一种疫苗中非特异性核酸内切酶活性检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提出了一种疫苗中非特异性核酸内切酶活性检测试剂盒，该试剂盒包括：NE反应体系和荧光探针；或NE反应体系和荧光染料。所述的试剂盒还包括连续记录荧光信号的仪器。本发明具有检测更快速、定量和可进行微量分析；检测时从原先的4h减少到30min，并且可以多样品同时测定，和进行酶种类分析。
【专利说明】一种疫苗中非特异性核酸内切酶活性检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及核酸酶检测【技术领域】，特别是指一种疫苗中非特异性核酸内切酶活性检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]非特异性核酸内切酶(Non-specific Endonuclease, NE)作用是把核糖核酸(包括DNA、RNA)降解成小的核酸片段和核苷酸，在生物制品行业中有广泛的应用。尤其在医药用生物制品如病毒性疫苗和基因工程蛋白产品中，是降低宿主细胞核酸残留的重要方法，而非特异性核酸内切酶本身的去除是高质量产品生产中的必须步骤，检测其残留也是产品质量评价中的重要一环。非特异性核酸内切酶(NE)属于磷酸二酯酶系列，能水解核酸(包括DNA、RNA)中非特定位点的的3’ -5’磷酸二酯键，产物是3’核苷酸或寡核苷酸。常用的是来自于粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和金黄色葡萄球菌(Staphyloccocalaureus)的非特异性核酸内切酶，以及核酸酶Pl (来自于桔青霉，Penicillium citrinum)等。非特异性核酸内切酶在工业中应用主要为1、(脱氧)核苷酸生产；2、生物制品中核酸残留的去除；前者应用中核酸降解获得的5’ 一核苷酸和5’ 一脱氧核苷酸可加工成各种医用药品、生化试剂、助鲜剂以及农作物促生长剂，它广泛应用于生物工程、医药、食品、化妆品、农业生产和科研等领域，并具有很高的经济价值。在生物制品中宿主细胞的核酸残留控制是纯化工艺的难点，尤其是病毒性疫苗抗原的生产中很难去除。采用非特异性核酸内切酶是去除残留核酸的有效方法。
[0003]目前采用的方法为两类:1、定性检测方法，主要是通过在一定的反应体系中加入NE和鲑鱼精DNA，反应在预定时间中止，设定阴性对照和阳性对照。然后用琼脂糖电泳观察DNA的片段分布，通常阳性样本中根据酶活性不同，鲑鱼精DNA会降解成在200bp~数kbp范围的涂抹条带，或约100~200bp大小的片段，或者基本降解后没有可见条带。该方法的优点是直观、可靠，可以知道底物的水解程度，缺点是无法对酶活性进行定量分析；2定量检测方法，典型的定量检测方法，是通过在一定的反应体系中加入NE和鲑鱼精DNA，反应在预定时间加酸(高氯酸)中止，设定阴性对照和阳性对照。然后高速离心(12000Xg)沉淀酸不可溶的DNA，以UV分析A26tlnm,通常IOD相当于I个单位。该方法是NE类酶活性定义的基本方法，其缺点是不能进行微量分析，必须事先知道所分析的酶种类。分析时间较长，通常为2~4h。
【发明内容】
[0004]鉴于以上现有技术中存在的问题，本发明提出一种疫苗中非特异性核酸内切酶活性检测试剂盒，解决了现有技术中无法同时对酶活性进行定量和微量分析的技术问题。
[0005]本发明的技术方案是这样实现的:
[0006]一种疫苗中非特异性核酸内切酶活性检测试剂盒，该试剂盒包括:
[0007]NE反应体系和突光探针；[0008]或NE反应体系和荧光染料。[0009]作为优选的技术方案，所述的试剂盒还包括连续记录荧光信号的仪器。
[0010]作为优选的技术方案，所述的试剂盒还包括定量PCR仪或荧光检测仪。
[0011]作为优选的技术方案，所述的NE反应体系为通用反应缓冲液或系列反应缓冲液；所述的通用反应缓冲液是可同时应用于各酶的溶液，其成分包括Tris.Η(:1，浓度为IO-1OOmM,优选为20-50mM ;pH范围为5~9.5，优选为5.4~8.5 ;还含有Ca2+、Zn2+或Mg2+，浓度为lmM-20mM，优选为2_10mM ;如果采用荧光染料，需事先加入DNA标准品，如鲑鱼精DNA或合成的随机引物，用量为l-500ng/y I ;所述系列反应缓冲液指分别针对单一酶设计的缓冲液组分，每组2-5种，其区别在于设计不同的pH值，使同一样品在不同pH值下测定活性比，对照标准品获得酶种类信息。
[0012]作为优选的技术方案，所述的突光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告突光基团和一个淬灭荧光基团；探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；NE反应时，酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每切开一个探针链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与酶作用产物形成同步。
[0013]作为更优选的技术方案，所述的荧光探针为长度10_30bp的寡聚核苷酸序列，5’末端标记发色基团，包括但不限于FAM、TET、HEX、TAMRA, ROX、CY5、CY3、JOE，3’末端标记淬灭基团，包括但不限于BHQ-1、BHQ-2、Eclipse、DABCYL ;探针的使用量为每反应I μ M~20 μ Μ,优选为 2 μ M ~10 μ Mo
[0014]作为优选的技术方案，所述的荧光染料是指能特异性地掺入DNA双链，在激发光下发射荧光信号，而不掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信号的物质，当NE把DNA双链降解后，发射的荧光信号减弱，以此测定核酸的水解速度。
[0015]作为更优选的技术方案，所述的突光染料包括但不限于pico green、SYBR系列突光染料，其在NE反应体系中应用浓度为lng-100ng/100ul (0.1~10X)。
[0016]检测步骤
[0017]取反应缓冲液,加入荧光探针或荧光染料,放置冰上，3-5min后,加入酶样品；同时设置阳性对照和空白对照；放入荧光检测仪器，事先设定仪器温度为25°C或37°C，启动记录程序，记录20-30min内荧光信号变化。
[0018]计算方法
[0019]以荧光检测数据为Y轴，时间为X轴，获得曲线方程，并计算酶反应曲线初速度。以系列稀释标准品的酶反应曲线初速度制作标准曲线。测定样品的酶反应曲线初速度和标准曲线对照，获得酶活性单位数值。
[0020]本发明是基于核酸的荧光显色原理，能进行微量和定量分析，可多样本同时分析，并且本发明所包括的综合酶反应体系能使所有已知NE能呈现高活性，因而对未知样本的核酸酶活性进行检测和评估，并且在系列缓冲液体系中所表现的酶活性特征可以对其种类进行初步判定。
[0021]有益效果
[0022](I)本发明具有检测更快速、定量和可进行微量分析；
[0023](2)检测时从原先的4h减少到30min，并且可以多样品同时测定，和进行酶种类分析。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0025]图1为本发明一种NE检测原理图(荧光探针);
[0026]图2为本发明实施例中的金黄色葡萄球菌核酸酶反应曲线。
【具体实施方式】
[0027]下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0028]实施例1
[0029]1.荧光探针设计实例
[0030]在生物技术公司合成长度为20bp探针，5’末端为FAM标记，3’末端为BHQ-1标记，序列为 5’ -FAM-actgaggcacctgcctcagt-BHQ-1-3’。
[0031]2.检测方法和步骤实例
[0032]A) Benzonase的标准品梯度制备原酶浓度为250U/ μ L，反应前取6 μ I按5倍稀释(加水 24 μ I 并充分混匀)为 50U，依次稀释至 20.00、15.00、10.00,5.00,2.50、1.00,OU/μ I,以备用。
[0033]B)反应体系如下:
[0034]标准品反应体系
【权利要求】
1.一种疫苗中非特异性核酸内切酶活性检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括: NE反应体系和荧光探针； 或NE反应体系和荧光染料。
2.根据权利要求1所述的一种疫苗中非特异性核酸内切酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括连续记录荧光信号的仪器。
3.根据权利要求1所述的一种疫苗中非特异性核酸内切酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括定量PCR仪或荧光检测仪。
4.根据权利要求1所述的一种疫苗中非特异性核酸内切酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述的NE反应体系为通用反应缓冲液或系列反应缓冲液；所述的通用反应缓冲液其成分包括Tris.HCl，浓度为lO-lOOmM，pH范围为5~9.5，还含有浓度为lmM-20mM的Ca2+、Zn2+或Mg2+ ;所述系列反应缓冲液指分别针对单一酶设计的缓冲液组分，每组2-5种，其区别在于设计不同的PH值，使同一样品在不同pH值下测定活性比，对照标准品获得酶种类信息；所述的突光探针为一寡聚核苷酸，两端分别标记一个报告突光基团和一个淬灭突光基团；探针完整时，报告荧光基团发射的荧光信号被淬灭荧光基团吸收；所述的荧光染料是指能特异性地掺入DNA双链，在激发光下发射荧光信号，而不掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信号的物质，当NE把DNA双链降解后，发射的荧光信号减弱。
5.根据权利要求4所述的一种疫苗中非特异性核酸内切酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述的通用反应缓冲液其成分包括Tris.HC1，浓度为20-50mM，pH范围为5.4~8.5，还含有浓度为2mM-10mM的 Ca2+、Zn2+或Mg2+。
6.根据权利要求4所述的一种疫苗中非特异性核酸内切酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述NE反应体系和荧光染料中，NE反应体系需事先加入DNA标准品，用量为l_500ng/μ I。
7.根据权利要求4所述的一种疫苗中非特异性核酸内切酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述的荧光探针为长度10_30bp的寡聚核苷酸序列，5’末端标记发色基团，包括但不限于FAM、TET、HEX、TAMRA, ROX、CY5、CY3、J0E，3’末端标记淬灭基团，包括但不限于BHQ-1、BHQ-2、Eclipse、DABCYL ;探针的使用量为每反应I μ M~20 μ M。
8.根据权利要求7所述的一种疫苗中非特异性核酸内切酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述的荧光探针的使用量为每反应2μ M~10 μ Μ。
9.根据权利要求4所述的一种疫苗中非特异性核酸内切酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述的荧光染料包括但不限于Pico green、SYBR系列荧光染料，荧光染料在NE反应体系中应用浓度为lng-100ng/100ul (0.1~10X)。
10.根据权利要求1-9任一权利要求所述的一种疫苗中非特异性核酸内切酶活性检测试剂盒，其特征在于，检测步骤如下:取反应缓冲液，加入荧光探针或荧光染料，放置冰上，3-5min后，加入酶样品；同时设置阳性对照和空白对照；放入荧光检测仪器，事先设定仪器温度为25°C或37°C，启动记录程序，记录20-30min内荧光信号变化。
【文档编号】C12Q1/68GK103540650SQ201210238082
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2012年7月11日 优先权日:2012年7月11日
【发明者】阮承迈, 孙卫华, 王志刚 申请人:北京合康源生物科技有限公司