一种将穿梭质粒导入黄色短杆菌（或谷氨酸棒杆菌）的转化方法
【专利摘要】本发明公开一种能在大肠杆菌和黄色短杆菌（或谷氨酸棒杆菌）中穿梭表达的重组质粒转化进入谷氨酸棒杆菌和营养缺陷型黄色短杆菌的快速有效方法。本发明提供的方法包括制备感受态细胞和高温培养转化两个步骤：（1）将营养缺陷型黄色短杆菌（或谷氨酸棒杆菌）接种至特殊配制的培养基上，使营养缺陷型黄色短杆菌（或谷氨酸棒杆菌）快速增殖，之后再转接到营养缺乏的培养基上，制备感受态细胞。（2）将待转化的质粒和上述制备的感受态细胞混匀并冰浴，然后恒温培养，将质粒导入到所述待转化的黄色短杆菌（或谷氨酸棒杆菌）中。本发明提供的方法，能减少黄色短杆菌对穿梭质粒的限制性酶切作用，并能稳定复制和传递，转化效果好，操作简便。
【专利说明】一种将穿梭质粒导入黄色短杆菌(或谷氨酸棒杆菌)的转化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细菌转化领域，具体涉及一种将质粒转化导入黄色短杆菌(或谷氨酸棒杆菌)中的方法，包括野生型和营养缺陷型。
【背景技术】
[0002]黄色短杆菌(或谷氨酸棒杆菌)是一种革兰氏阳性菌，广泛存在于自然界中。由于黄色短杆菌(或谷氨酸棒杆菌)的特性，一般化学法制备的感受态细胞很难将质粒导入黄色短杆菌(或谷氨酸棒杆菌)细胞，或者在基因工程菌构建中常用的转化法是电击转化比较容易将质粒导入细胞，但是电击转化黄色短杆菌(或谷氨酸棒杆菌)所用的感受态细胞制备的培养基原料较昂贵，操作相对简单，但转化效率不太高，电压(电容与电阻的设置)和时间参数是关键参数。而对于条件比较简陋的实验室来说，电转设备缺乏的情况下，用此化学方法制备感受态细胞，并将质粒转化进入细菌中，37°C恒温培养一段时间后，质粒能够在细菌中稳定遗传，是一个节省成本的好方法。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种比较简便的特殊培养基培养的方法制备黄色短杆菌(或谷氨酸棒杆菌)感受态细胞，并恒温培养将质粒导入其细胞能稳定遗传的简便方法。
[0004]本发明提供的制备黄色短杆菌(或谷氨酸棒杆菌)感受态细胞并转化的方法:
(I)所述感受态细胞制备步骤如下:
挑取一新鲜培养的营养缺陷型黄色短杆菌AN78单菌落接种于2.5 ml GM I培养基中，300C，130-150 rpm的条件下，振荡培养过夜；将过夜培养物按10%接种量转接到2.5ml新鲜的GM I中，37°C 200-230 rpm振荡培养3.5h ;再将培养物进行第二次传代，接种于5 ml GMII培养基中，按5%接种量进行第二次传代，37°C 200-230 rpm振荡培养90 min，取I ml培养物，5000 rpm室温离心5 min，用1/10体积上清液重新悬浮细菌沉淀，即为营养缺陷型黄色短杆菌感受态细胞。同理，将谷氨酸棒杆菌ATCC 13032制备成的感受态细胞，方法类似于上述制备营养缺陷型黄色短杆菌感受态细胞，营养缺陷型的菌株，所加的试剂是氨基酸，非营养缺陷型的菌株，将氨基酸改用无菌水代替。所述GM I生长培养基的溶剂为水(如双蒸水)，溶质及其浓度如下=15% K2HPO4.3H20，6% KH2P04，2% (NH4) 2S04,0.2%MgSO4,1%柠檬酸钠，将上述各成份溶于蒸馏水中，6.6X IO4 Pa高压灭菌，室温保存；10%酵母粉，1%水解酪蛋白，25mM MgCl2 (MgCl2*6H20，分子量为203)，高压灭菌，酵母粉溶液最好现配现用，水解酪蛋白和MgCl2溶液可室温储存；20%葡萄糖，0.25%所需氨基酸His (组氨酸)、Pro (脯氨酸)、Met (甲硫氨酸)，0.1M CaCl2 (CaCl2*2H20，分子量为 147)，用 0.22 μ m的微孔滤膜除菌，葡萄糖溶液和CaCl2室温储存，氨基酸溶液_20°C保存。
[0005](2)所述将穿梭质粒导入营养缺陷型黄色短杆菌AN78 (或谷氨酸棒杆菌ATCC13032)细胞的步骤如下:取质粒pXMJ19、pXMJ19-argH和无菌水各10 μ I加至营养缺陷型黄色短杆菌ΑΝ78感受态细胞悬浮液中，至终浓度I μ g/ml，质粒体积不超过感受态细胞悬液体积的1/20，混匀。37°C水浴中静置30-60 min，37°C 200 rpm振荡培养2-4 h，涂布于含有氯霉素(30 μ g/ml)的LB固体培养基上，每100 μ I转化体系涂I个平板，每一种黄色短杆菌的转化体系涂5个平板，37°C倒置培养过夜。计算平均转化率(转化子个数/y g DNA)。由于黄色短杆菌是营养缺陷型，在LB固体培养基中加入3%的氨基酸混合液(0.25% His，Pro，Met)，营养缺陷型黄色短杆菌AN78生长良好。同理，谷氨酸棒杆菌13032转化实验流程类似于黄色短杆菌AN78，由于谷氨酸棒杆菌13032是野生型标准菌株，在涂布转化体系的LB平板时，不加入氨基酸混合液。
[0006]LB液体培养基(PH 7.2)的制备方法:将IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物、IOg氯化钠和双蒸水充分混匀并用双蒸水定容至1L。
[0007]营养缺陷型黄色短杆菌AN78的LB培养基配制:将10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、IOg氯化钠和双蒸水充分混匀并用双蒸水定容至1L,加入0.25%的His、Pro、Met氨基酸混合液3ml。
[0008]所述待转化的质粒具体可为穿梭质粒pXMJ19以及它的重组质粒。
[0009]所述野生型谷氨酸棒杆菌或经过诱变的营养缺陷型黄色短杆菌AN78可为未经基因工程菌改造的谷氨酸棒杆菌(或黄色短杆菌)。所述的谷氨酸棒杆菌的菌株是ATCC13032，营养缺陷型菌株是黄色短杆菌AN78。
[0010]所述转化与 所述感受态细胞的配比为:100 ng-5 μ g (如100 ng-2 μ g或2-5 μ g)所述转化质粒:0.2 X IO9 CFU-0.49 X IO9 CFU (如 0.2 X IO9 CFU-0.31 X IO9CFU 或0.31 X IO9CFU -0.49 X IO9 CFU 感受态细胞)。
[0011]所述离心的条件具体可为:5000 r/min,离心10 min。
[0012]所述质粒导入细胞的整个转化流程中，都处于冰浴的条件下。
[0013]以上任一所述的振荡条件可采用如下:150-220 rpm，如150-180 rpm或180-220rpm,所述振荡的半径具体可为12 mm。
[0014]黄色短杆菌在指数生长期会有部分细胞进入感受态，尤其是在营养贫乏的培养基中易形成感受态细胞，例如以葡萄糖为唯一碳源的无机盐培养基。本发明针对常规的黄色短杆菌(或谷氨酸棒杆菌)转化方法，依托黄色短杆菌或谷氨酸棒杆菌的自然转化原理，思路清晰，操作简便，转化效果好，为对菌株进一步的遗传操作打下基础。本发明可在棒杆菌类转化上应用，前景广阔。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图l.pXMJ19质粒结构示意图。
[0016]图2.pXMJ19_argH质粒结构示意图。
[0017]图3.为实施例1中的抽提的质粒PXMJ19和及^7? I WLBernH I单酶切鉴定结果。I泳道为I单酶切的质粒PXMJ19 ；2泳勸BamH I单酶切的质粒pXMJ19 ；3泳道为抽提的未酶切的质粒PXMJ19 ;4泳道为Marker，从上到下分别为，10000 bp, 7000 bp, 4000 bp,2000 bp,1000 bp,500 bp,250 bp。
[0018]图4.为实施例2中抽提的重组质粒PXMJlkargH以及EcoR I热BamH I双酶切鉴定结果。I泳道为Marker，从上到下分别为，10000 bp, 7000 bp, 4000 bp, 2000 bp,1000 bp, 500 bp, 250 bp;2 泳道为I 单酶切的质粒 pXMJ19_argH ;3 泳道为I 和BamH I双酶切重组质粒pXMJ19_argH ；4泳道为抽提的质粒，5泳造为BamH I单酶切的质粒pXMJ19-argH。
【具体实施方式】
[0019]以下的实施例便于更好地理解本发明，但不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。本专利中的” h”均代表小时。本专利中的“min”均代表分钟。
[0020]谷氨酸棒杆菌ATCC 13032:购自上海复祥生物科技有限公司；营养缺陷型黄色短杆菌AN78是本实验室保存。
[0021]穿梭质粒pXMJ19 (结构示意见图1):购自北大工学院绍兴技术研究院。
[0022]穿梭重组质粒pXMJ19_argH，本实验室构建，结构示意图见图2。
[0023]LB液体培养基(PH 7.2)的制备方法:将10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g氯化钠和双蒸水充分混匀并用双蒸水定容至IL ;121 1:高温灭菌20 min。
[0024]LB固体培养基(PH 7.2)的制备方法:将10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g氯化钠、15g琼脂粉和双 蒸水充分混匀并用双蒸水定容至IL ;121度高温灭菌20 min。
[0025]IOX无机盐母液(PH 7.0)的制备方法:将10 g硫酸铵、60 g磷酸氢二钾、10 g柠檬酸三钠和2g七水合硫酸镁用双蒸水溶解并定容至1L，121°C高温灭菌20 min。
[0026]20%葡萄糖溶液的制备方法:将20g葡萄糖用双蒸水溶解定容至100 ml，用过
0.22um细菌过滤器过滤除菌，保存于4°C冰箱。
[0027]2%酪蛋白水解物溶液的制备方法:将2g酪蛋白水解物，用双蒸水溶解并定容至100ml，用0.22 μ m细菌过滤器过滤除菌。
[0028]实施例1穿梭质粒导入野生型谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的转化方法 生长培养基和诱导培养基的制备
生长培养基(IL)的制备方法:将IOX无机盐母液，20%葡萄糖溶液、2%酪蛋白水解物溶液和双蒸水混合，得到生长培养基GM I ;生长培养基的溶剂为双蒸水，溶质及其浓度如下:硫酸铵2 g/L、磷酸氢二钾14.8 g/L、柠檬酸三钠1.9 g/L、硫酸镁0.098 g/L、葡萄糖5g/L、酪蛋白水解物0.2 g/L。
[0029]诱导培养基(IL)的制备方法:将IOX无机盐母液，0.5 ml 0.1M CaCl2, Iml 25mM MgCl2, 20 %葡萄糖溶液和双蒸水混合，得到诱导培养基GM II ;诱导培养基的溶剂为双蒸水，溶质及其浓度如下:硫酸铵2 g/L、磷酸氢二钾14.8 g/L、柠檬酸三钠1.9 g/L、硫酸镁 0.098 g/L、葡萄糖 5 g/L。
[0030]感受态细胞的制备如见上述
【发明内容】
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[0031]将穿梭质粒转化导入谷氨酸棒杆菌，实验流程如见上述
【发明内容】
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[0032]转化效果的验证
随机挑取转化平板上生长的形态与谷氨酸棒杆菌ATCC 13032相近的单菌落，在含30μ g/ml氯霉素的LB固体培养基上随机挑取10株进行纯化培养，其中转化pXMJ19-argH和PXMJ19质粒的菌株分别各5株，共获得10株纯培养的菌株。
[0033]将得到的纯培养菌株在含30 μ g/ml氯霉素的LB液体培养基中，37°C、180rpm振荡培养过夜。
[0034]取完成培养体系抽提质粒，一部分重组质粒pXMJ19_argH为模板并进行PCR扩增，电泳检测结果，然后将扩增产物测序；另一部分抽提的质粒PXMJ19和重组质粒pXMJ19-argH电泳检测并用限制性内切酶IiBamH I进行单酶切鉴定，重组质粒pXMJ19-argH进行I取BamH I双酶切验证。则该菌株为成功将穿梭质粒pXMJ19_argH和PXMJ19导入谷氨酸棒杆菌ATCC 13032细胞中。价ο/? I琳BamH I单酶切验证质粒pXMJ19(见图3)，结果表明，成功穿梭质粒转化导入了谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的细胞中。 [0035]获得的10株纯培养菌株，经过抽提质粒、琼脂糖凝胶电泳检测，有6株(其中导入pXMJ19-argH的细胞为两株，而导入pXMJ19的细胞为四株)是成功将穿梭载体pXMJ19_argH或PXMJ19导入谷氨酸棒杆菌13032的重组菌，转化效率为60%。
[0036]实施例2将穿梭质粒导入营养缺陷型黄色短杆菌AN78的转化方法 生长培养基GM I和诱导培养基GM II的制备
生长培养基(I L)GM I的制备方法:将IOX无机盐母液，20%葡萄糖溶液、2%酪蛋白水解物溶液和双蒸水混合，得到生长培养基；生长培养基的溶剂为双蒸水，溶质及其浓度如下:硫酸铵2 g/L、磷酸氢二钾14.8 g/L、柠檬酸三钠1.9 g/L、硫酸镁0.098 g/L、葡萄糖5 g/L、酪蛋白水解物0.2 g/L, 0.25%氨基酸混合液(His，Met, Pro)。
[0037]诱导培养基(I L)GM II的制备方法:将IOX无机盐母液，20%葡萄糖溶液和双蒸水混合，得到诱导培养基；生长培养基的溶剂为双蒸水，溶质及其浓度如下:硫酸铵2g/L、磷酸氢二钾14.8 g/L、柠檬酸三钠1.9 g/L、硫酸镁0.098 g/L、葡萄糖5 g/L, 0.25%氨基酸混合液(His, Met, Pro)ο
[0038]感受态细胞的制备如见上述
【发明内容】
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[0039]将穿梭质粒转化导入营养缺陷型黄色短杆菌AN78，实验流程如见上述
【发明内容】
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[0040]转化效果的验证
随机挑取步骤三的平板上生长的形态与营养缺陷型黄色短杆菌AN78相近的单菌落，在含30 μ g/ml氯霉素的LB固体培养基上随机挑取10株进行纯化培养，共获得10株纯培养的菌株。
[0041]将得到的纯培养菌株在含30 μ g/ml氯霉素的LB液体培养基中，37 °C >180 rpm振荡培养过夜。
[0042]取完成培养体系抽提质粒，一部分重组质粒pXMJ19_argH为模板并进行PCR扩增，电泳检测结果，然后将扩增产物测序；另一部分抽提的质粒PXMJ19和重组质粒pXMJ19-argH电泳检测并用限制性内切酶IiBamH I进行单酶切鉴定，重组质粒pXMJ19-argH进行I取BamH I双酶切验证。则该菌株为成功将穿梭质粒pXMJ19_argH和pXMJ19导入营养缺陷型黄色短杆菌AN78细胞中，抽提的重组质粒pXMJ19_argH经过双酶切及和I中，结果有两条约6600bp和1400bp的条带出现(结果见图4)，证明穿梭质粒成功转化导入了营养缺陷型黄色短杆菌AN78中。
[0043]上述步骤获得的10株纯培养菌株均为成功将穿梭载体pXMJ19_argH和pXMJ19导入营养缺陷型黄色短杆菌AN78细胞中，转化效率为100%。
【权利要求】
1.在特殊的培养基上使得细菌细胞处于感受态的状况下，能将在大肠杆菌和黄色短杆菌(或谷氨酸棒杆菌)中穿梭表达的质粒转化进入到营养缺陷型黄色短杆菌(或谷氨酸棒杆菌)中的方法，包括制备感受态细胞和转化两个步骤。
2.如权利要求1所述的感受态细胞制备的培养基，其特征在于配方: . IOml GM1:1mlIOXspizizen salts, . 0.1ml 10%酵母粉， . 0.25ml 20% 葡萄糖， . 0.2ml 1%水解酪蛋白， . 0.2ml 0.25%所需氨基酸， 补充灭菌蒸馏水至总体积为IOml ； . IOml GMI1:1mlIOXspizizen salts, . 0.05ml 10% 酵母粉，. 0.25ml 20% 葡萄糖， . 0.04ml 1%水解酪蛋白， . 0.2ml 0.25%所需氨基酸， . 0.05ml 0.1M CaCl2, . Iml25mM MgCl2, 补充灭菌蒸馏水至总体积为IOml ； . IOXspizizen salts (100ml): . 15% K2HPO4.3H20, 15g3g. 6% KH2PO4,6g1.2g .2% (NH4)2SO4,2g0.4. 0.2% MgSO4,0.2g0.04. 1% 柠檬酸钠，Ig0.2 溶于蒸馏水中，6.6X IO4 Pa高压灭菌，室温保存；营养缺陷型的菌株，所加的试剂是氨基酸，非营养缺陷型的菌株，将氨基酸改用无菌水代替；通过营养缺陷型黄色短杆菌(或谷氨酸棒杆菌)先在GMI培养基上快速增殖，达到对数期后，转接入营养相对缺乏的培养基上GMII，使细胞处于饥饿状态，相当于细胞处于感受态的条件下，在质粒导入细胞后，能减少黄色短杆菌(或谷氨酸棒杆菌)对质粒的限制酶切作用，稳定遗传。
3.如权利要求1至2任一所述的方法，其特征在于:所述待转化质粒与所述感受态细胞的配比为:100ng-5 μ g所述待转化的质粒:0.2X IO9CFU -0.49X IO9 CFU感受态细胞。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于:所述待转化的质粒为穿梭质粒pXMJ19, pXMJ19-argH。
5.如权利要求1至4任一所述的方法，其特征在于:所述转化整个实验流程都处于冰浴的条件下。
6.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于:所述营养缺陷型黄色短杆菌为经过诱变的组氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸营养缺陷型菌株；所述谷氨酸棒杆菌ATCC 13032是标准 菌株。
【文档编号】C12R1/13GK103966251SQ201310033531
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年1月29日 优先权日:2013年1月29日
【发明者】王翠平, 马承国, 王开成, 张传军 申请人:上海凯圣生物科技有限公司, 山西凯盛肥业有限公司