专利名称：生产葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及构建微生物工程菌生产重组蛋白的方法。具体是应用微生物工程菌生产重组混合葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和3 -葡萄糖苷酶。
背景技术：
葡聚糖内切酶(endo-1,4-@-D-glucanase)、葡聚糖外切酶(exo_l,4-3-D-glucanase)和P _葡萄糖苷酶(P-glucosidase)具有联合水解纤维素的作用。纤维素由葡萄糖分子组成。葡聚糖内切酶(endo-1,4-0-D-glucanase)作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解￠-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素。葡聚糖外切酶作用于纤维素线状分子末端，依次切下一个纤维二糖分 子；￠-葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。即在葡聚糖内切酶，葡聚糖外切酶以及^ -葡萄糖苷酶的联合作用下，纤维素水解为葡萄糖分子。葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和
葡萄糖苷酶广泛应用于饲料、纤维素乙醇，食品、纺织和环卫业等领域，具有巨大的市场潜力。目前葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和￠-葡萄糖苷酶产品是来源于天然的产纤维素酶的菌株(细菌、放线菌和丝状真菌)。但是，由于细菌产生的葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和3 -葡萄糖苷酶是以包涵体形式存在于胞内，产物难于纯化；而放线菌和丝状真菌生长缓慢，营养要求较高，分泌大量自身的蛋白，难于纯化，生产成本较高。近些年来，陆续有报道表达重组葡聚糖内切酶或葡聚糖外切酶或￠-葡萄糖苷酶。由于引用强的启动子，选择生产性能良好的宿主菌和采取基因多拷贝重组的策略，可以较显著地提高重组酶的表达量。但工业上需求的并非葡聚糖内切酶或葡聚糖外切酶或￠-葡萄糖苷酶，而是葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和3-葡萄糖苷酶的混合酶。当前市面上尚没有重组生产的混合葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和￠-葡萄糖苷酶的混合酶产品，若用现有的含葡聚糖内切酶或葡聚糖外切酶或3 -葡萄糖苷酶的工程菌生产单酶，然后再将这些酶进行混合应用，其工序复杂，成本高。枯草芽孢杆菌和毕赤酵母都是常用于生产重组蛋白的宿主菌，但各具有特征。毕赤酵母的主要特征是分泌极少自身蛋白有利于表达产物的纯化；枯草芽孢杆菌具有兼性厌氧的特性，既能在有要氧的环境进行发酵，也能在无氧的环境进行发酵。
发明内容
本发明构建含木霉的葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和^-葡萄糖苷酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌和含木霉的葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和3-葡萄糖苷酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌；用含木霉的葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和3 -葡萄糖苷酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌和含木霉的葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和3-葡萄糖苷酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌生产重组混合葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶。本发明所采用的技术方案是I.克隆基因从木霉基因组中克隆葡聚糖内切酶，葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶基因。2.获得构建表达载体的启动子，重组序列，信号肽，转录终止子序列和抗性基因序列。3.构建如附图I和附图2的两种表达载体。4.通过电转化方法将以上构建的含木霉的葡聚糖内切酶基因表达框架、聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的枯草杆菌表达载体转化枯草芽孢杆菌、将含木霉的葡聚糖内切酶基因表达框架、聚糖外切酶基因表达框架和β -葡萄糖苷酶基因 表达框架的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母基因组。筛选高表达葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的重组子作为工程菌。5.发酵含木霉的葡聚糖内切酶基因表达框架、聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌和毕赤酵母工程菌生产重组混合葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶。本发明构建含木霉的葡聚糖内切酶基因表达框架、聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌和毕赤酵母工程菌生产重组混合葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的优点体现于(I)用工程菌取代天然菌株生产葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶，通过增加基因拷贝数而提高酶的产量。(2)用含葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶基因的工程菌取代含单一酶基因的工程菌生产酶，用一个发酵工序同时生产葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶取代了用三个工序分别生产重组葡聚糖内切酶或葡聚糖外切酶或β-葡萄糖苷酶。节省了原材料、能耗和人力资源。(3)枯草芽孢杆菌和毕赤酵母在生产重组蛋白方面各具特征，本发明分别构建含木霉的葡聚糖内切酶基因表达框架、聚糖外切酶基因表达框架和β -葡萄糖苷酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌和毕赤酵母工程菌，为其重组酶生产提供两种菌株选择。
附图I.含木霉的葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的枯草杆菌表达载体。p.巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)启动子；S. α因子信号肽；genel.木霉的葡聚糖内切酶基因；gene 2.木霉的聚糖外切酶基因；gene 3.木霉的β -葡萄糖苷酶基因；TT.转录终止子序列；G418.G418抗性基因(应用于筛选枯草芽孢杆菌重组子)；ColEl.大肠杆菌复制起点；AMP.氨苄青霉素抗性基因(应用于筛选大肠杆菌转化子)；B. subtilis rDNA.枯草芽抱杆菌的rDNA序列。附图2.含木霉的葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体。p.毕赤酵母的三磷酸甘油醒脱氢酶(GAP)启动子；S. α因子信号肽；genel.木霉的葡聚糖内切酶基因；gene 2.木霉的聚糖外切酶基因；gene 3.木霉的P -葡萄糖苷酶基因；TT.转录终止子序列；G418.G418抗性基因(应用于筛选毕赤酵母重组子)；ColEl.大肠杆菌复制起点；AMP.氨苄青霉素抗性基因(应用于筛选大肠杆菌转化子)f.pastorisrDNA.毕赤酵母的rDNA序列。
具体实施例方式下面用非限定性实施例对本发明作进一步说明。实施例I :I. I构建含木霉的葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和^-葡萄糖苷酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体I. I. I构建克隆载体
由专业的DNA序列合成公司合成含氨苄青霉素(AMP)基因序列、多克隆接头和大肠杆菌复制起点的两条碱基互补的DNA双链，并且在每条DNA链序列的两端形成粘性末端。通过DNA连接酶的作用使其环化，形成DNA克隆载体。将其克隆载体命名为pBCL。I. I. 2用反转录PCR扩增木霉的葡聚糖内切酶基因、葡聚糖外切酶基因和P葡萄糖苷酶基因合成如下引物引物a:5' tcgaattcccgaattccagcagactg3'[说明5’ 端的 8 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]引物b:5' ttGCGGCCGCatgcggccgcctactttc3'[说明5’端的 10 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的8个碱基)]引物c:5' gcgaattcccgaattccaagcttgct3;[说明5’ 端的 8 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]引物d 5/ aaGCGGCCGCcagcggccgcttacaggaa3 [说明5’ 端的 10 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的8个碱基)]引物e:5' ccgaattcgcgctacgtagttgtacct 3'[说明5’ 端的 8 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]引物f:5' tagcggccgcataagcggccgcctac 3'[说明5’ 端的 10 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的8个碱基)] 应用RNA提取试剂盒提取木霉的总RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA。以上述合成的木霉的cDNA为模板，应用引物a和引物b进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是木霉的葡聚糖内切酶基因序列；以上述合成的木霉的cDNA为模板，应用引物c和引物d进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是木霉的葡聚糖外切酶基因序列；以上述合成的木霉的cDNA为模板，应用引物e和引物f进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是木霉的P葡萄糖苷酶基因序列。I. I. 3分别构建上述各种酶基因表达框架I. I. 3. I用PCR扩增巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的三磷酸甘油醒脱氢酶启动子序列。引物I:
5’ CCTACGTAGATCCATTATCGGTGAACCA 3’引物2:5’ GGGCATGCGGGTATTTCCTCCTTGAATGT 3’[说明引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]提取巨大芽孢杆菌的基因组DNA[巨大枯草芽孢杆菌基因组DNA提取方法将枯草芽孢杆菌细胞加于9mg/ml的蜗牛酶溶液(蜗牛酶用lmol/L的山梨醇溶解)于30°C振摇30分钟，然后按照常规的细菌基因组DNA提取方法提取其基因组DNA]，应用引物I和引物2进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是巨大芽孢杆菌三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列]:CCTACGTAGATCCATTATCGGTGAACCATCTATTAAAGACATGCTTCATTTAATTAAGTCCGCTGGTATGGTTGTTCACG GAATAGGAGACGCTATGACAATGGCAGAACGCCGTAAAACACCACAAGCAGACTTAGAAAAAGTGAAAAATGGACATGCT GTAGGTGAGGCATTTGGATACTATTTTAATCATCAAGGCGAAGTTGTTCATAAAGTTAAAACAGTTGGCATACAACTCGA TGATTTAAAGAACAATAAATGTGTTATTGCTGTTGCAGGAGGTTCATCAAAAGCAAAGGCAATTAAAGCGTTTATGCAAC AAGCGCATGATTCGATTCTCATTACAGATGAAGGCGCCGCAAAAGAGTTAGTAAGGGATTTTAATTAATCCCTCATATAA AAAATACTTTTTACATTCAAGGAGGAAATACCCGCATGCCCI. I. 3. 2由专业的DNA序列合成公司合成α因子信号肽[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是α因子信号肽序列]: CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACT ACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGC TGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAG AAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC I. I. 3. 3由专业的DNA序列合成公司合成转录终止子序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是转录终止子序列]:GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAA GAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAG GATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGG TAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTG AGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATCCI. I. 3. 4用套叠PCR法合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是G418抗性基因序列]GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATAC CATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTAT CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAA ATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGC CATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACG CGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATT TTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCAT CAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTA ACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGT CGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCC TCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCGGI. I. 3. 5用PCR从枯草芽孢杆菌基因组中扩增rDNA序列引物I :5，CCGGTACCgacgaacgctggcggcgtgc3 引物2 :5，CCTTCGAAgcaccttccgatacggctacct3 [说明引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]提取枯草芽孢杆菌基因组DNA (枯草芽孢杆菌基因组DNA提取方法同以上所述的巨大芽孢杆菌基因组DNA提取方法)，以基因组DNA为模板应用引物I和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是枯草芽孢杆菌基因组的rDNA序列。I. I. 3. 6表达框架构建(启动子-信号肽-基因-转录终止子序列)过程D.构建葡聚糖内切酶基因表达框架通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将巨大枯草芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pBCL载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pBCL载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将木霉的葡聚糖内切酶基因序列重组于PBCL载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于pBCL载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含葡聚糖内切酶基因表达框架的载体称为PBCL1。E.构建葡聚糖外切酶基因表达框架通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将巨大枯草芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pBCL载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于PBCL载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将木霉的葡聚糖外切酶基因序列重组于PBCL载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于pBCL载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含葡聚糖外切酶基因表达框架的载体称为PBCL2。F.构建β葡萄糖苷酶基因表达框架通过DNA限制性内切酶和Τ4 DNA连接酶的作用，将巨大枯草芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pBCL载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pBCL体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将木霉的β葡萄糖苷酶基因序列重组于pBCL载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于pBCL载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含β葡萄糖苷酶基因表达框架的载体称为PBCL3。1.1.4完成表达载体的构建I. I. 4. I将3套表达框架组装于同一个克隆载体。通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，切取pBCL2，和pBCL3载体的表达框架，并将切下的这两套表达框架依次插入于PBCLl的多克隆位点。此载体称为PBCL123。I. I. 4. 2通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用依次将枯草芽孢杆菌的rDNA (DNA重组序列)和G418基因重组于pBCL123载体的多克隆位点。构成含木霉的葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和3 -葡萄糖苷酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体(附图I)。I. 2构建含木霉的葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和 ^-葡萄糖苷酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌。用电转化方法将含木霉的葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和3-葡萄糖苷酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体转化枯草芽胞杆菌，将经过电转化作用的枯草芽孢杆菌涂布于G418-LB(1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%氯化钠，1.5%琼脂粉，终浓度为70011§/1111的6418)平板，在37 °C培养3天后生长出菌落(重组子)。分别应用以上所述的葡聚糖内切酶基因、葡聚糖外切酶基因和￠-葡萄糖苷酶基因特异引物，以重组子基因组DNA为模板，进行PCR扩增；重组子能扩增出目标大小的PCR扩增带，并且对其PCR产物进行序列测定证明其木霉的葡聚糖内切酶基因、葡聚糖外切酶基因和葡萄糖苷酶基因已经重组于重组子的基因组。将生长于G418抗性平板的并经过用基因特异引物进行PCR验证的重组子分别在37°C进行摇瓶发酵2天，用常规方法测定发酵液上清的葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和3 -葡萄糖苷酶活性，根据酶活性测定，筛选高表达以上所述的三种酶的重组子作为含木霉的葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和3-葡萄糖苷酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌。I. 3生产重组混合葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和P -葡萄糖苷酶将含木霉的葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和￠-葡萄糖苷酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌接种于LB (I %胰蛋白胨，0. 5 %酵母提取物，1%氯化钠)液体培养基，分装成3瓶，在37°C发酵2天；将天然的产葡聚糖内切酶，葡聚糖外切酶和￠-葡萄糖苷酶的木霉(即I. I. 2. 4应用于扩增基因的木霉)接种于常规的真菌培养基(土豆汁200g/L、葡萄糖20g/L)，分装成3瓶，在30°C发酵3天。离心取上清。分析发酵液上清对羧甲基纤维素的水解作用(表I)。用统计学的差异性对表I的结果进行分析，结果表明含木霉葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和3 -葡萄糖苷酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌的发酵液上清对纤维素水解生成葡萄糖的作用显著强于天然的产葡聚糖内切酶，葡聚糖外切酶和3 -葡萄糖苷酶的木霉的发酵液上清对纤维素的作用(P<0.01)。表I.发酵液上清与羧甲基纤维素作用生成葡萄糖含量测定结果
权利要求
1.生产葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的方法。其特征在于通过分子生物学技术克隆木霉的葡聚糖内切酶基因、葡聚糖外切酶基因和β-葡萄糖苷酶基因，构建含木霉的葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β -葡萄糖苷酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体和毕赤酵母表达载体；将枯草芽孢杆菌表达载体转化枯草芽孢杆菌从而获得枯草芽孢杆菌重组子、将毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母从而获得毕赤酵母重组子；分别筛选高达以上所述的三种酶的枯草芽孢杆菌重组子和毕赤酵母重组子作为含木霉的葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β -葡萄糖苷酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌和毕赤酵母工程菌；用含木霉的葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌和毕赤酵母工程菌生产重组混合葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β -葡萄糖苷酶。
2.根据权利要求I所述的生产葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于利用权利要求I所述的生产葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β_葡萄糖苷酶的方法制备重组混合葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β -葡萄糖苷酶产品。
全文摘要
本发明公开了生产葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的方法。属生物技术领域。首先克隆木霉的葡聚糖内切酶基因、葡聚糖外切酶基因和β-葡萄糖苷酶基因；构建含这三种酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体和毕赤酵母表达载体；将表达载体转化相应的宿主菌；分别筛选高表达葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的枯草芽孢杆菌重组子和毕赤酵母重组子作为工程菌。发酵枯草芽孢杆菌工程菌和毕赤酵母工程菌生产的重组混合葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶。本发明解决了用天然菌株生产混合葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶中遗留的酶产量低的关键问题，有利于降低其酶产品的价格。
文档编号C12N9/42GK102719459SQ20121014194
公开日2012年10月10日 申请日期2012年5月2日 优先权日2012年5月2日
发明者张泽华, 张添元, 张爱联, 易国辉 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所