一种依赖内切酶结合侧向层析的核酸等温检测技术和试剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种核酸检测技术，具体而言是一种依赖内切酶结合侧向层析的核酸等温检测技术和试剂。本发明所使用的双标记探针DNA分子在没有和目的核酸片段结合时，保持一种二级结构，没有特定的核酸内切酶的切点。而当双标记探针DNA分子能够和目的片段结合后，可改变二级结构，能够被特定DNA内切酶识别并切开。双标记探针DNA分子能够被对应的侧向层析试纸检测，内切酶切开的双标记探针DNA分子的片段则不能被检测。该方法具有识别序列较短，对引物位置要求较低，检测效率较高，DNA和RNA均能直接检测等特点。
【专利说明】
一种依赖内切酶结合侧向层析的核酸等温检测技术和试剂
技术领域
[0001] 本发明涉及一种核酸检测技术，具体而言是一种依赖内切酶结合侧向层析的核酸 等温检测技术和试剂。
[0002] 背景知识
[0003] 核酸等温检测技术是核酸体外检测技术的一种，其反应过程始终维持在恒定的温 度下，通过添加等温扩增DNA聚合酶和各自特异性引物以及其他辅助酶类或报告基团来达 到快速核酸扩增的目的。由于等温扩增的产物结构复杂，一般不适合用于分子克隆，主要用 于核酸体外诊断。核酸等温扩增技术由于不需要使用PCR仪等专用设备，因此适合在基层医 院和简易实验室中推广使用，因此近几年发展迅速。常见的等温扩增技术主要包括:环介导 核酸等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplif ication，LAMP)、滚环扩增技术 (Rolling Circle Amplification，RCA)、单引物等温扩增技术（Single Primer Isothermal Ampl if i cat ion，SPIA)、依赖解旋酶恒温扩增技术（Hel icase-dependent Isothermal DNA Amplification，HDA)、依赖核酸序列的扩增(Nucleic Acid Sequence Based Amplification，NASBA)、链替代扩增（Strand Displacement Amplification，SDA)、 快速等温检测放大技术（Rapid Isothermal Detection and Amplification，RIDA)、交叉 引物等温扩增（Cross priming amplification，CPA)等。
[0004] 上述方法可以分为三大类，第一类以RCA为代表的多步反应等温扩增检测方法，包 括RCA、SPIA等。该类方法的特点是在反应过程中先通过一步反应合成检测中间体，而后对 其进行等温扩增，实现核酸检测。以RCA为例，该技术是于1998年模拟自然界微生物环状DNA 的滚环复制过程，发展起来的一种放大信号和靶核酸相结合的检测方法。先根据引物特异 性，合成DNA环，作为等温扩增中间体，而后在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下由一条引 物与环形DNA模板的链置换合成，实现环状DNA模板的体外等温线性扩增。依据扩增过程中 加入的引物不同可分为线性扩增、指数扩增、多引物扩增和信号扩增等。该类检测方法的缺 点在于，需要多步反应才能得到检测结果，检测方法繁琐，费用较高，也较为费时，检测灵敏 度也较低。
[0005] 第二类，以LAMP为代表的多引物依赖于链置换酶活性的等温扩增检测技术，该类 技术主要包括LAMP、CPA等。上述技术的核心是通过巧妙的引物设计，不需要使用连接酶等 辅助酶直接通过扩增产生等温扩增中间体。进而依靠引物组扩增中间体上的特定片段，通 过检测扩增产物实现核酸检测。以LAMP为例，该方法针对靶基因的6个区域设计4种特异引 物，利用BstDNA聚合酶在等温条件下扩增出双发卡状中间体，进而进入循环实现链增长，最 终的产物为不同级数的扩增产物的混合物。反应产物可通过电泳或者根据扩增副产物焦磷 酸镁沉淀形成的浊度或者荧光染料进行判断。此类方法具有快速、高灵敏度的特点但是由 于气溶胶污染的原因，该类方法的假阳性结果较多，另外在进行引物设计时，要求目的片段 在300bp之内具有150bp左右的保守序列，引物设计繁琐，而且在高突变率的RNA病毒基因组 中，这样的序列是很难找到的，粗放的引物设计容易导致假阴性，这极大地限制了该方法的 应用。
[0006] 第三类，以RIDA为代表的不进行扩增的核酸检测技术。该类方法不依靠核酸扩增 产生检测信号，而通过分子灯标的方法进行检测。以RIDA为例，该方法通过核酸切刻酶的活 性，将和检测目的序列结合的分子灯标切开，产生荧光信号进行检测。该类方法由于核酸切 亥_种类有限，因此对目的序列限制较大。而且只能切亥IJDNA双链，不能直接检测RNA，因而 并没有得到广泛的应用。
[0007] 总之，核酸等温扩增技术在检验医学中体现出的最大的优势在于操作简单，检测 时间较短，不需要依赖大型设备等几个方面。而目前的等温检测方法依然存在着一些缺欠， 第一类技术方法由于需要在体系中加入连接酶、解旋酶等物质，需要多步反应完成，无法体 现出操作简便的优势。第二类方法则对目的片段的保守性要求过高，引物设计复杂，容易引 起气溶胶污染，其应用也受到了一定的限制。第三类方法还处于发展初期，RIDA方法需要切 刻酶参与对检测目的序列提出了更高的要求，也没有得到广泛的应用。
[0008] 综上所述，建立一种具有识别序列较短(类似于PCR反应识别2段特异性序列），对 引物位置要求较低，检测体系简单(一步完成），检测效率较高，检测目的核酸通用性强(DNA 和RNA均能直接检测)等特点的核酸等温检测技术，对有效的拓展核酸等温扩增技术的应用 范围具有重要的作用。特别是近年来即时检测技术(P〇CT，point-〇f-care testing)发展迅 速，本发明所开发的一种依赖内切酶结合侧向层析的核酸等温检测技术和试剂，可以不依 赖荧光PCR仪等大型设备进行检测。能够采样现场即刻进行分析，省去标本在实验室检验时 的复杂处理程序，从而快速得到检验结果的一种核酸检测方法，具有重要的临床意义。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的：
[0010] 本发明旨在建立一种依赖于内切酶活性的核酸检测技术具有识别序列较短(类似 于PCR反应识别2段特异性序列），对引物位置要求较低，检测体系简单(一步完成），检测效 率较高，检测目的核酸通用性强(DNA和RNA均能直接检测)仅使用一个恒温装置既可以完成 的依赖内切酶结合侧向层析的核酸等温检测技术和试剂。
[0011]本发明的技术原理：
[0012] DNA单链分子在水溶液中会根据其一级结构，折叠成特定的二级结构。决定二级结 构形态的因素在于DNA分子内、DNA分子间或者DNA和RNA分子间能够形成碱基互补配对。因 此当一种特定的D NA分子在溶液中时，它会保持一种二级结构；而当另一种能够和该D NA分 子形成碱基互补配对双键的核酸分子加入到该溶液中时，能够改变第一种DNA分子的二级 结构。
[0013] 本发明即是通过DNA分子的该特点设计的。本研究进行核酸检测使用的是DNA分子 探针，该探针DNA分子在没有和目的核酸片段结合时，保持一种二级结构（如图一所示），此 时在该结构上没有特定的核酸内切酶的切点。而当有目的核酸片段存在时，探针DNA分子能 够和目的片段结合改变其二级结构，此时形成了具有三段双链结构的"丫"字型的核酸分子 (如图二所示），其中两条双链为探针和目的核酸分子之间形成的，而另一条双链则为探针 DNA分子自己折叠形成的。在这条分子内折叠形成的双链上，具有能够被特定DNA内切酶识 别的识别位点和能够被该内切酶切开的酶切位点。
[0014] 当溶液中存在该内切酶时，探针DNA分子能够被内切酶切开。由于热力学的作用， 新的未被切开的探针DNA分子将替代被切开的分子和目的片段结合。该循环周而往复，溶液 中的探针DNA分子不断被切开，切开的探针分子和未被切开的探针分子能够通过琼脂糖凝 胶电泳进行区别分析，实现目的核酸片段的等温检测。当在探针DNA分子上进行荧光标记 后，还能够通过荧光检测装置检测出被切开的DNA分子，实现目的核酸片段的荧光等温检 测 。
[0015]本发明是通过以下技术方案实现的：
[0016] 1.探针DNA分子的设计
[0017] 本研究使用的探针DNA分子，需要至少具备以下功能，探针DNA分子在没有和目的 核酸片段结合时，保持一种二级结构，此时在该结构上没有特定的核酸内切酶的切点。而当 有目的核酸片段存在时，探针DNA分子能够和目的片段结合改变其二级结构，此时形成了具 有三段双链结构的"丫"字型的核酸分子，其中两条双链为探针和目的核酸分子之间形成 的，而另一条双链则为探针DNA分子自己折叠形成的，这条探针DNA分子自己折叠形成的双 链上，具有能够被特定DNA内切酶识别的识别位点和能够被该内切酶切开的酶切位点。
[0018] 而实现上述功能则可以通过以下设计实现，如将探针分为4个区域，从5 ' -3 '端分 别为区域I至区域IV。
[0019] 区域I为和检测目的片段中某些序列的反义互补片段，能够和检测目的片段形成 双链。
[0020] 区域II中包含能够与区域III反义互补形成双链的序列，而且在区域II和区域III 形成的DNA双链上具有能够被特定核酸内切酶识别的识别位点和能够被该核酸内切酶切开 的酶切位点，同时区域II中还含有能够和区域IV的部分序列反义互补形成双链的片段。
[0021] 区域III中包含有能够与区域II反义互补形成双链的序列，而且在区域II和区域 III形成的DNA双链上具有能够被特定核酸内切酶识别的识别位点和能够被该核酸内切酶 切开的酶切位点。
[0022]区域IV为和检测目的片段中某些序列的反义互补片段(不和区域I所针对的检测 目的片段中某些序列的反义互补片段重合），也能够和检测目的片段形成双链。另外该区域 中还包含有部分能够和区域II中的部分序列形成反义互补形成双链的片段。
[0023] 本发明中某一符合上述要求的探针DNA分子的序列和其中的不同区域如图一和图 二所示。
[0024] 还可以使用其他探针，并不需要完全仿照区域I-区域IV的功能设计，只需要能够 在目的片段不存在时维持一种二级结构，而当目的片段存在时和目的片段结合的DNA分子 能够产生由区域II和区域III所形成的能够被核酸内切酶识别并切开的分子内DNA双链即 可实现等温检测。
[0025] 2.标记DNA探针分子
[0026]合成探针DNA分子，分别在该探针DNA分子的5 '端和3 '端标记不同的具有抗原性的 基团如生物素、荧光素、地高辛等形成双标记探针。使用双蒸水将其稀释至lymol/L备用。
[0027] 3.检测标记探针的胶体金侧向层析试纸条的制备
[0028] (1)将一种特异性抗体A吸附于有色颗粒，在颗粒表面形成抗体包被;抗体A能够和 抗原A结合，抗原A可以是生物素、荧光素、地高辛或者是任意一种能够标记在DNA分子上的 能够具有抗原的基团的一种;有色颗粒选自胶体金颗粒、乳胶颗粒，将该物质制备成有色颗 粒结合物垫。
[0029] (2)将另一种特异性抗体B固定于层析膜上形成检测线，抗体B能够和抗原B结合， 抗原B可以是生物素、荧光素、地高辛或者是任意一种能够标记在DNA分子上的能够具有抗 原的基团的一种，但不能和抗体A所对应的抗原相同。
[0030] (3)待测核酸进行酶切时，探针使用对应于抗原A和抗原B分别在该探针DNA分子的 5 '端和3 '端进行标记，形成双标记探针。
[0031] (4)同时将抗抗体A的二抗，抗体C固定于层析膜上形成质控线。
[0032] (5)该试纸条包括在粘在带有不干胶的衬垫上按顺序粘贴的样品垫、有色颗粒结 合物垫、层析膜和吸水滤纸垫，上述各部分在相邻处部分重叠。
[0033] 4.酶切检测DNA探针分子
[0034] (1)取能够识别且切开探针DNA分子区域II和探针DNA分子区域III所形成的DNA分 子双链的核酸内切酶以及该酶的配套缓冲液备用。
[0035] (2)向一个PCR管中加入检测试剂包括该酶的配套缓冲液，lyL酶液，以及lyL双标 记探针DNA溶液。
[0036] (3)向该PCR管中加入待检测的核酸溶液lyL。
[0037] (4)根据缓冲液说明书补足双蒸水，形成检测混合物。
[0038] (5)使用一管仅含lyL内切酶液，内切酶配套缓冲液，lyL探针DNA溶液和双蒸水的 PCR管作为阴性对照，同时进行检测。
[0039] (6)根据所使用的核酸内切酶的最适反应温度（一般选用最适反应温度在50°C至 60°C的内切酶），在该温度下使用恒温装置孵育该检测混合物60分钟。
[0040] 5.酶切产物的侧向层析检测
[0041] (1)将酶切产物滴加在侧向层析试纸的样品垫上。
[0042] (2)含有双标记探针的酶切产物在侧向层析试纸上通过毛细管现象向吸水垫方向 层析。
[0043] (3)酶切产物中，如果探针没有被内切酶切开，则在经过有色颗粒结合物垫时与吸 附有色颗粒的抗体A结合，形成抗原B-探针-抗原A-抗体A-有色颗粒物复合物，得到的该复 合物在沿纤维膜向上流动至检测线时，与检测线上的抗体B结合，从而滞留在检测线上，形 成肉眼可见的有色线条。
[0044] 如果探针被内切酶切开，则在经过有色颗粒结合物垫时带有抗体A的探针片段与 吸附有色颗粒的抗体A结合，形成探针片段-抗原A-抗体A-有色颗粒物复合物，而带有抗体B 的探针片段不能与吸附有色颗粒的抗体A结合。上述混合物在沿纤维膜向上流动至检测线 时，带有抗体B的探针片段与检测线上的抗体B结合，滞留在检测线上，探针片段-抗原A-抗 体A-有色颗粒物复合物，不能与检测线上的抗体B结合，不能滞留在检测线上，不能形成肉 眼可见的有色线条。
[0045] (4)当酶切产物侧向层析至质控线时，如果探针没有被内切酶切开，其中所含的抗 原B-探针-抗原A-抗体A-有色颗粒物复合物，可以与质控线上的抗抗体A二抗结合，从而滞 留在检测线上，形成肉眼可见的有色线条。如果探针被内切酶切开，其中所含的探针片段-抗原A-抗体A-有色颗粒物复合物，可以与质控线上的抗抗体A二抗结合，从而滞留在检测线 上，形成肉眼可见的有色线条。
[0046] (5)检测完毕后，在滴加酶切产物后的5-10分钟之内观察检测结果，如果检测线和 质控线均形成肉眼可见的有色线条，则证明检测线上含有未被酶切的双标记DNA探针，质控 线上含有与抗体A结合的抗体复合物，从而表明酶切检测过程中，双标记探针没有检测到能 与其结合的目的片段，检测结果为阴性。如果检测线没有形成肉眼可见的有色线条，则证明 检测线上不含有未被酶切的双标记DNA探针，如果此时质控线上含有与抗体A结合的抗体复 合物，从而表明酶切检测过程中，双标记探针检测到能与其结合的目的片段，检测结果为阳 性。如果质控线没有形成肉眼可见的有色线条，则质控线上不含有与抗体A结合的抗体复合 物，侧向层析没有成功，需要重新进行检测。
【附图说明】
[0047] 图1本发明所使用的探针DNA分子未与目的片段结合时的模式图
[0048]图中所示此时探针DNA分子折叠成某一特殊二级结构，该结构上没有能够被特定 DNA内切酶识别的识别位点和能够被该内切酶切开的酶切位点。
[0049] 图2本发明所使用的探针DNA分子与目的片段结合时的模式图
[0050] 图中所示此时探针DNA分子与目的片段结合，改变其二级结构，此时形成了具有三 段双链结构的"丫"字型的核酸分子，其中两条双链为探针和目的核酸分子之间形成的，而 另一条双链则为探针DNA分子自己折叠形成的，在这条探针DNA分子自己折叠形成的分子内 双链上，具有能够被特定DNA内切酶识别的识别位点和能够被该内切酶切开的酶切位点。
[0051] 图3本发明实施例1检测结果
[0052] A可以看见检测线和质控线都有有色条带，为阴性检测结果;B可见质控线有有色 条带而检测线没有有色条带，为阳性检测结果。
[0053]图4本发明实施例2检测结果
[0054] A可见质控线有有色条带而检测线没有有色条带为，阳性检测结果;B可以看见检 测线和质控线都有有色条带，为阴性检测结果。
【具体实施方式】 [0055] 实施例1
[0056] 设计探针DNA分子1(以后简称为P1)
[0057] P1 的核苷酸序列为5'-CCACA CGCCT GATAA GCGTG TGGTT ACCTT TTGGT AACCA AGGTC GGTGG TTCGA-3'。
[0058] 该探针DNA分子的区域I的序列为5'-CGCCT GATAA GCGTG，该区域为和检测目的片 段中某些序列的反义互补片段，能够和检测目的片段形成双链。
[0059] 该探针分子的区域II序列为TGGTT ACC，该区域的序列中包含能够与区域III反义 互补形成双链的序列，而且在区域II和区域III形成的DNA双链上具有能够被特定核酸内切 酶识别的识别位点和能够被该核酸内切酶切开的酶切位点，同时区域II中还含有能够和区 域IV的部分序列反义互补形成双链的片段。
[0060] 该探针分子的区域III序列为TTTTG GTAAC CA，该区域的序列中包含有能够与区 域II反义互补形成双链的序列，而且在区域II和区域III形成的DNA双链上具有能够被特定 核酸内切酶识别的识别位点和能够被该核酸内切酶切开的酶切位点。
[0061] 该探针分子的区域IV序列为AGGTC GGTGG TTCGA，该区域的序列中包含和检测目 的片段中某些序列的反义互补片段(不和区域所针对的检测目的片段中某些序列的反义互 补片段重合），也能够和检测目的片段形成双链。另外该区域中还包含有部分能够和区域II 中的部分序列形成反义互补形成双链的片段。
[0062] 检验此探针的待测序列DNA中包含以下序列5'-GCGGA CTATT CGCAC TCCAG CCACC AAGCT-3'能够和探针DNA分子区域I和区域IV互补形成双链。
[0063] 检验此探针的待测序列RNA分子序列为5'-GCGGA CUAUU CGCAC UCCAG CCACC AAGCU-3'能够和探针DNA分子区域I和区域IV互补形成双链。
[0064] 2.标记DNA探针分子
[0065]合成探针DNA分子，分别在该探针DNA分子的5 '端标记生物素在3 '端标记荧光素 形成双标记探针。使用双蒸水将其稀释至lymol/L备用。
[0066] 2.检测标记探针的胶体金侧向层析试纸条的制备
[0067] (1)将鼠抗生物素抗体吸附于有色颗粒，在颗粒表面形成抗体包被;有色颗粒选为 胶体金颗粒，将该物质制备成有色颗粒结合物垫。
[0068] (2)将鼠抗荧光素抗体固定于层析膜上形成检测线。
[0069] (3)同时将羊抗鼠二抗，固定于层析膜上形成质控线。
[0070] (4)组装试纸条，该试纸条包括在粘在带有不干胶的衬垫上按顺序粘贴的样品垫、 有色颗粒结合物垫、层析膜和吸水滤纸垫，上述各部分在相邻处部分重叠。
[0071] 3.酶切检测DNA探针分子
[0072] (1)取能够识别且切开探针DNA分子区域II和探针DNA分子区域III所形成的DNA分 子双链的核酸内切酶Bst EII以及该酶的配套缓冲液备用。
[0073] (2)向一个PCR管中加入检测试剂包括该酶的配套缓冲液，lyL酶液，以及lyL双标 记探针DNA溶液。
[0074] (3)向该PCR管中加入待检测的核酸溶液lyL。
[0075] (4)根据缓冲液说明书补足双蒸水，形成检测混合物。
[0076] (5)使用一管仅含lyL内切酶液，内切酶配套缓冲液，lyL探针DNA溶液和双蒸水的 PCR管作为阴性对照，同时进行检测。
[0077] (6)根据所使用的核酸内切酶的最适反应温度60°C，在该温度下使用恒温装置孵 育该检测混合物60分钟。
[0078] 5.酶切产物的侧向层析检测
[0079] (1)将酶切产物滴加在侧向层析试纸的样品垫上。
[0080] (2)含有双标记探针的酶切产物在侧向层析试纸上通过毛细管现象向吸水垫方向 层析。
[0081] (3)5-10分钟之内观察检测结果，A检测条的质控线和检测线均形成肉眼可见的有 色线条，检测线上的有色线条证明检测线上含有未被酶切的双标记DNA探针，双标记探针没 有检测到能与其结合的目的片段，质控线上的有色线条表明检测结果有效，所以检测结果 为阴性。B检测条检测线没有形成肉眼可见的有色线条，质控线形成肉眼可见的有色线条， 检测线没有形成肉眼可见的有色线条，证明检测线上不含有未被酶切的双标记DNA探针，质 控线上的有色线条表明检测结果有效，检测结果为阳性。
[0082] 实施例2
[0083] 设计探针DNA分子2(以后简称为P2)
[0084] P2的核苷酸序列为5'-CGCCT GATAA GCGTG GAACT TCCGG ATCGA ACCAC CGATC CGGAG GTTCA GGTCG GTGGT TCGA-3，。
[0085] 该探针DNA分子的区域I的序列为5'-CGCCT GATAA GCGTG，该区域为和检测目的片 段中某些序列的反义互补片段，能够和检测目的片段形成双链。
[0086] 该探针分子的区域II序列为GAACT TCCGG ATCGA，该区域的序列中包含能够与区 域III反义互补形成双链的序列，而且在区域II和区域III形成的DNA双链上具有能够被特 定核酸内切酶识别的识别位点和能够被该核酸内切酶切开的酶切位点，同时区域II中还含 有能够和区域IV的部分序列反义互补形成双链的片段。
[0087] 该探针分子的区域III序列为ACCAC CGATC CGGAG GTTC，该区域的序列中包含有 能够与区域II反义互补形成双链的序列，而且在区域II和区域III形成的DNA双链上具有能 够被特定核酸内切酶识别的识别位点和能够被该核酸内切酶切开的酶切位点。
[0088] 该探针分子的区域IV序列为AGGTC GGTGG TTCGA，该区域的序列中包含和检测目 的片段中某些序列的反义互补片段(不和区域所针对的检测目的片段中某些序列的反义互 补片段重合），也能够和检测目的片段形成双链。另外该区域中还包含有部分能够和区域II 中的部分序列形成反义互补形成双链的片段。
[0089] 检验此探针的待测序列DNA中包含以下序列5'-GCGGA CTATT CGCAC TCCAG CCACC AAGCT-3'能够和探针DNA分子区域I和区域IV互补形成双链。
[0090] 检验此探针的待测序列RNA分子序列为5'-GCGGA CUAUU CGCAC UCCAG CCACC AAGCU-3'能够和探针DNA分子区域I和区域IV互补形成双链。
[0091] 2.标记DNA探针分子
[0092] 合成探针DNA分子，分别在该探针DNA分子的5'端标记地高辛在3'端标记生物素形 成双标记探针。使用双蒸水将其稀释至lymol/L备用。
[0093] 3.检测标记探针的胶体金侧向层析试纸条的制备
[0094] (1)将鼠抗地高辛抗体吸附于有色颗粒，在颗粒表面形成抗体包被;有色颗粒选为 胶体金颗粒，将该物质制备成有色颗粒结合物垫。
[0095] (2)将鼠抗生物素抗体固定于层析膜上形成检测线。
[0096] (3)同时将羊抗鼠二抗，固定于层析膜上形成质控线。
[0097] (4)组装试纸条，该试纸条包括在粘在带有不干胶的衬垫上按顺序粘贴的样品垫、 有色颗粒结合物垫、层析膜和吸水滤纸垫，上述各部分在相邻处部分重叠。
[0098] 3.酶切检测DNA探针分子
[0099] (1)取能够识别且切开探针DNA分子区域II和探针DNA分子区域III所形成的DNA分 子双链的核酸内切酶以及该酶的配套缓冲液备用。
[01 00] (2)向一个PCR管中加入检测试剂包括该酶的配套缓冲液，lyL酶液，以及lyL双标 记探针DNA溶液。
[0101] (3)向该PCR管中加入待检测的核酸溶液lyL。
[0102] (4)根据缓冲液说明书补足双蒸水，形成检测混合物。
[0103] (5)使用一管仅含lyL内切酶液，内切酶配套缓冲液，lyL探针DNA溶液和双蒸水的 PCR管作为阴性对照，同时进行检测。
[0104] (6)根据所使用的核酸内切酶的最适反应温度60°C，在该温度下使用恒温装置孵 育该检测混合物60分钟。
[0105] 5.酶切产物的侧向层析检测
[0106] (1)将酶切产物滴加在侧向层析试纸的样品垫上。
[0107] (2)含有双标记探针的酶切产物在侧向层析试纸上通过毛细管现象向吸水垫方向 层析。
[0108] (3)5-10分钟之内观察检测结果，A检测条检测线没有形成肉眼可见的有色线条， 质控线形成肉眼可见的有色线条，检测线没有形成肉眼可见的有色线条，证明检测线上不 含有未被酶切的双标记DNA探针，质控线上的有色线条表明检测结果有效，检测结果为阳 性。B检测条的质控线和检测线均形成肉眼可见的有色线条，检测线上的有色线条证明检测 线上含有未被酶切的双标记DNA探针，双标记探针没有检测到能与其结合的目的片段，质控 线上的有色线条表明检测结果有效，所以检测结果为阴性。
【主权项】
1. 一种依赖内切酶结合侧向层析的核酸等温检测技术和试剂，其特征在于这种依赖核 酸内切酶活性的核酸等温检测技术使用一种特殊的探针DNA分子，该探针DNA分子在没有和 目的核酸片段结合时，在溶液中保持一种二级结构，此时在该结构上没有特定的核酸内切 酶的切点。2. 根据权利要求1所述的一种依赖内切酶结合侧向层析的核酸等温检测技术和试剂， 其特征在于，这种依赖核酸内切酶活性的核酸等温检测技术使用一种特殊的探针DNA分子， 当有目的核酸片段存在时，探针DNA分子能够识别目的片段上的特异性序列和其互补配对 形成双链结构从而改变探针DNA分子的二级结构，此时形成了至少具有三段双链结构的的 核酸分子，且其中两条双链为探针和目的核酸分子之间形成的，而另一条双链则为探针DNA 分子自己折叠形成的，这条探针DNA分子自己折叠形成的分子内双链上，具有能够被特定 DNA内切酶识别的识别位点和能够被该内切酶切开的酶切位点，形成检测中间体。3. 根据权利要求1所述的一种依赖内切酶结合侧向层析的核酸等温检测技术和试剂， 其特征在于使用能够识别检测中间体上由探针DNA分子自己折叠形成的分子内双链上的识 别位点的内切酶，在该双链上的酶切位点位置切开探针DNA分子。4. 根据权利要求1所述的一种依赖内切酶结合侧向层析的核酸等温检测技术和试剂， 其特征在于被核酸内切酶切开的探针DNA分子能够在适合的温度下，即50°C至60°C之间从 待测的核酸片段上解离下来，而待测片段重新和另一个探针DNA分子结合，开始一个新的结 合-重构-酶切-解离的过程。检测解离下来的探针DNA分子片段，作为目的核酸存在的依据。5. 根据权利要求1所述的一种依赖内切酶结合侧向层析的核酸等温检测技术和试剂， 其特征在于该技术即可以用于检测DNA分子也可以用于检测RNA分子，即和探针DNA分子结 合的目的核酸片段即可以是DNA分子也可以是RNA分子。6. -种依赖内切酶结合侧向层析的核酸等温检测试剂，其特征在于，合成探针DNA分 子，分别在该探针DNA分子的5'端和3'端标记不同的抗原基团，如生物素、荧光素或者其他 具有抗原性的基团如地高辛等，形成双标记探针。7. 根据权利要求6所述的一种依赖内切酶结合侧向层析的核酸等温检测试剂，其特征 在于，检测试剂的组成中至少包括以下成分:双标记探针DNA分子，反应终浓度为0.05μπι 〇1/ L，该分子形成的检测中间体上有能够被某一核酸内切酶识别的识别位点和能够被该酶切 开DNA分子的酶切位点；核酸内切酶，含量为2U至IOU，该核酸内切酶能够识别同一反应物中 的探针DNA分子形成DNA双链，且能够切开该DNA双链;能够保证该核酸内切酶活性的缓冲液 成分;待检测核酸样本。8. 根据权利要求6所述的一种依赖内切酶结合侧向层析的核酸等温检测试剂，其特征 在于，检测的方法为将检测混合物在50°C至60°C下使用恒温装置孵育该检测混合物1小时， 反应温度需要参考该检测混合物中核酸内切酶的最适反应温度;孵育结束后将酶切混合物 滴加在胶体金侧向层析试纸上，通过侧向层析判定检测结果。9. 一种依赖内切酶结合侧向层析的核酸等温检测试剂所使用的侧向层析试纸，其特征 在于，将一种特异性抗体A吸附于有色颗粒，在颗粒表面形成抗体包被，抗体A是指能够和检 测试剂中双标记探针中的一个标记抗原结合的抗体，有色颗粒选自胶体金颗粒、乳胶颗粒， 将该物质制备成有色颗粒结合物垫;将另一种特异性抗体B固定于层析膜上形成检测线，抗 体B是指能够和检测试剂中双标记探针中的另一个标记抗原结合的抗体;将抗抗体A的二 抗，即抗体C固定于层析膜上形成质控线;该侧向层析试纸包括在粘在带有不干胶的衬垫上 按顺序粘贴的样品垫、有色颗粒结合物垫、层析膜和吸水滤纸垫，上述各部分在相邻处部 分重叠。10.根据权利要求9,一种依赖内切酶结合侧向层析的核酸等温检测试剂所使用的侧向 层析试纸，其特征在于，进行检测结果判定时在滴加酶切产物后的5-10分钟之内观察检测 结果，如果质控线没有形成肉眼可见的有色线条，则质控线上不含有与抗体A结合的抗体复 合物，侧向层析没有成功，需要重新进行检测;在质控线形成肉眼可见的有色线条时，如检 测线也形成肉眼可见的有色线条，则证明检测线上含有未被酶切的双标记DNA探针，检测结 果为阴性;如果检测线没有形成肉眼可见的有色线条，则证明检测线上不含有未被酶切的 双标记DNA探针，检测结果为阳性。
【文档编号】C12Q1/68GK105950710SQ201610220408
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年4月7日
【发明人】刘寅, 祁军
【申请人】南开大学