (a)葡萄糖淀粉酶信号肽编码序列；(b)外源蛋白的编码序列；和(c)酵母a凝集素基因C 端锚定信号的编码序列。 所述的构建物编码的融合蛋白中，以葡萄糖淀粉酶信号肽作为外源蛋白的信号 肽。本发明人的研究发现，葡萄糖淀粉酶信号肽具有良好的细胞表面定位效果，可良好地指 导胞质中表达的外源蛋白穿过细胞壁，最终展示在酵母细胞的表面。作为本发明的优选方 式，所述的葡萄糖淀粉酶信号肽编码序列是SEQID N0:l中第l-75位的序列；或其简并的序 列或其变异体，只要所述的变异体编码的蛋白也保留有葡萄糖淀粉酶信号肽的全部或部分 (至少50%以上，优选至少80%以上)活性或功能。 所述的构建物编码的融合蛋白中，以酵母a凝集素基因C端锚定信号作为外源蛋 白的锚定信号。当用于本发明时，酵母a凝集素基因C端锚定信号具有非常优异的蛋白锚 定效果，使得外源蛋白良好地、稳定地锚定在细胞表面，且保持良好的蛋白活性。作为本发 明的优选方式，所述的酵母a凝集素基因C端锚定信号的编码序列是SEQ ID N0:1中第 1858-2817位的序列；或其简并的序列或其变异体，只要所述的变异体编码的蛋白也保留 有酵母a凝集素基因C端锚定信号的全部或部分(至少50%以上，优选至少80%以上) 活性或功能。 如本文所用，所述的"外源蛋白"可以是多种需要展示表达的蛋白，例如，所述的外 源蛋白可以是(但不限于)受体蛋白、配体蛋白、酶蛋白或抗体蛋白等。其它类型的蛋白 也是可用的。 所述的受体类蛋白例如是核受体，如孤儿核受体、类固醇受体等等。将受体类蛋白 或受体类蛋白的配体结合区展示表达在细胞表面，从而获得重组细胞，所述的重组细胞可 应用于药物筛选等领域，例如用于筛选与该受体相匹配的配体。 所述的酶蛋白例如是乙酰胆碱酯酶、蛋白激酶等。将酶蛋白展示表达在细胞表面， 从而获得重组细胞，所述的重组细胞可应用于酶催化反应领域。有利于保持酶蛋白的生物 活性，以及有利于酶的固定化以及酶的回收利用。 本发明的基因构建物的各元件是操作性相连的。所述的各元件之间可以直接相 连，或者也可包括适当的间隔序列，例如具有卜45bp的连接序列；较佳地具有l-30bp的连 接序列；更佳地具有l-15bp的连接序列。所述的连接序列例如是酶切位点，或者是标签蛋白编码序列。 本发明还包括含有所述构建物的重组表达载体，任何适用于酵母细胞表达的表达 载体可用于制备本发明的表达载体，只要其能在酵母细胞内复制和稳定。表达载体的一个 重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。作为本发明的优选方 式，所述的表达载体选自(但不限于):pYSE-DEST52(Invitrogen)， pPIC9K(Invitrogen) 等。将构建物克隆入表达载体以构建重组表达载体的方法也是本领域人员已知的。
含有乙酰胆碱酯酶编码序列的构建物 作为本发明特别优选的方式，所述的外源蛋白是一种酶蛋白。更优选的，所述的酶 蛋白是乙酰胆碱酯酶。 所述的乙酰胆碱酯酶是本领域人员熟知的蛋白，其编码基因也是本领域熟知的。 任何一种乙酰胆碱酯酶蛋白的生物活性片段的编码序列都可以应用到本发明中。在这里， 乙酰胆碱酯酶蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种蛋白片段，其仍然能保持完整的乙 酰胆碱酯酶蛋白的全部或部分功能(如至少80%的活性，更佳的至少90%的活性)。氨基 酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的乙酰胆碱酯酶蛋白及其编 码基因也可应用于本发明中。所述的经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形 成的乙酰胆碱酯酶蛋白也具有乙酰胆碱酯酶蛋白的全部或部分功能。 乙酰胆碱酯酶及其编码基因的来源比较广泛，例如可以分离自蝇、鱼脑、哺乳动物 血液等。作为本发明的一种优选方式，所述的乙酰胆碱酯酶是黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶。所 述的乙酰胆碱酯酶的氨基酸序列可以与GenBank登录号为NM_057605所示的序列基本上相 同。 作为本发明的优选方式，所述的乙酰胆碱酯酶不带有其自身的信号肽和锚定信 号，其编码序列具有SEQ ID N0 :1中第76-1824位的序列。 所述的构建物编码的融合蛋白中，以葡萄糖淀粉酶信号肽代替了乙酰胆碱酯酶自 带的信号肽。本发明人的研究发现，葡萄糖淀粉酶信号肽比乙酰胆碱酯酶自带的信号肽具 有更好的细胞表面定位效果，葡萄糖淀粉酶信号肽可良好地指导胞质中表达的乙酰胆碱酯 酶蛋白穿过细胞壁，最终展示在酵母细胞的表面。作为本发明的优选方式，所述的葡萄糖淀 粉酶信号肽非编码序列是SEQ IDN0 :1中第1-75位的序列。 所述的构建物编码的融合蛋白中，以酵母a凝集素基因C端锚定信号代替了乙 酰胆碱酯酶自带的锚定信号。酵母a凝集素基因C端锚定信号具有更优异的蛋白锚定 效果，使得乙酰胆碱酯酶良好地、稳定地锚定在细胞表面，且保持良好的酶活性。作为本发 明的优选方式，所述的酵母a凝集素基因C端锚定信号的编码序列是SEQ ID N0:1中第 1858-2817位的序列。 作为本发明的优选方式，在乙酰胆碱酯酶与酵母a凝集素基因C端锚定信号之 间，还包括一标签蛋白编码序列，从而在翻译表达后有利于融合蛋白的检测。优选的是一些 氨基酸序列较短的标签蛋白，所述的标签蛋白例如是Flag蛋白，其具有SEQ ID N0:1中第 1825-1848位所示的编码序列。例如，可以采用抗所述标签蛋白的抗体(如anti-Flag)来 检测蛋白的表达情况；或者，可以采用抗所述标签蛋白的抗体来纯化蛋白或展示所述蛋白 的细胞。
细胞
本发明还提供了一种重组的细胞，所述的细胞是酵母细胞，所述细胞中含有所述 的表达载体，或其基因组中整合有所述的基因构建物。优选地，所述的酵母细胞选自酿酒 酵母、毕赤酵母。所述的细胞的表面上可稳定地展示表达外源蛋白，从而可直接用于所述外 源蛋白相关的应用，如用于筛选药物或药物发挥催化作用等等。 本发明所述的在细胞表面展示表达外源蛋白的方法主要包括(i)将本发明的基 因构建物导入到酵母细胞中，获得重组细胞；(ii)培养(i)的重组细胞，从而在细胞表面展 示表达外源蛋白。 作为本发明的优选方式，所述的细胞的表面上可稳定地展示表达乙酰胆碱酯酶， 从而可用于检测待测样品中的有机磷或氨基甲酸酯类农药，同时还可用于乙酰胆碱酯酶相 关的环保、医学、农业、军事等领域。在酶活性水平上，本发明制备的酵母细胞表面展示的乙 酰胆碱酯酶的酶活力检测与市面购买的成品酶粉的参比试验表明，本发明的酵母细胞表面 的乙酰胆碱酯酶活力很高，达到3. 06 ii mol/min mL，完全可达到或超过市面购买的成品酶 粉的酶活力水平。 将基因构建物引入到宿主细胞内的方法是本领域已知的，例如可采用选自以下的 方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。可通过抗性标记 来筛选引入了基因构建物的重组细胞。 获得的重组细胞可以采用常规的酵母细胞培养方法培养，在适于宿主细胞生长的 条件下进行培养。可根据培养的规模适当地调节培养的条件，使之良好地表达蛋白。
所述的重组细胞可以被置于溶液中，制成细胞悬浮液使用。更优选的，所述的重组 细胞可被固定化在固相载体中，从而便于稳定地使用，以及便于细胞的回收和重复利用。可 通过固定细胞，实现外源蛋白(如酶)的固定化，避免了游离蛋白的性质不稳定、极易失活、 不能重复使用的缺点，从而使得相应的外源蛋白可以更好地得到应用。 固定化细胞的方法是本领域已知的技术，例如可以采用选自(但不限于)以下的 技术(l)吸附法(包括物理吸附法，离子结合法等)；(2)包埋法(如海藻酸钠凝胶固定化 细胞法)；(3)共价交联法。对于酵母细胞而言，一种可选的固定方法是包埋法，其是将细胞 均匀地包埋在水不溶性载体的紧密结构中，细胞不会漏出而底物和产物可以进入和渗出。 细胞和载体不起任何结合反应，细胞处于最佳生理状态。因此，酶的稳定性高，活力持久。
细胞固定化常用材料(或称为固相载体)例如可选自(但不限于)(l)多糖类 (纤维素、琼脂、葡聚糖凝胶、藻酸钙、K-角叉胶、DEAE-纤维素等)；(2)蛋白质(骨胶原、明 胶等)；(3)无机载体(氧化铝、活性炭、陶瓷、磁铁、二氧化硅、高岭土、磷酸钙凝胶等)；(4) 合成载体(聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、酚醛树脂等)。 对于酵母细胞而言，优选地可以采用海藻酸钠来实现固定。可将酵母细胞与海藻 酸钠混合，然后将混合液滴入氯化钙溶液中，使藻酸钠转变为水不溶的藻酸钙凝胶，由此将 包埋在其中，这种固定方法是本领域人员已知的。
试剂盒 本发明还提供了一种检测待测样品中有机磷或氨基甲酸酯类农药的试剂盒，所述 试剂盒中包括本发明所述的表面展示表达有乙酰胆碱酯酶的细胞(或细胞培养物)。或 者，所述的试剂盒中含有固相载体，以及吸附或包埋在固相载体中的表面展示表达有乙酰 胆碱酯酶的细胞。
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此外，所述的试剂盒中还可包括用于分析酶活性的试剂，包括磷酸胆碱酯酶的底 物(如乙酰胆碱或碘化乙酰胆碱)，显色剂(如DTNB)，微量滴定板(如96孔板)，以及使用 说明书等。 此外，当需要时，所述的试剂盒中还可包括用于稀释样品的试剂；或用于培养细胞 的培养基。 此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书等，用于指导检测人员正确地使用或 操作。 有机磷或氨基甲酸酯类农药检测方法 所述的有机磷或氨基甲酸酯类农药的检测方法基于以下原理乙酰胆碱酯酶能够 专一性的被有机磷或氨基甲酸酯类农药抑制，且其抑制率与农药的浓度成正比关系。因此 通过检测样品是否使乙酰胆碱酯酶活性发生变化，可快速检测样品中有机磷或氨基甲酸酯 类农药的残留情况。乙酰胆碱酯酶的酶活性可以通过其与底物的反应情况来确定。
因此，本发明提供一种检测待测样品中有机磷或氨基甲酸酯类农药的方法，所述 方法包括(l)将本发明所述的表面展示表达有乙酰胆碱酯酶的细胞固定于固相载体或悬 浮于与所述细胞相容性的介质中，形成检测体系；(2)在(1)的检测体系中加入待测样品， 混合；和(3)检测(2)的体系中乙酰胆碱酯酶的活性，从而确定待测样品中是否含有有机磷 或氨基甲酸酯类农药或其含量。 乙酰胆碱酯酶的酶活性的测定是本领域人员已知的技术。乙酰胆碱酯酶可催化神
经传导代谢产物(如乙酰胆碱)水解，其水解产物可与显色剂(如二硫代二硝基苯甲酸，
DTNB)反应，产生显色物质(DTNB可显示黄色)，用分光光度计测定吸光度随时间的变化值，
计算出抑制率，通过抑制率可以判定出产品中是否存在有机磷或氨基甲酸酯类农药以及存
在量。优选地，可通过设置对照体系来更准确地反映酶活性的变化情况。 所述的"与所述细胞相容性的介质"是指对所述细胞以及细胞表面展示的酶均不
产生影响，且对于有机磷或氨基甲酸酯类农药与乙酰胆碱酯酶的相互作用以及乙酰胆碱酯
酶与其底物的相互作用不产生影响的介质。所述的介质例如可以是适当的反应缓冲液，如
磷酸钠缓冲液。 经过实施例验证，细胞表面展示有乙酰胆碱酯酶的细胞检测体系当应用于农药检 测时，对于许多种有机磷类以及氨基甲酸酯类农药均具有非常灵敏的检测效果，特别是对 于残杀威、速灭威、呋喃丹等农药，半抑制浓度(IC50)最高达到了 0. 00073 iig/mL。
本发明的主要优点在于 (1)本发明找到了可良好地使外源蛋白展示表达在酵母细胞表面的方法，利用酵 母作为外源蛋白的表达宿主；采用本发明的方法和系统，外源蛋白在细胞表面上的展示表 达效果特别优异，可保留良好的蛋白活性，可方便地实现外源蛋白的固定化，并可简化蛋白 纯化的繁琐步骤。 (2)本发明在酵母表面表达乙酰胆碱酯酶，可以使得携带乙酰胆碱酯酶的重组细 胞直接与农药发生相互作用，避免了过往从生物体或分泌液中分离纯化乙酰胆碱酶的复杂 程序，生产工艺大为简便，成本降低。 (3)在酵母表面表达乙酰胆碱酯酶，可通过固定酵母，实现酶的固定化，避免了游 离酶的性质不稳定，极易失活，不能重复使用的缺点，从而可以将其开发为传感器等更加灵敏和自动化的农药残留检测设备。 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New York : Co Id Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。 实施例l.乙酰胆碱脂酶融合蛋白酵母真核表达载体构建 乙酰胆碱脂酶(AChE)基因全长1947bp (参见GenBank登录号NM_057605)，可编码649个氨基酸(参见GenBank登录号NP_476953)，该酶蛋白序列N端含有信号肽序列(l-38aa)，其C端含有GPI锚定信号(620_649aa)。 为了使乙酰胆碱脂酶能够在酵母表面展示，本发明人删除该酶蛋白的锚定信号(622-649aa)，由酵母自身的a凝集素基因(Ag a ) C端锚定信号序列(320aa)代替。同时在AChE基因与a凝集素基因锚定区域之间加入一个Flag抗原表位，以便用于融合蛋白的检测。 此外，为了改善酶蛋白在酵母表面定位的效果，本发明人以葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase)分泌信号肽序列代替了 AChE自身信号肽，并利用pYES-DEST52Gateway系统，构建了 pYES-S-AChE-flag-Aga重组质粒，见图1。
表达载体构建方法具体如下 从果蝇与酿酒酵母的cDNA文库中分别获取AChE
(1-1863bp)
基因以及Aga
(3，端960bp)
(a凝集素，其序列参见GenBank登录号X16861)基因，并克隆到PMD18-T载体(购自Invitrogen公司)中，得到重组质粒T_AChE(1—1863)与T_Ag a (3'端96卿)。 通过常规的PCR技术，以T-AChE(卜1863)为模板，在3'端中引入flag标签碱基序列(编码以下氨基酸序列DYKDDDDK)以及Not I酶切位点，得到产物AChE(卜1863)-f lag片段。同时以T-Aga
(3，端960bp)
为模板，5'端引入Not I酶切位点，得到产物Aga(3，,e。bp)片段。以上述两个产物片段为模板，利用重叠PCR技术，整合为片段AChE(卜腦)-f lag-Ag a (3,端96卿)。并继续以此为模板，将葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase)分泌信号肽碱基序列(其序列见SEQ ID N0:l中第l-75位))引入5'端引物中，以此替换掉AChE基因片段5'端的信号肽碱基序列(l-114bp)，获得S_AChE(115—觀)-flag-Aga (3,端96卿)片段。利用T0P0技术将此片段克隆至载体pENTR/D-TOPO⑧(Invitrogen公司)的attLl/attL2位点中，得到重组质粒pEntr-S_AChE(115—觀)-flag-Aga (3'端96一，利用Gateway 技术将融合基因片段AChE(115—腦)-f lag-Ag a (3'端96一插入到pYSE_DEST52 (Invitrogen公司)表达载体的attL1/
attL2位点中，得到目的质粒pYES-AChE (115-1863) _flag_Ag a (3'端960bp)。 上述所构建的重组载体pYES-S-AChE-f lag-Ag a用PvuII与BglII双酶切鉴定，酶切片段大小为718bp，与实际预期相符，见图2。测序结果显示该酶切片段为实验所需目的片段。 S-AChE(115—1863)_f lag-Ag a (3'端96一的核苷酸序列如SEQ ID NO :l所示，其中第1-75位为葡萄糖淀粉酶分泌信号肽编码序列；第76-1824位为AChE编码序列；第1825-1848位为Flag标签编码序列；第1858-2817位为Ag a的3'端编码序列。
实施例2.乙酰胆碱酯酶诱导表达以及酶活力鉴定
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将重组质粒pYES-S-AChE-f lag-Ag a转化酿酒酵母INVScl (购自Invitrogen公司)，在SC选择平板上筛选转化子。挑取的单克隆在5ml SC培养基中3(TC培养过夜，随后10，000rpm，4t:条件下离心5min收集细胞，用以半乳糖(Gal)为碳源的SC培养基将其稀释为0D6。。值为0. 4的细胞悬液，3(TC诱导4小时，再10， OOOrpm，4"条件下离心5min收获细胞。 细胞重悬在磷酸钠缓冲液(pH7.6)中，使其0De。。值为0.5，随后依次加入底物碘化乙酰胆碱(ATchI)和显色剂DTNB，其终浓度均为lmM。将该反应体系置于37°C ，测其0D412值，以后每隔0. 5min测定一次，连续测定15min。酶活力定义为每mL细胞悬液(0D6。。 = 1)每min水解底物的y mol数，酶活力单位为P mol/mL. min。具体公式如下
酶活力=VXA/(V。XKXLXc) (公式1) 公式中A表示吸光度随时间的变化率(min—0 ;V。表示酶活力测定时所取细胞悬液的体积(mL) ， V。 = 0. 1 ;K表示消光系数[L/ (mmol. mm) ] ， K = 1. 36 ;c表示酵母细胞悬液的吸光值，c = 1 ;L表示测定酶活力时溶液的光径长度，即比色皿光程(mm) ， L = 2 ;V表示反应体系的总体积(mL) ， V = 0. 2。 将未转质粒的空白酵母，未经Gal诱导的转化子酵母悬液作为对照，测定诱导后转化子酵母悬液的乙酰胆碱酯酶活力。与对照相比(图3A，图3B)，诱导后的转化子酵母可检测到明显的酶活性(图3C)，根据公式l计算其酶活力为3.06iimol/mL.min。上述结果也证明了乙酰胆碱酯酶展示在酵母细胞表面，而非细胞内表达或分泌表达。
实施例3.有机磷农药半抑制浓度(IC5。)测定 酵母细胞诱导表达AChE后离心收集，再重悬于磷酸钠缓冲液(pH7.6)中，随后接种于96孔板中，使其0D6。。值为0. 5，加入终浓度分别为0、 10-4、 10-3、 10-2、 10-1和1 y g/mL的有机磷农药，3(TC下孵育30min，然后加入终浓度均为lmM的底物ATChI与显色剂DTNB，反应总体积为200 ii L， 37t:下反应15min，反应过程中每间隔0. 5min检测0D412值。使用常规的直线内插法分别计算出农药对AChE的ICs。值。 从表1结果可知，12种有机磷农药对AChE的敏感性都十分显著，其中敏感性最好的是速灭威，其IC5。值为0. 00073 i！ g/mL，即便是敏感性差的久效磷，其IC5。值也达到了0. 046 ii g/mL。这说明固定化后乙酰胆碱酯酶敏感性仍然较高，具有很好的应用价值。
表1有机磷农药对AChE的半抑制浓度IC5。
农药名称IC50(Mg/mL)
甲基啼啶磷0.0137
久效磷0.046
残杀威0.002
速灭威0.00073
对氧磷0.001267
抗蚜威0.00246
呋喃丹0.00175
叶蝉散0.015
西维因0.025
氧化乐果0.029
甲拌磷0扁76
马拉硫磷0.013 实施例4.酵母细胞的固定 称取1.6g海藻酸钠于无菌的小烧杯中，加无菌去离子水少许，调成糊状，再加入其余的水(总量为40ml)。火上加温至熔化，冷却至3(TC左右，加入10ml上述制备的表面展示有乙酰胆碱酯酶的酵母培养液，混合均匀，倒入下边装有胶管与止血夹的漏斗中，通过1. 5 3. 0mm的小孔，以恒定的速度滴到盛有10% CaCl2溶液的平皿中制成凝胶珠。凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min以便形成稳定的结构，之后将凝胶珠转入300ml锥形瓶中，用无菌去离子水洗涤3次后加入200ml SC培养基。
实施例5.检测试剂盒 —种检测待测样品中有机磷存在与否的试剂盒，该试剂盒中含有 容器1，以及装于该容器中的实施例4制备的固定有所述表面展示乙酰胆碱酯酶
的酵母细胞的凝胶珠，其存在于SC培养基中； 容器2，以及装于该容器中的碘化乙酰胆碱(ATchI); 容器3，以及装于该容器中的显色剂DTNB ; 以及，说明检测方法的使用说明书。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 序列表 〈110〉中国科学院上海生命科学研究院 〈120〉 一种在细胞表面展示外源蛋白的方法及产品 〈130>087048
〈160>1 〈170>PatentIn version 3.3 〈210>1 〈211>2817 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈221>misc_feature 〈223>融合基因 〈400>1atgcaactgttcaatttgcctcattctttctcgtcctctcttecttttct60ttgctcgtttctgctetcgatcgcctggtccctccggacctgtecgcggt120cgctccgtgacggtgc郷gc郷g郷tgcatgtctecacgggcatcccctecgccaag180ccgcccgtcgaggacctgcgcttccgaaagccggttcccgcggagccatggcacggcgtc240ctcgacgccacgcggttetccgccacctgcgtcc皿gagcgttecgagtecttccccggc300ttctccggcg郷卿tctgg皿cccc皿caccaacgtgtccgaggactgcctctecate360朋tgtctgggcgccggca朋ggcccgacttcgccatgggcggggtgc咖cgggggtgag420caccccaatggC3朋C3ggCggacactgaccatctcatcctccgcagaac■3Cg3CC朋Cggactgccgattctgatctggatctetggcggtggcttcatgaccggatcg540gccaccctggtgcggatetcatgaccgccgtggg咖tgt皿tegtggcc600tccttccagtatcgggtgggagcttttgggttcttgcacctggcgccggaaatgccgtcg660g朋ttcgcgg皿gaggcgcccgg咖tgtgggcctetgggatcaggcactcgccattcgc720tggctgaaggacaacgctcatgccttcggcgga皿tccggactgttcgga780gagtcggctggatccagttcggtg皿tgcccagctcatgtcgccggtgacg郷ggtctg840gtcaagcgcgg^tgatgcagtcgggcactatgaacgccccctggagccacatgacctcc■g卿郷ccgtgg卿tcggc皿ggcgctgatcaacgactgc皿ctgc皿tgcatctetg960Ctg朋g3CC3atcccgctcacgtgatgagctgcatgcgttccgtggacgcc^gaccate1020tcggtgcagcagtgg朋ctcctectcgggcatcctcagctttccctcggcgcccaccatt1080gatggtgcgttcctgccggcggatcccatgacgctgatga卿cggcggatctg皿ggac1140tecgacatcctgatggg腿acttcttgctgtecgatttc1200atcgattacttcgat朋ggacgatgccacggccctgccacgggaca^tecctggaaatt1260atgaacaatatttttggcaaggc皿cgc皿gcgg雄gcgaggccatcattttccagtet1320accagttggg朋ggc朋tcctggctetcag皿CC3gC3gCa^tcggacgcgccgtgggc1380gatcacttcttcacctgcccC3CC皿Cg3gtetgcccaggctctggcggagcgaggcgct1440tccgtgcactactectactttacacaccgcacaagcacctcattgtggggcg皿tggatg1500ggcgtgctgcgatcg朋tecttctttggccagccgctg皿caactccctg1560cagtetcgacctgtggagcgtgagctgggc皿gcgtetgctcagtgcggtcattgagttt1620gcteagacgggaaatcccgctc郷atggcg郷賜tggcccaacttctcc皿ggaggat1680cccgtctactatettttcagcaccgacgat^gatcgaga皿ttggccaggggtcctttg1740
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一种基因构建物，其特征在于，所述基因构建物从5’到3’依次包括以下操作性相连的元件(a)葡萄糖淀粉酶信号肽编码序列；(b)外源蛋白的编码序列；和(c)酵母α凝集素基因C端锚定信号的编码序列。
2. 如权利要求l所述的基因构建物，其特征在于，所述的外源蛋白选自受体蛋白、配体蛋白、酶蛋白或抗体蛋白。
3. 如权利要求2所述的基因构建物，其特征在于，所述的外源蛋白是乙酰胆碱酯酶。
4. 如权利要求3所述的基因构建物，其特征在于，所述的葡萄糖淀粉酶信号肽编码序列是SEQ ID N0:l所示序列中第l-75位的序列；或所述的乙酰胆碱酯酶编码序列是SEQ ID NO :l所示序列中第76-1824位的序列；或所述的酵母a凝集素基因C端锚定信号的编码序列是SEQ ID NO:l所示序列中第1858-2817位的序列。
5. 如权利要求3所述的基因构建物，其特征在于，在元件(b)和元件(c)之间，包括一标签蛋白编码序列。
6. —种重组的表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求l-5任一所述的基因构建物。
7. —种细胞，其特征在于，所述的细胞是酵母细胞，所述细胞中含有权利要求6所述的表达载体；或其基因组中整合有权利要求1-5任一所述的基因构建物。
8. 如权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述的酵母细胞选自酿酒酵母或毕赤酵母。
9. 如权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述的基因构建物中，所述的外源蛋白的编码序列是乙酰胆碱酯酶的编码序列。
10. —种在细胞表面展示表达外源蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括(i) 将权利要求l-5任一所述的基因构建物导入到酵母细胞中，获得重组细胞；(ii) 培养(i)的重组细胞，从而在细胞表面展示表达外源蛋白。
11. 一种检测待测样品中有机磷或氨基甲酸酯类农药的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求9所述的细胞；或固相载体，以及吸附或包埋在固相载体中的权利要求9所述的细胞。
12. —种检测待测样品中有机磷或氨基甲酸酯类农药的方法，其特征在于，所述方法包括(1) 将权利要求9所述的细胞固定于固相载体或悬浮于与所述细胞相容性的介质中，形成检测体系；(2) 在(1)的检测体系中加入待测样品，混合；禾口(3) 检测(2)的体系中乙酰胆碱酯酶的活性，从而确定待测样品中是否含有有机磷或氨基甲酸酯类农药或其含量。
13. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，包括向步骤(2)的检测体系中加入乙酰胆碱酯酶的底物，通过检测乙酰胆碱酯酶对底物的水解情况确定待测样品中是否含有有机磷或氨基甲酸酯类农药或其含量。
全文摘要
本发明涉及一种在酵母细胞表面展示外源蛋白的方法及产品。本发明公开了一种基因构建物，所述的基因构建物在导入到细胞中后，可使得重组表达的外源蛋白在细胞表面展示。采用本发明的基因构建物以及表达系统，外源蛋白在细胞表面上的展示表达效果特别优异，可保留良好的蛋白活性，方便地实现外源蛋白的固定化，并可简化蛋白纯化的繁琐步骤。
文档编号C12Q1/44GK101724649SQ20081020189
公开日2010年6月9日 申请日期2008年10月29日 优先权日2008年10月29日
发明者专芳芳, 吴松洁, 王慧, 许诵辞 申请人:中国科学院上海生命科学研究院