一种表达纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白构建纤维素酶高产菌株的方法
【专利摘要】本发明公开了一种表达纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白构建纤维素酶高产菌株的方法，属于酶工程领域。该方法为通过同源重组和基因工程技术将具有纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白的编码基因整合到黑曲霉热激蛋白基因的位置。首先合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的同源重组片段，用 Sal I酶切该重组片段和pWM1质粒再连接转化DH5α得到同源重组质粒；用该同源重组质粒转化农杆菌，通过农杆菌介导转化得到纤维素酶高产黑曲霉菌株。本发明利用热激表达实现了通过提高温度大幅度增加目的蛋白的表达，从而更显著的提高纤维素外切酶和内切酶的活性，增加纤维素酶的酶活。
【专利说明】一种表达纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白构建纤维素酶高产菌株的方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明属于酶工程领域，具体涉及一种表达纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白构建纤维素酶高产黑曲霉菌株的方法。
【背景技术】
[0003]纤维素是地球上最丰富的可再生资源，地球上每年因光合作用产生的纤维素达到100亿吨左右，利用纤维素生产生物能源，是缓解能源危机、实现人类可持续发展的关键。
[0004]纤维素利用的关键是把纤维素降解为可发酵性的糖类-葡萄糖。纤维素的降解需要外切酶、内切酶、葡聚糖苷酶的共同作用。其中，外切酶降解纤维素的晶体结构，是纤维素酶降解纤维素的限速步骤，内切酶降解长片段的纤维素成为二聚体，是纤维素降解的关键步骤。用纤维素酶降解纤维素具有绿色、条件温和、转化率高的特点，但是纤维素较高的生产成本成为纤维素酶降解纤维素的瓶颈。
[0005]获得高产纤维素酶的菌株，降低纤维素酶的生产成本成为纤维素酶工业化利用的必由之路。纤维素酶的生产菌株主要有黑曲霉。黑曲霉由于其较高的安全性，被认为是生产纤维素酶最有应用前景的菌株之一。黑曲霉生产的纤维素酶由纤维素内切酶、葡糖苷酶和外切酶组成。其中外切酶破坏纤维素晶体结构，把晶体纤维素降解为可溶性的纤维素片段，该过程是纤维素降解的限速步骤。纤维素的高效降解需要大量的纤维素外切酶。然而，黑曲霉生产的纤维素酶中，葡糖苷酶的活性比外切酶的活性和内切酶的活性高的多。由于黑曲霉产生的纤维素外切酶活性和内切酶活性的不足，致使黑曲霉产生的纤维素酶对天然纤维素的降解效率非常低。因此增加纤维素外切酶和内切酶的活性，成为提高黑曲霉纤维素酶降解效率的重要措施。
[0006]现有的增加黑曲霉纤维素酶的方法有和高外切酶活性的纤维素酶混合或黑曲霉菌株与里氏木霉混菌发酵。与高外切酶活性纤维素酶的混合，本身就增加了混合这一道工艺，增加了降解成本。而且高外切酶活性的纤维素酶成本也较高。混菌发酵由于里氏木霉产生毒素，大大限制了纤维素酶的使用范围。
[0007]已报道的构建黑曲霉纤维素酶高产菌株的方法是导入的基因与黑曲霉已有纤维素酶的基因共同表达，但是表达的酶仅仅具有一种活性，不能同时增加内切酶和外切酶的活性。同时已有的基因工程菌不能通过条件(温度、酸度等)控制单一的大幅度增加某一种酶的表达，对纤维素酶酶系组成的改变有限。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种表达纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白构建纤维素酶高产黑曲霉菌株的方法。本发明的目的还在于提供一种基于该方法构建得到的纤维素酶高产黑曲霉菌株。
[0009]本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种表达纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白构建纤维素酶高产黑曲霉菌株的方法，为通过同源重组和基因工程技术将具有纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白的编码基因整合到黑曲霉热激蛋白基因的位置。
[0010]一种纤维素酶高产黑曲霉菌株，为在热激蛋白基因的位置整合有纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白编码基因的黑曲霉菌株。
[0011]所述的纤维素酶高产黑曲霉菌株的构建方法优选包含如下步骤:
(I)合成黑曲霉热激蛋白基因的前段序列-纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白的编码序列-黑曲霉热激蛋白基因的后段序列的同源重组片段，该同源重组片段两端含有限制性内切酶酶切位点；将该重组片段连接到pWMl质粒上得到同源重组质粒。
[0012](2)用同源重组质粒转化农杆菌。
[0013](3)通过农杆菌介导转化得到目的菌株。
[0014]优选的，步骤(I)为:合成核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示的同源重组片段，用Sall酶切；将？丽1质粒也用SaR酶切；将酶切后的重组片段和质粒通过DNA连接酶连接，并转化DH5ci得到同源重组质粒。
[0015]本发明通过同源重组技术，合成黑曲霉热激蛋白编码序列的前后两段作为同源重组序列，把具有纤维素内切酶和外切酶的蛋白编码序列连接，通过基因工程技术，让具有纤维素内切酶和外切酶活性的蛋白整合到热激蛋白的位置，构建出热激表达的菌株，构建的菌株纤维素酶的6.7U/g，是出发菌株5.6U/g的1.2倍。
[0016]本发明的黑曲霉菌株能够内表达外切酶和内切酶活性的蛋白，为纤维素酶的高产菌株。本发明最大的优点是通过表达一种蛋白，能同时增加外切酶和内切酶的活性，更具有创新意义的是利用热激表达实现了通过提高温度大幅度增加目的蛋白的表达，从而更显著的提高纤维素外切酶和内切酶的活性，增加纤维素酶的酶活。
【具体实施方式】
[0017]以下实施例用于进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换均属于本发明的范围。若为特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0018]实施例1
A、同源重组质粒的构建
(I)材料:黑曲霉fliger)、大肠杆菌(万.coliΛΗ5 α、农杆菌ΕΗΑ105和质粒P丽I均为商业化产品。其中，黑曲霉从ATCC购买，菌株编号ATCC10582 ;农杆菌ΕΗΑ105和质粒pMWl从B1vector公司购买。
[0019](2)同源重组片段的合成及酶切
合成由黑曲霉热激蛋白基因的前段同源序列(该序列可能的起始密码子被其它碱基替代以确保转录从双活性蛋白的起始密码子开始，序列如SEQ ID N0.2所示)一纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白的编码序列(SEQ ID N0.3)—黑曲霉热激蛋白基因的后段同源序列(SEQ ID N0.4)组成的同源重组片段(核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示)。
[0020]往100 μ L该同源重组片段中加入Sal\酶液2 μ L (TakaRa购买)，30°C酶切16h，酶切后65°C水浴1min。
[0021](3) P丽I质粒的提取及酶切
含有P丽I质粒的大肠杆菌E.coli DH5 α于LB中(50 μ g/mL的卡那霉素)37°C振荡培养12h。取1.5mL菌体于EP管，以4000rpm离心3min,弃上清液。加0.1mL溶液K 1%葡萄糖，50mM EDTA pH8.0,25mM Tris-HCl ρΗ8.0)充分混合。加入 0.2mL 溶液 11(0.2mM NaOH,1% SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5min。加入0.15mL预冷溶液III (5mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，冰浴5min。以1000rpm离心20min，取上清液于另一新EP管。加入等体积的异戊醇，混匀后静置lOmin。再以1000rpm离心20min，弃上清。用70%乙醇0.5mL洗涤一次，抽干所有液体。待沉淀干燥后，溶于0.05mL TE缓冲液中。
[0022]提取的pWMl质粒50 μ L加入SaR酶液2 μ L (TakaRa购买)，30°C酶切16h，酶切后 65°C水浴 1min。
[0023](4)连接
酶切的同源重组片段100μ L和酶切的pWMl质粒20μ L用5μ L Τ4 DNA IigaseCTakaRa购买)16°C连接24h。
[0024]B、大肠杆菌感受态细胞的制备
(I)将E.co7i DH5a置于LB培养基上，在37°C下过夜培养。
[0025](2)高温灭菌大的离心瓶(250_500mL)以备第二天摇瓶用。
[0026](3)准备几瓶灭菌水(总量约1.5升)，保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用。
[0027](4)转移0.2-lmL过夜培养物至装有20mL LB(或其他营养丰富的培养基)的10mL摇瓶。
[0028](5) 37°C下剧烈振荡培养6小时。
[0029](6)监控培养液0D_值(培养I小时后每半小时测定一次)。
[0030](7)当OD6tltl值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却15分钟。
[0031](8)细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液。
[0032](9)用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升)，然后加水稀释至离心管的2/3体积。
[0033]( 10)照上面步骤重复离心，小心弃去上清液。
[0034]( 11)照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞。
[0035](12)离心，弃上清液。
[0036](13)用20mL灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞。
[0037](14)照上面步骤离心，小心弃去上清液(沉淀可能会很松散)。
[0038](15)用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2_3mL。
[0039](16)将细胞按150 μ L等份装入微量离心管，于_80°C保存。
[0040]C、连接产物转化大肠杆菌
(I)在冰上解冻B步骤制得的感受态细胞。
[0041](2)每100 μ L感受态细胞添加10 μ L连接的质粒(Α步骤(4)的连接产物)，冰上培育约5分钟。
[0042](3)转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器中。
[0043](4)加载电转化仪，准备好300 μ L LB培养基。
[0044](5)对电穿孔容器进行脉冲(200欧姆，25 μ Fd，2.5千伏)(检查时间常数，应该在3以上)。
[0045](6)立即添加300 μ L的LB至电穿孔容器中。
[0046](7) 37°C下培养细胞40分钟至I小时以复原。
[0047](8)转移细胞至含有卡那霉素(5(^g/mL)选择培养基上培养，长出的菌落为含有同源重组质粒(连入同源重组片段的PMWl质粒)的转化子。
[0048]D、同源重组质粒的提取
C步骤得到的转化子37°C振荡培养12h。取1.5mL菌液于EP管中，以4000rpm离心3min，弃上清液。加 0.1mL 溶液 1( 1% 葡萄糖，50 mM EDTA pH 8.0,25mM Tris-HCl pH 8.0)充分混合。加入0.2mL溶液II (0.2mM NaOH, 1% SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5min。加入0.15mL预冷溶液III (5mol/L KAc, pH4.8)，轻轻翻转混匀，冰浴5min。以1000rpm离心20min，取上清液于另一新EP管中。加入等体积的异戊醇，混匀后静置lOmin。再以1000rpm离心20min,弃上清。用70%乙醇0.5mL洗漆一次,抽干所有液体。待沉淀干燥后，溶于0.05mL TE缓冲液中。
[0049]E、同源重组质粒转化农杆菌
农杆菌感受态的制备:液体保存的农杆菌EHA105涂布于LB培养基上，28°C培养，等到单菌落长出后，挑取单菌落，接种于5mL的液体培养基中，28°C、150r/m培养24h，按照I: 10的接种比例接种于5mL新鲜的液体培养基中，280C、150r/m培养24h。培养的菌体冰浴40min, 5000r/m 离心 5min,用 10mT,的 0.02mol/L 0&012菌体重悬菌体。再次 5000r/m 离心5min,菌体悬浮于ImL的0.02mol/L CaCl2溶液,放置于冰上保藏。
[0050]取提取的同源重组质粒I μ L与40 μ L的农杆菌感受态悬液混合，轻轻摇动混合5min后，在液氮上迅速冰冻5min，37°C水浴5min。加入ImL液体LB培养基，28°C轻轻震荡4h。菌体5000r/m离心5min，弃去上清液，加入LB培养基50yL，震荡重新悬浮液体。液体涂布于含有5(^g/mL卡那霉素LB平板上，长出的菌落接种于含有5(^g/mL卡那霉素的LB液体培养基中28 °C、150r/m培养24h。
[0051]F、农杆菌介导转化黑曲霉
黑曲霉接种于PDA培养基斜面上，37°C培养72h，用灭菌的蒸馏水冲洗下孢子，孢子用蒸馏水稀释到18个孢子/mL。孢子与等体积的含有同源重组质粒的农杆菌混合均匀，加入乙酰丁香酮至200 μ mol/L, 30°C避光培养24h。然后把孢子涂布在平板上(200g 土豆用自来IL水煮沸30min，纱布过滤，加入20g葡萄糖、20g可溶性淀粉、20g琼脂、200 μ mo I头孢噻肟、200mg潮霉素B)，30°C培养到长出菌落。
[0052]长出的菌落分别接种到斜面上(200g 土豆用自来IL水煮沸30min，纱布过滤，加入20g葡萄糖、20g琼脂)，30°C培养72h，用接种环刮取孢子，接种到麸皮培养基中(麸皮:自来水=1:3 (W/W))，每个250mL三角瓶装入30g麸皮培养基，30°C培养4d，然后升温到39°C保温12h，降温到28°C培养Id。逐一测定每个转化子的纤维素酶酶活，酶活高的为转化子。筛选得到一个纤维素酶酶活达到6.7U/g的菌株，是出发菌株5.6U/g的1.2倍。对筛选的菌株进一步测序证实纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白的编码基因已整合到黑曲霉热激蛋白基因的位置，表明本发明表达纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白构建纤维酶高产菌株构建成功。
[0053]将上述筛选的菌株接种到斜面上(200g土豆用自来IL水煮沸30min，纱布过滤，力口入20g葡萄糖、20g琼脂)，30°C培养72h，用接种环刮取孢子，接种到麸皮培养基中(麸皮:自来水=1:3 (W/W))，250mL三角瓶装入30g麸皮培养基，28°C培养5.5d。测定酶活为5.9U/g，这说明没有热激，纤维素酶酶活没有热激的酶活高，说明热激表达策略使纤维素酶的酶活提闻。
[0054]纤维素酶酶活的测定方法:取发酵结束时的培养基5.0g,加入0.05M柠檬酸缓冲液50mL，200r/m浸提30min，滤纸过滤得到酶液。在50°C进行酶降解反应。在25mL试管中加入1mL pH 5.0的0.05M柠檬酸缓冲液，滤纸条(0.5cmX 2cm)两片作为底物，加入发酵液离心后上清液2mL，在水浴锅中50°C保温30min，然后用沸水煮沸5min，用DNS法测定还原糖的含量。酶活定义为:每分钟释放出Iymol还原糖所需要的酶量为一个酶活单位U。
【权利要求】
1.一种表达纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白构建纤维素酶高产黑曲霉菌株的方法，其特征在于:为将具有纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白的编码基因整合到黑曲霉热激蛋白基因的位置。
2.—种纤维素酶高产黑曲霉菌株，其特征在于:为在热激蛋白基因的位置整合有纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白编码基因的黑曲霉菌株。
3.权利要求2所述的纤维素酶高产黑曲霉菌株的构建方法，其特征在于包含如下步骤: (1)合成黑曲霉热激蛋白基因的前段序列-纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白的编码序列-黑曲霉热激蛋白基因的后段序列的同源重组片段，该同源重组片段两端含有限制性内切酶酶切位点；将该重组片段连接到PWMl质粒上得到同源重组质粒； (2)用同源重组质粒转化农杆菌； (3)通过农杆菌介导转化得到目的菌株。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于步骤(I)为:合成核苷酸序列如SEQIDN0.1所示的同源重组片段，用Sall酶切；将P丽I质粒也用Sall酶切；将酶切后的重组片段和质粒通过DNA连接酶连接，并转化DH5 α得到同源重组质粒。
【文档编号】C12N15/80GK104480139SQ201410824320
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月26日 优先权日:2014年12月26日
【发明者】薛栋升 申请人:湖北工业大学