一种使胞内蛋白表达至胞外的放线菌信号肽及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种使胞内蛋白表达至胞外的放线菌信号肽，其命名为Kp?SP，来源于库克氏菌(Kocuria sp.3?3)菌株，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。本发明还公开了该信号肽在利用构建的重组大肠杆菌表达淀粉酶或纤维素酶中的应用，本发明的信号肽不仅在常用的表达载体中具有将外源蛋白分泌到胞外的能力，使蛋白表达量增高，酶活明显提高，并切在组成型表达载体pBSPPc中也具有外源蛋白分泌到胞外的能力，为生产高活性分泌蛋白提供了一条有效途径。作为一种基础的基因工程技术，本发明为生产工业蛋白提供了有利的条件，增强了蛋白的表达量及酶活，降低了分离成本，在蛋白质工业生产方面具有很大的应用前景。
【专利说明】
-种使胞内蛋白表达至胞外的放线菌信号化及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及基因工程技术领域，具体设及一种使胞内蛋白表达至胞外的信号肤及 其在利用构建的重组大肠杆菌表达淀粉酶、及纤维素酶中的应用。
【背景技术】
[0002] 基因表达是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译， 转变成具有生物活性的蛋白质分子;基因工程技术中的外源蛋白的表达是指将获得的外源 基因片段通过载体重组到一个新的基因表达宿主中，使其能大量生产具有生物活性的蛋白 产物，是当今分子生物学领域应用最广泛的技术手段之一。随着生物工业生产工艺的发展， 人们对高纯度、高产量和高稳定性的重组功能蛋白的需求日益增长，运使得外源蛋白表达 技术成为基因工程、生物生产和应用的重要内容。
[0003] 信号肤是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短(长度5-30个氨基酸)肤链;常 指新合成多肤链中用于指导蛋白质的跨膜转移(定位)的N-末端的氨基酸序列(有时不一定 在N端）。在起始密码子后，有一段编码疏水性氨基酸序列的RNA区域，该氨基酸序列就被称 为信号肤序列，它负责把蛋白质引导到细胞含不同膜结构的亚细胞器内。外源蛋白在宿主 菌，如大肠杆菌中的表达形式多为细胞内不溶性表达(包涵体），少数为细胞外分泌表达。利 用信号肤来引导外源蛋白定位分泌到细胞特定区间，提高可溶性，可避免因包涵体复性带 来的困难。研究表明，多种外源基因连接上信号肤后，在原核表达系统，如大肠杆菌、L型细 菌、芽抱杆菌和乳酸杆菌中等都得到了分泌表达;信号肤也广泛应用于真核表达系统如毕 赤酵母和昆虫杆状病毒表达系统中。
[0004] 目前大肠杆菌中异源表达所用信号肤一般为来源于大肠杆菌自身或者芽抱杆菌， 但大多在高效分泌表达中存在通用性不强的缺陷，导致选择前需要开展大量的信号肤筛选 工作。本专利设及的信号肤来自于放线菌，根据检索，目前利用放线菌库克氏菌来源的信号 肤进行大肠杆菌重组分泌表达未见报道。
【发明内容】
[0005] 针对当前研究现状，本发明要解决的问题是提供一种使胞内蛋白表达至胞外的放 线菌信号肤及其应用。
[0006] 本发明所述的使胞内蛋白表达至胞外的放线菌信号肤，其特征是:所述信号肤命 名为Kp-SP,来源于库克氏菌化ocuria SP.3-3)菌株，其核巧酸序列长度为90bp，如SEQ ID No. 1所示;氨基酸序列长度为29aa，如SEQ ID No.7所示。
[0007] 本发明所述使胞内蛋白表达至胞外的放线菌信号肤在利用构建的重组大肠杆菌 表达淀粉酶或纤维素酶中的应用。
[000引其中：上述淀粉酶是淀粉酶KC441955.1，命名为FSA，来源于Sinomicrobium Pectinilyticus加 NSOOl，长度1359bp，其核巧酸序列如沈Q ID No.2所示，氨基酸序列长 度为452aa，如SEQ ID No.8所示；或是淀粉酶AAU39594，命名为化A，来源于Bacillus Iicheniformis DSM13,长度1455bp，其核巧酸序列如SEQ ID No.3所示，氨基酸序列长度为 484aa，如SEQ ID No.9所示；上述纤维素酶0RF3883,命名为CCC，来源于Clostridium cellulosi CS-4-4(Zhang et al.Synergism of Glycoside Hydrolase secretomes from two Thermophilic bacteria cocultivated on Iignocellulose.Appl Environ Microbiol (2014)80:2592-2601.)，长度2100bp，其核巧酸序列如沈Q ID No. 4所示，氨基酸 序列长度为699aa，如SEQ ID No. 10所示。
[0009] 上述使胞内蛋白表达至胞外的信号肤在利用构建的重组大肠杆菌表达淀粉酶或 纤维素酶中的应用中，所述重组大肠杆菌的构建方法是：
[0010] (1)根据NCBI数据库所提供KC441955.1、AAU39594、0RF3883所述的核巧酸序列设 计引物；
[00川其中，淀粉酶KC44 1955. 1与信号肤Kp-SP重组所用引物为：SFSA-Fl : GAGGATCCGATGAGCAGACGAGC，SFSA-Rl:GCGAGCGCCGATGACAATAATAATTATAC;SFSA-F2: GTATAATTATTATTGTCATCGGCGCTCGC，SFSA-R2: GACGTCGACTTACTCTCCCGAAACCGACCATATG，通过 S步PC时尋信号肤Kp-SP序列与KC441955.1序列连接，所得重组基因片段命名为SFSA;
[001^ 淀粉酶AAU39594与信号肤Kp-SP重组所用引物为：SBLA-F1: GAGGATCCGATGAGCAGACGAGC,SBLA-Rl：CTTTAAGATTTGCCGCGGCGCTCG,SBLA-F2： GCGAGCGCCGCGGCAAATCTTAAAG，SBLA-R2: CCCAAGCTTGGGCTATCTTTGAACATAAATTG，通过 S 步 PC时尋信号肤Kp-SP序列与AAU39594序列连接，所得重组基因片段命名为SBLA;
[001引纤维素酶0RF3883与信号肤Kp-SP重组所用引物为：SCCC-F1: GAGGATCCGATGAGCAGACGAGC，SCCC-Rl:CTGGGCCGCTTACGGCGCTCGC，SCCC-F2: GCGAGCGCCGTAAGCGGCCCAG，SCCC-R2: GACGTCGACTTACTGCGGTTCAACGCCCCATATC，通过 S 步 PCR 将信号肤Kp-SP序列与0RF3883序列连接，所得重组基因片段命名为SCCC;
[0014] 其中：所述KC441955.1的核巧酸序列如沈Q ID齡.2所示，441139594的核巧酸序列 如沈Q ID No.3所示，0RF3883的核巧酸序列如沈Q ID No.4所示；
[0015] 对照组为一步PCR获得的不加信号肤Kp-SP的KC441955.1或AAU39594或0RF3883所 示的基因片段；
[0016] (2)将（1)中得到的S组重组基因片段和对照组基因片段分别与载体pET-Duet或 pBSP 化连接，构建获得重组质粒 SFSA-pET-Duet、SFSA-pBSPPc 或 SBLA-pET-Duet、SBLA- pBSP化或SCCC-pET-Duet、SCCC-pBSPPc，将所述重组质粒分别转入感受态大肠杆菌化21 (DE3)中，获得的重组菌株通过PCR和琼脂糖凝胶电泳验证确认;对照组为FSA-pET-Duet、 FSA-pBSPPc 或 BLA-pET-Duet、BLA-pBSPPc 或 CCC-祀 T-Duet、CCC-地 SP 化重组质粒转入感受 态大肠杆菌化21 (DE3)中，通过PCR和琼脂糖凝胶电泳验证；
[0017] (3)将(2)中得到的W祀T-Duet为载体的重组菌株按照体积比2%的接种量分另臘 于LB摇管中，培养8-化，再W体积比1 %的接种量转接于100mL LB摇瓶中，37°C摇床培养，待 ODsoonm= 0.4-0.6时，按体积比加入1%。的口PG，其中，产淀粉酶FSA及SFSA的重组菌株放入20 °C摇床过夜培养，产淀粉酶化A及SBLA的重组菌株于37°C继续培养4h，产纤维素酶CCC及 SCCC的重组菌株于37°C继续培养4h，所获菌液离屯、保留上清，即得到含有淀粉酶或纤维素 酶的发酵液；
[001引同样，将(2)中得到的W地SP化为载体的重组菌株按照体积比2%的接种量分别接 于LB摇管中，培养8-化，再W体积比1%的接种量转接于100mL LB摇瓶中，其中，产淀粉酶 FSA及SFSA的重组菌株直接20°C过夜培养，产淀粉酶BLA及SBLA的重组菌株直接37°C过夜培 养，产纤维素酶CCC及SCCC的重组菌株直接37°C过夜培养，所获菌液离屯、保留上清，即得到 含有淀粉酶或纤维素酶的发酵液。
[0019] 本发明公开了一种使胞内蛋白表达至胞外的放线菌信号肤及其应用。通过利用来 源于放线菌的一种高通用性信号肤构建了带有信号肤的淀粉酶和纤维素酶，通过信号肤分 别与诱导型表达载体祀T-Duet及组成型表达载体地SP化融合，获得了高效的大肠杆菌诱导 型及组成型分泌表达系统。结果表明该信号肤的使用不仅显著提高了胞外培养基中的目的 蛋白量及酶活，还提高了胞内目的蛋白的酶活性，沉淀中包涵体明显减少。有效解决了异源 蛋白的包涵体形成、不溶性表达等问题。分别利用=个水解酶进行表达验证，其中一个为稀 有密码子含量高的古菌淀粉酶同源蛋白，结果表明该信号肤具有在大肠杆菌中表达的通用 性。因此本发明可显著提高大肠杆菌重组蛋白的活性表达量，具有重要的应用价值。
【附图说明】
[0020] 图1:克隆表达载体构建图。
[0021] 图2:重组菌株透明圈实验
[0022] 其中：BLA表示DSM13淀粉酶，FSA表示抓NSOOl淀粉酶，CCC表示纤维素酶。
[0023] 图3:重组菌株的淀粉酶及纤维素酶酶活
[0024] 其中：图中A，B，C分别表示DSM13淀粉酶各转化子酶活，5DNS001淀粉酶各转化子酶 活，纤维素酶各转化子酶活。
[0025] 图4:重组菌株样品SDS-PAGE
[0026] 其中：1-8泳道依次为W祀T-Duet为载体不带有信号肤转化子的胞外样品，W祀T- Duet为载体不带有信号肤转化子的胞内样品，W祀T-Duet为载体带有信号肤转化子的胞外 样品，WpET-Duet为载体带有信号肤转化子的胞内样品，WpBSP化为载体不带有信号肤转 化子的胞外样品，WpBSP化为载体不带有信号肤转化子的胞内样品，WpBSP化为载体带有 信号肤转化子的胞外样品，W地SP化为载体带有信号肤转化子的胞内样品。
【具体实施方式】
[0027] 酶活测定方法:实验酶类水解底物产生还原糖，DNS(称3,5-二硝基水杨酸3.15g， 加水0.化，45 °C水浴，溶解后加入10.48g氨氧化钢，揽拌至完全溶解后依次加入酒石酸钟钢 91g、苯酪2.5g、无水亚硫酸钢2.5g;定容至1L，储存于栋色瓶中避光保存7天后使用）。可与 还原糖结合产生显色反应。
[0028] 实施例1:化学法重组菌株的构建
[0029] 感受态的制备:化学法(化Cb)法
[0030] 1%接种量接化21过夜培养物到50ml LB中；每隔15-20min测一次0D600皿，待长至 0.3-0.4时收集菌体;将培养物放置于冰上IOmin，再倒入50ml离屯、管中，4°C，450化pm，离屯、 10min(50ml离屯、管也需预冷，提前将离屯、机调至4°C);弃上清，50ml初始培养液用30ml预冷 的0.1 M MgCl2-CaCl2溶液重悬细胞沉淀;4°C，4500rpm，离屯、IOmin;弃上清，50ml初始培养液 用2ml预冷的0.1 M CaCb溶液（15%甘油)重悬细胞沉淀;5化1/管或IOOiil/管分装，于-70°C 保藏。
[0031] 连接体系:载体化1，目的片段5.扣1，T4DNA连接酶0.扣1，T4DNA连接酶Buffer化I; 连接条件：25 °C化；将连接液加入到感受态细胞化21中，冰上30min，37 °C水浴5min，冰上 Smin;加入5(K)山LB培养基，37°C摇床培养化后涂板化B固体，加入Amp),将平板放入37°C培 养箱过夜培养;挑单菌落提质粒测序验证，正确的菌株保藏备用。
[0032] 实施例2 :FSA及SFSA重组菌株的构建
[0033] FSA淀粉酶基因全长1359bp。根据信号肤序列设计引物，将信号肤序列与 KC441955.1所示的基因序列进行重组，获得融合基因片段SFSA。其中：1轮PCR分别扩增上下 两个片段，引 物为 SFSA-F1:GAGGATCCGATGAGCAGACGAGC，SFSA-R1: GCGAGCGCCGATGACAATAATAATTATAC;SFSA-F2:GTATAATTATTATTGTCATCGGCGCTCGC，SFSA-R2: GACGTCGACTTACTCTCCCGAAACCGACCATATG。两组PCR产物分别进行切胶回收，回收产物测定浓 度，加水将上下游同源臂浓度调至基本相同；2轮PCRWl轮PCR产物为引物和模板，将两段扩 增产物连接来，回收PCR产物;3轮PCR W 2轮PCR为模板，引物为SFSA-Fl，SFSA-R2。
[0034] 对照组为不加信号肤的FSA，利用1步PCR获得片段F SA，引物为F SA-F : GGCGAGCTCGGATGACAATAATAATTATAC，FSA-R: GACGTCGACTTACTCTCCCGAAACCGACCATATG，产物 进行切胶回收。
[0035] 与祀T-Duet连接:将所获回收片段FSA和SFSA按照如图1所示的构建方法，用BamH I和Sal I进行双酶切目的片段，载体祀T-Duetl同样用BamH I和Sal I进行双酶，目的片段 和载体经酶切纯化后加入T4连接酶25°C放置化，连接产物化学法转入到感受态化2UDE3) 中，冰上放置30min，37°C水浴5min，冰上5min后加入50化1 LB液体，37°C复苏培养化后涂含 氨节青霉素（lOOmg/L)的LB平板，37 °C过夜培养，挑单菌落于LB+氨节青霉素（lOOmg/L)摇 管，提质粒测序验证构建的重组质粒，测序由深圳华大基因完成。
[0036] 与pBSP化连接:将所获回收片段FSA和SFSA按照如图1所示的构建方法，用BamH I 和Sal I进行双酶切目的片段，载体pBSP化同样用BamH I和Sal I进行双酶，目的片段和载 体经酶切纯化后加入T4连接酶25°C放置化，连接产物化学法转入到感受态化2UDE3)中，冰 上放置30min，37°C水浴5min，冰上5min后加入50化1 LB液体，37°C复苏培养化后涂含硫酸 庆大霉素(50mg/L)的LB平板，37 °C过夜培养，挑单菌落于LB+硫酸庆大霉素(50mg/L)摇管， 提质粒测序验证构建的重组质粒，测序由深圳华大基因完成。
[0037] 实施例3 :BLA及SBLA重组菌株的构建
[0038] BLA淀粉酶基因全长1455bp。根据信号肤序列设计引物，将信号肤序列与AAU39594 所示的基因序列进行重组，获得融合基因片段SBLA，其中，1轮PCR分别扩增上下两个片段， F2: GCGAGCGCCGCGGCAAATCTTAAAG，SBLA-R2: CCCAAGCTTGGGCTATCTTTGAACATAAATTG。两组 PCR 产物分别进行切胶回收，回收产物测定浓度，加水将上下游同源臂浓度调至基本相同；2轮 PCR W1轮PCR产物为引物和模板，将两段扩增产物连接来，回收PCR产物;3轮PCR W2轮PCR为 模板，引物为SBLA-Fl，SBLA-R2。
[0039] 对照组为不加信号肤的B L A，利用1步P C R获得片段F S A，引物B L A - F : GAGGATCCGATGGCGGCAAATCTTAAAGGGACG，BLA-R: CCCAAGCTTGGGCTATCTTTGAACATAAATTG，产物 进行切胶回收。
[0040]与祀T-Duet连接:将所获回收片段BLA和SBLA按照如图I所示的构建方法，用BamH I和化nd III进行双酶切目的片段，载体祀T-Duetl同样用BamH I和化nd III进行双酶，目 的片段和载体经酶切纯化后加入T4连接酶25°C放置化，连接产物化学法转入到感受态化21 (DE3)中，冰上放置30min，37°C水浴5min，冰上5min后加入50化1 LB液体，37°C复苏培养化 后涂含氨节青霉素（lOOmg/L)的LB平板，37°C过夜培养，挑单菌落于LB+氨节青霉素（lOOmg/ U摇管，提质粒测序验证构建的重组质粒，测序由深圳华大基因完成。
[0041 ]与pBSP化连接:将所获回收片段BLA和SBLA按照如图1所示的构建方法，用BamH I 和化nd III进行双酶切目的片段，载体pBSP化同样用BamH I和化nd III进行双酶，目的片 段和载体经酶切纯化后加入T4连接酶25°C放置Ih,连接产物化学法转入到感受态化21 (DE3)中，冰上放置30min，37°C水浴5min，冰上5min后加入50化1 LB液体，37°C复苏培养化 后涂含硫酸庆大霉素（50mg/L)的LB平板，37°C过夜培养，挑单菌落于LB+硫酸庆大霉素 (50mg/L)摇管，提质粒测序验证构建的重组质粒，测序由深圳华大基因完成。
[0042] 实施例4: CCC及SCCC重组菌株的构建
[0043] CCC纤维素酶基因全长2100bp。根据信号肤序列设计引物，将信号肤序列与 0RF3883所示的基因序列进行重组，获得融合基因片段SCCC，其中，1轮PCR分别扩增上下两 个片段，引物为SCCC-Fl: GAGGATCCGATGAGCAGACGAGC，SCCC-Rl: CTGGGCCGCTTACGGCGCTCGC， SCCC-F2:GCGAGCGCCGTAAGCGGCCCAG，SCCC-R2:GACGTCGACTTACTGCGGTTCAACGCCCCATATC，两 组PCR产物分别进行切胶回收，回收产物测定浓度，加水将上下游同源臂浓度调至基本相 同；2轮PCR W1轮PCR产物为引物和模板，将两段扩增产物连接来，回收PCR产物;3轮PCR W 2 轮PCR为模板，引物为SCCC-Fl，SCCC-R2。
[0044] 对照组为不加信号肤的CCC，利用1步PCR(引物CCC-F: GAGGATCCGGTAAGCGGCCCAGG， CCC-R: GACGTCGACTTACTGCGGTTCAACGCCCCATATC)获得片段 CCC，产物进行切胶回收。
[0045] 与祀T-Duet连接:将所获回收片段CCC和SCCC按照如图1所示的构建方法，用BamH I和Sal I进行双酶切目的片段，载体祀T-Duetl同样用BamH I和Sal I进行双酶，目的片段 和载体经酶切纯化后加入T4连接酶25°C放置化，连接产物化学法转入到感受态化2UDE3) 中，冰上放置30min，37°C水浴5min，冰上5min后加入50化1 LB液体，37°C复苏培养化后涂含 氨节青霉素（lOOmg/L)的LB平板，37 °C过夜培养，挑单菌落于LB+氨节青霉素（lOOmg/L)摇 管，提质粒测序验证构建的重组质粒，测序由深圳华大基因完成。
[0046] 与pBSP化连接:将所获回收片段CCC和SCCC按照如图1所示的构建方法，用BamH I 和Sal I进行双酶切目的片段，载体pBSP化同样用BamH I和Sal I进行双酶，目的片段和载 体经酶切纯化后加入T4连接酶25°C放置化，连接产物化学法转入到感受态化2UDE3)中，冰 上放置30min，37°C水浴5min，冰上5min后加入50化1 LB液体，37°C复苏培养化后涂含硫酸 庆大霉素(50mg/L)的LB平板，37 °C过夜培养，挑单菌落于LB+硫酸庆大霉素(50mg/L)摇管， 提质粒测序验证构建的重组质粒，测序由深圳华大基因完成。
[0047] 实施例5:透明圈实验
[004引淀粉酶重组菌株WpET-Duet为载体的点在LB+lg/L淀粉平板，WpBSP化为载体的 点在BSM+lg/L淀粉平板;纤维素酶重组菌株W祀T-Duet为载体的点在LB+lg/LCMC平板，W 地SP化为载体的点在BSM+lg/LCMC平板，37 °C培养两天。淀粉平板用卢戈式舰液染色，CMC平 板用刚果红染色，结果如图2所示:带有信号肤的转化子产生的透明圈明显高于未带有信号 肤的转化子，酶活明显增高。
[0049] 实施例6:重组菌株的表达
[(K)加]2 %接种量接重组菌株于LB摇管，培养8-化，转接LB摇瓶，1 %接种量，37 °C摇床培 养，待长到0D600nm=0.4-0.6时，加入1%。的ITPG放入20°C (淀粉酶FSA及SFSA W地SP化为载 体的直接20°C过夜培养，无需IPTG诱导过程;淀粉酶BLA及SBLAW祀T-Duet为载体的37°C诱 导地，淀粉酶BLA及SBLAWpBSP化为载体的直接37 °C过夜培养，无需IPTG诱导过程;纤维素 酶CCC及SCCCWpET-Duet为载体的37°C诱导地，纤维素 WpBSP化为载体的直接37°C过夜培 养，无需IPTG诱导过程)摇床过夜培养。
[0051] 1)收集菌体
[0化2] 600化mp，4。(：，离屯、IOmin，保留上清，将上清液置于冰上保存，用Buffer PBS重悬 菌体沉淀，GOOOrmp,4°C，离屯、IOmin;重复两遍。
[0化3] 2)破壁
[0054] 用Buffer (10 %甘油+ 90 % PBS)将菌体重悬，加入1%。的PMSF后破壁。破壁后 ISOOOrmp,4°C，离屯、20min [005引 3)浓缩
[0056] 将胞外液用浓缩管浓缩，浓缩至90化1左右即可。
[0057] 4)LB培养基：Yeast Powder 5g/L，Tryptone 10g/L，NaCl lOg/L
[0化引 BSM 培养基：K 出 P04 2.4g,化 2册04 ? 12 此 0 14.0g，NH4Cl 2.0g，10%MgCl2 ?細 20 2.0ml,1%化Cl2 100.0山，1%化〔13 100.化1,Solution A 5.Oml,Glycerin 4.Og,Vitamin solution 200.Oul，加水至IL。
[0化9]溶液A:0.5g FeCl2,0.5g aiCl2,0.5g MnCl2,0.1g Na2Mo〇4 ? 2出0,0.05g Na3W〇3 ? 2H2〇，120mM 肥I and 0.05g CuCl2,加水至IL。
[0060]维生素溶液：calcium pantothenate 400.Omg,creatine 200.Omg,nicotinic acid 400.Omg,PABA 200.Omg,Vitamin B6 400.Omg and Vitamin B12 0.5mg，加水至IL。 [0061 ] 实施例7:重组蛋白SDS-PAGE
[0062] 重组蛋白样品W相同蛋白量跑11.25%含0.1% (w/v)SDS的聚丙締酷氨凝胶电泳， 120V，SOmin，跑完后用考马斯亮蓝R-250染色。SDS-Page结果如图4所示:带有信号肤的转化 子W祀T-Duet为载体的样品其胞外蛋白的表达量明显增高，WpBSP化为载体的转化子BLA 和CCC的胞外样品表达量明显增高，说明了信号肤Kp-SP应用的广泛性，并且Kp-SP的成功应 用减少了蛋白的不溶性表达。
[0063] 实施例8:酶活的测定
[0064] FSA及SFSA酶活测定方法:在50°C下，测定粗酶液在18化1 Buffer PBS(憐酸 氨二钢19.1008g/L，憐酸二氨钟1.8516g/L)和20化1 5g/L淀粉溶液中反应15min，加入40化 1 DNS于100°C反应10min，在540皿下测吸光值变化。酶活定义:在50°C、pH 7.3(PBS缓冲液） 条件下，Imin转化可溶性淀粉生成1皿Ol还原糖所需要的酶量，即为1个酶活力单位，WU表 /J、- O
[00化]BLA及SBLA酶活测定方法:在7(TC下，测定粗酶液在18化1 Buffer PBS(憐酸 氨二钢19.1008g/L，憐酸二氨钟1.8516g/L)和20化1 5g/L淀粉溶液中反应15min，加入 400iil DNS于100°C反应lOmin，在540nm下测吸光值变化。酶活定义:在70°C、pH 7.3(PBS缓 冲液)条件下，lmin转化可溶性淀粉生成Iwiiol还原糖所需要的酶量，即为I个酶活力单位， Wu表示。
[0066] CCC及SCCC酶活测定方法:在60°C下，测定粗酶液在18化1 Buffer PBS(憐酸 氨二钢19.1008g/L，憐酸二氨钟1.8516g/L)和200]il 5g/L簇甲基纤维素钢中反应15min，加 入40化1 DNS于100 °C反应10min，在540nm下测吸光值变化。酶活定义：在60 °C、pH 7.3 (PBS 缓冲液)条件下，Imin转化簇甲基纤维素钢生成I曲iol还原糖所需要的酶量，即为I个酶活力 单位，WU表示。
[0067] 按照上述方法测量各转化子蛋白酶活，结果如图3所示:带有信号肤的转化子其胞 外酶活明显提高，且酶活总量也有所提高，对胞内外蛋白的表达均有促进作用。信号肤Kp- SP解决了蛋白的不溶性表达等问题，使蛋白的分离纯化更加简便经济，对促进一些应用酶 类的工业化生产具有重要意义。
[0068] 发明实施例公开如上，虽然实施例已有优化，但其并非用W限定本发明，任何熟悉 此技术的人都可在不脱离本发明的精神和范围内进行改动与修饰，因此本发明的保护应W 权利要求为准。
【主权项】
1. 一种使胞内蛋白表达至胞外的放线菌信号肽，其特征是:所述信号肽命名为Kp-SP， 来源于库克氏菌(Kocuria sp.3-3)菌株，其核苷酸序列长度为90bp，如SEQ ID No.l所示； 其氨基酸序列长度为29aa，如SEQ ID No.7所示。2. 权利要求1所述使胞内蛋白表达至胞外的放线菌信号肽在利用构建的重组大肠杆菌 表达淀粉酶或纤维素酶中的应用。3. 如权利要求2所述的应用，其特征是：所述淀粉酶是淀粉酶KC441955.1，命名为FSA， 来源于Sinomicrobium Pectinilyticus f5DNS001，其核苷酸序列如SEQ ID Νο·2所不，氨基 酸序列如SEQ ID No.8所示；或是淀粉酶AAU39594,命名为BLA，来源于Bacillus licheniformis DSM13,其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，氨基酸序列如SEQ ID No.9所 示;所述纤维素酶0RF3883,命名为CCC，来源于Clostridium cellulosi CS-4-4,其核苷酸 序列如SEQ ID No.4所示，氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示。4. 如权利要求2所述的应用，其特征是:所述重组大肠杆菌的构建方法是： (1) 根据NCBI数据库所提供KC441955.1、AAU39594、0RF3883所述的核苷酸序列设计引 物； 其中，淀粉酶KC441955.1与信号肽Kp-SP重组所用引物为：SFSA-F1: GAGGATCCGATGAGCAGACGAGC,SFSA-Rl：GCGAGCGCCGATGACAATAATAATTATAC；SFSA-F2： GTATAATTATTATTGTCATCGGCGCTCGC，SFSA-R2: GACGTCGACTTACTCTCCCGAAACCGACCATATG，通过 三步PCR将信号肽Kp-SP序列与KC441955.1序列连接，所得重组基因片段命名为SFSA; 淀粉酶AAU39594与信号肽Kp-SP重组所用引物为：SBLA-F1: GAGGATCCGATGAGCAGACGAGC，SBLA-Rl:CTTTAAGATTTGCCGCGGCGCTCG，SBLA-F2: GCGAGCGCCGCGGCAAATCTTAAAG，SBLA-R2: CCCAAGCTTGGGCTATCTTTGAACATAAATTG，通过三步 PCR将信号肽Kp-SP序列与AAU39594序列连接，所得重组基因片段命名为SBLA; 纤维素酶0RF3883与信号肽Kp-SP重组所用引物为：SCCC-F1: GAGGATCCGATGAGCAGACGAGC，SCCC-Rl:CTGGGCCGCTTACGGCGCTCGC，SCCC-F2: GCGAGCGCCGTAAGCGGCCCAG，SCCC-R2: GACGTCGACTTACTGCGGTTCAACGCCCCATATC，通过三步 PCR 将信号肽Kp-SP序列与0RF3883序列连接，所得重组基因片段命名为SCCC; 其中：所述KC441955.1的核苷酸序列如SEQ ID化.2所示441]39594的核苷酸序列如 SEQ ID No.3所示，0RF3883的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示； 对照组为一步PCR获得的不加信号肽Kp-SP的KC441955.1或AAU39594或0RF3883所示的 基因片段； (2) 将（1)中得到的三组重组基因片段和对照组基因片段分别与载体pET-Duet或 pBSPPc 连接，构建获得重组质粒 SFSA-pET-Duet、SFSA-pBSPPc 或 SBLA-pET-Duet、SBLA-pBSPPc或SCCC-pET-Duet、SCCC-pBSPPc，将所述重组质粒分别转入感受态大肠杆菌BL21 (DE3)中，获得的重组菌株通过PCR和琼脂糖凝胶电泳验证确认;对照组为FSA-pET-Duet、 FSA-pBSPPc 或 BLA-pET-Duet、BLA-pBSPPc 或 CCC-pET-Duet、CCC-pBSPPc 重组质粒转入感受 态大肠杆菌BL21 (DE3)中，通过PCR和琼脂糖凝胶电泳验证； (3) 将(2)中得到的以pET-Duet为载体的重组菌株按照体积比2%的接种量分别接于LB 摇管中，培养8-9h，再以体积比1 %的接种量转接于100ml LB摇瓶中，37 °C摇床培养，待 0D6QQnm= 0.4-0.6时，按体积比加入1%。的ITPG，其中，产淀粉酶FSA及SFSA的重组菌株放入20 °C摇床过夜培养，产淀粉酶BLA及SBLA的重组菌株于3 7 °C继续培养4h，产纤维素酶CCC及 SCCC的重组菌株于37°C继续培养4h，所获菌液离心保留上清，即得到含有淀粉酶或纤维素 酶的发酵液； 同样，将(2)中得到的以pBSPPc为载体的重组菌株按照体积比2%的接种量分别接于LB 摇管中，培养8-9h，再以体积比1 %的接种量转接于100mL LB摇瓶中，其中，产淀粉酶FSA及 SFSA的重组菌株直接20 °C过夜培养，产淀粉酶BLA及SBLA的重组菌株直接37 °C过夜培养，产 纤维素酶CCC及SCCC的重组菌株直接37°C过夜培养，所获菌液离心保留上清，即得到含有淀 粉酶或纤维素酶的发酵液。
【文档编号】C07K14/195GK105924507SQ201610462367
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月22日
【发明人】杨春玉, 崔延冰
【申请人】山东大学