大肠杆菌LuxS蛋白体外表达质粒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种大肠杆菌LuxS蛋白体外表达质粒及其应用，通过限制性核酸内切酶的作用，将体外PCR扩增出的LuxS基因片段消化并连接到载体pGEX4T-1上，构建出大肠杆菌LuxS蛋白体外表达质粒。本发明表达结果鉴定方法直观明了，具有良好的可操作性和重复性；通过调节诱导物的浓度以及诱导时间，可控制蛋白表达的数量，从而满足不同实验的需求，尤其是密度感应机制相关实验的需求，为不同目的、不同条件的实验提供更相近的对照组别。
【专利说明】大肠杆菌LuxS蛋白体外表达质粒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物密度感应机制研究领域，尤其涉及一种大肠杆菌LuxS蛋白体外表达质粒及其应用。
【背景技术】
[0002]密度感应(quorum sensing, QS)是一种微生物细胞间信息传递机制，即细菌通过合成、分泌并感知环境中的信号分子，以调节自身某些基因的表达[1]。信号分子中，自诱导分子-2 (autoinducer-2, A1-2)的产生基因保守存在于微生物中，故而其被认为参与了菌种间的信号传递[2，3]。由于在自然状态下微生物多以不同菌种混合存在的方式生存，并在菌种间存在广泛的信息交流，所以A1-2这种菌群间的信息调控系统备受重视M。研究其诱导的密度感应机制，有利于理解微生物间生物学行为的调控，并为探索抑制微生物感染提供新的思路。
[0003]然而对于研究A1-2所介导的密度感应系统的实验来说，只有在体外高效的表达LuxS蛋白，继而考察不同实验组别的差异，才能使得实验结果更可靠更有说服力，现有研究中有通过多肽合成的解决方案，但该方法技术复杂且成本较高，无法广泛用于对比研究。本课题组在研究工作中探讨通过表达质粒的构建获得LuxS蛋白的体外表达，而要在体外获得稳定的IuxS表达则需要一个良好的表达体系。载有强启动子的高拷贝表达载体由于其构建及表达过程便捷、经济，同时又具有稳定以及可调节等特点，提供了快速有效地在体外构建及表达LuxS的可能。目前未见有关于大肠杆菌LuxS蛋白体外表达质粒的报导。
[0004][I] Xavier KB,Bassler BL.Regulation of Uptake and Processing of theQuorum-Sensing Autoin`ducer A1-2 in Escherichia coli [J].J.Bacteriol, 2005,187(1):238 - 248.[2]Kendal I MM, Rasko DA, and Sperandio V.Global Effects of theCell-to-Cell Signaling Molecules Autoinducer-2, Autoinducer-3, and Epinephrinein a IuxS Mutant of Enterohemorrhagic Escherichia coli [J].1nfect.Tmmun.2007，75(10):4875 - 4884.[3]Surette MG, Miller MB, and Bassler BL.Quorum sensing in Escherichiacoli, Salmonella typhimurium, and Vibrio harvey1: A new family of genesresponsible forautoinducer production [J].Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.1999.96(4):1639-1644.[4]Vendevi lie A, Winzer K.Tang CM, et al.Making ’sense’ ofmetabolism: autoinducer-2, LuxS and pathogenic bacteria[J].Nat Rev Microbiol,2005, 3(5): 383-396。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是，提供一种可以高效便捷的表达LuxS蛋白的大肠杆菌LuxS蛋白体外表达质粒及其应用。
[0006]为了解决上述问题，本发明提供了一种大肠杆菌LuxS蛋白体外表达质粒，其特征在于，通过限制性核酸内切酶的作用，将体外PCR扩增出的LuxS基因片段消化并连接到载体PGEX4T-1上，构建出大肠杆菌LuxS蛋白体外表达质粒。
[0007]本发明亦提供了大肠杆菌LuxS蛋白体外表达质粒在密度感应信号系统研究中的应用。
[0008]本发明的优点在于，本发明通过扩增野生型大肠杆菌LuxS基因并利用高拷贝的表达载体构建质粒，继而转入大肠杆菌菌株中，在诱导物异丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside, IPTG)的诱导条件下,成功得到了该蛋白的稳定表达。同时表达载体上携带的GST标签也有利于表达蛋白的鉴定,从而可采用商品化的抗GST抗体,利用westernblot等方法鉴定出携带有标签的蛋白表达，表达结果鉴定方法直观明了，具有良好的可操作性和重复性；通过调节诱导物的浓度以及诱导时间，可控制蛋白表达的数量，从而满足不同实验的需求，尤其是密度感应机制相关实验的需求，为不同目的、不同条件的实验提供更相近的对照组别。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1为高拷贝表达载体pGEX4T-l的结构示意图。
[0010]图2为IuxS基因扩增图，目的基因片段大小为516bp。
[0011]图3为P-LuxS克隆酶切鉴定图，1-6表示挑取得6个克隆，其中较大的酶切片段约为5000bp,小片段约为360bp。
[0012]图4为蛋白表达鉴定图，左边附图为考马斯亮蓝的染色图，右边附图为蛋白印迹杂交图，重组的LuxS蛋白大小约为45KD，在为诱导的时间点没有表达或极少的渗漏表达，经诱导后可大量表达。
[0013]图5为不同浓度IPTG诱导下，菌株MDAI2与M-L之间基因转录水平的差异。【具体实施方式】
[0014]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Samtoook等人，分子克隆:实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0015]菌株，质粒与主要试剂
菌株:大肠杆菌(Escherichia coli)W3110 (上海市口腔医学研究所提供)；
IuxS缺陷株MDAI2 (上海市口腔医学研究所提供)；` 感受态大肠杆菌T0P10 (上海市口腔医学研究所提供)；
表达载体PGEX4T-1 (上海市口腔医学研究所提供):载体结构示意图见附图1 ;
培养基:2xYT ；
酶:内切酶:Bgl I1、BamH 1、EcoR I ；连接酶:T4 DNA Ligase ；
诱导物:异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl thiogalactoside, IPTG)；
主要试剂盒:细菌基因组抽提试剂盒；
质粒抽提试剂盒；
DNA凝胶回收试剂盒；
以上均为北京博大泰克生物基因技术公司产品；
抗体:鼠抗GST单克隆抗体；
带有绿色荧光基团标记二抗。
[0016]克隆的制备
以大肠杆菌W3110基因组为模板，使用引物LF: GGC AGA TCT ATG CCG TTG TTA GATAGC TTC AC 和 LR: GGC GAA TTC CTA GAT GTG CAG TTC CTG CAA CT 通过 PCR 的方法扩增出IuxS基因片段。将产物进行1%琼脂糖凝胶电泳后拍照。
[0017]回收片段后利用Bgl II和EcoR I两个限制性内切酶消化基因片段，使用BamH I以及EcoR I消化表达载体pGEX4T-l，37°C条件下反应2小时。继而进行基因片段与载体的连接反应，16°C反应条件下过夜连接。所得连接产物按照标准方法转化入感受态的大肠杆菌TOPlO后，涂于氨苄青霉素(50mg/ml)的2xYT平板，37°C恒温培养过夜。
[0018]挑取转化平板上中等大小，边缘整齐的菌落6个，分别培养并按质粒提取试剂盒说明进行质粒的抽提。继而用BamH I以及EcoR I限制性酶进行双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。选取鉴定阳性结果送上海博尚生物技术公司进行测序，所得结果与标准序列进行比对，将鉴定结果正确的重组克隆命名为P-LuxS并保存。
[0019]蛋白表达的鉴定 将P-LuxS转化入经氯化钙方法制备并冻存的感受态大肠杆菌MDAI2中，涂板培养后挑菌并摇菌过夜。次日，以1:100的比例接入新鲜2xYT培养基，培养至吸光值J约为0.7，取菌液Iml作为对照，向剩余菌液内加入IPTG进行诱导(终浓度为lmmol/L)。分别于诱导后
0.5h、lh、2h取Iml菌液并测J值。将不同时间点所取菌液4°C离心并浓缩至2(M。加入蛋白上样缓冲液(SDS、Tris、甘油、水、溴酚兰、巯基乙醇)后，100°C煮lOmin，继而12000r/min离心lmin，上层液体即含有重组蛋白的样品。
[0020]3.1考马斯亮兰染色鉴定
配制10%SDS-PAGE胶，上样后恒压90V电泳至样品进入分离胶后，提高电压至120V继续电泳直至样品达到分离胶底部。将凝胶置入0.25%考马斯亮蓝R250染色剂内染色30min，最后用脱色液(甲醇:冰醋酸:水为50:10:40)脱色处理后，扫描仪扫描成像。
[0021]3.2蛋白印迹法鉴定
蛋白样品稀释100倍后上样，电泳过程同3.1。所得凝胶经转膜封闭漂洗等处理后，依次加鼠抗GST单克隆抗体(1:5000稀释)以及带有荧光基团标记的抗鼠二抗(1:5000稀释)覆育。最后于Odyssey成像系统扫描成像。
[0022]实验结果示例
通过PCR的方法扩增大肠杆菌野生菌株的IuxS基因，并插入表达载体pGEX4T-l中，通过双酶切鉴定的方法确认了重组克隆的构建成功(参见附图2、3)。
[0023]经过IPTG的诱导，重组蛋白LuxS得以表达。考马斯亮蓝染色结果显示了蛋白的表达，同时蛋白印记杂交方法利用了抗载体自带标签GST的抗体,进一步验证了 GST-LuxS融合蛋白的表达。(结果参见附图4)。
[0024]5.体外诱导浓度示例
体外表达质粒由于需要IPTG的诱导，才可表达所携带的蛋白基因，因此当调节诱导剂的浓度时，也可影响到对整个LuxS信号系统的调节。本发明中，也比较了在不同IPTG浓度诱导条件下，菌株MDAI2 (IuxS缺陷株，不表达LuxS)与M-L (缺陷株携带有构建完成的LuxS体外表达质粒)之间密度感应调控下游基因fliA基因转录水平的差异。实验结果显示(参见附图5)，在未经诱导的情况下M-L菌株的fliA基因是MDAI2的0.86倍；而当IPTG浓度为0.01mmol/L的时候相应的基因表达为1.99倍；0.lmmol/L的时候为1.08倍；lmmol/L 为 1.39 倍。
[0025]通过调节诱导物的浓度以及诱导时间，可控制蛋白表达的数量，说明能满足不同实验的需求，尤其是密度感应信号系统相关实验的需求，为不同目的、不同条件的实验提供更相近的阳性对照组别。
[0026]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。`
【权利要求】
1.大肠杆菌LuxS蛋白体外表达质粒，其特征在于，通过限制性核酸内切酶的作用，将体外PCR扩增出的LuxS基因片段消化并连接到载体PGEX4T-1上，构建出大肠杆菌LuxS蛋白体外表达质粒。
2.权利要求1所述的大肠杆菌LuxS蛋白体外表达质粒在密度感应信号系统研究中的 应用。
【文档编号】C12N15/70GK103805625SQ201210456370
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月14日 优先权日:2012年11月14日
【发明者】黄正蔚, 王倩 申请人:上海交通大学医学院附属第九人民医院