一种t7核酸内切酶i的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种核酸内切酶的制备方法。
【背景技术】
[0002] T7核酸内切酶I是一种多功能核酸酶，可特异识别并拆分重组中间体（Holiday Junction，HJ)交叉结构，随机切刻双链DNA，特异识别并切割双链DNA中的切刻和单碱基错 配位点。
[0003] 该酶蛋白是T7噬菌体基因3编码产物，由包含149个氨基酸残基的多肽链构成， 两条肽链通过结构域交换形成同源二聚体，其催化中心由来自两个亚基的氨基酸侧链共同 组成，两个催化结构域可以独立作为DNA切刻酶；通过结构域之间的协同作用，表现出结构 特异性催化。作为一种已知的噬菌体类解离酶，该酶可以剪切分叉DNA，随机切刻线性DNA， 识别并切刻nicked-DNA位点，识别单碱基错配位点，T7核酸内切酶I对HJ的结合具有高 度特异性，其结合HJ的能力是结合线性双链DNA的1000倍左右，还具备随机在双链DNA中 引入切刻位点的活性，专一性识别切刻位点并在另一条DNA链上对应位置引入另一切刻位 点导致DNA双链的断裂，专一性识别并切割DNA双链中的单碱基错配位点。该酶应用广泛， 具有作为工具酶的重要价值。主要的商业用途包括：可用于分支DNA结构的解离，基因组测 序技术和DNA-shuffling技术中DNA的前处理，SNP的检测等。
[0004] 目前制备T7核酸内切酶的方法是：将蛋白分别表达合成出两段肽链，在体外融合 而成。采用頂PACT-TWIN蛋白纯化系统纯化与MBP融合表达的截短型无活性T7核酸内切 酶I(tT7Endo I)，该融合蛋白的C-端带有硫酯键。然后体外合成一段合成肽，其中含有被 前者截下来的氨基酸，将该合成肽与融合蛋白的C-端硫酯键相连接，形成全长具有活性的 ?7核酸内切酶I。最后，再用因子Xa将MBP融合头切去，纯化得到全长的野生型T7核酸内 切酶I。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种核酸内切酶的制备方法，该方法操作简便、易于规模 化生产，并能有效节约成本。
[0006] 本发明所述的一种T7核酸内切酶的制备方法，包括以下步骤：
[0007] (a) T7核酸内切酶的表达载体的构建；
[0008] (b)将不含有终止密码子的编码序列插入到步骤a所获得的蛋白表达载体中；以 及
[0009] (c)采用与标签相适应的纯化方法，获得目标蛋白质即T7核酸内切酶。
[0010] 根据本发明所述的17核酸内切酶的制备方法的进一步特征，所述表达载体包括： 用于插入目的蛋白即?7核酸内切酶的编码序列的识别和切割位点；在所述识别和切割位 点的上游具有如SEQ ID N0:1所示的gills信号肽编码序列，其前面是起始密码子；在所述 识别和切割位点的下游具有His6标签，其后面是终止密码子。
[0011] 优选地，所述的识别和切割位点为BsaI识别及切割位点。
[0012] 本发明的优点在于：构建N端带M13噬菌体蛋白III的前导序列（gills)的载体， 合成出来的信号肽能引导蛋白分泌出核外，在细胞周质中表达，对细胞本身的基因组无毒 性，故能直接在体内表达出可溶并有生物活性的T7核酸内切酶I。这种生产方法简便易操 作，易于规模化生产，并能有效节约成本。
[0013] 经实验表明，本发明所述方法获得的T7核酸内切酶I能特异地识别DNA片段中不 匹配的位点，并在这此位点附近进行切割。其切割效率与商品化的T7核酸内切酶I相当， 活性良好。相比于现有技术，本发明所述方法操作更为简便、易于规模化生产，并能有效节 约成本。
【附图说明】
[0014] 图1是T7核酸内切酶I的NI柱层析电泳图；图中，S :层析前样品；X :穿过样品； Elution :线性洗脱收集峰。
[0015] 图2是T7核酸内切酶I的H印arin柱层析电泳图；图中，S :层析前样品；X :穿过 样品；Elution :线性洗脱收集峰。
[0016] 图3是T7核酸内切酶I的Hitrap SPP柱层析电泳图；图中，S :层析前样品；X :穿 过样品；Elution :线性洗脱收集峰。
[0017] 图4是反应产物用于琼脂糖凝胶电泳图；图中，M :100-3000bp DNA Marker ;1 :加 入NEB T7核酸内切酶I (NEB Catalog#M0302)的阳性对照；2 :加入纯化后的T7核酸内切 酶I ;3 :不加任何酶，加入ddH20作为阴性对照；圆点：T7核酸内切酶I识别后切开所形成 的条带，长度分别在480bp及330bp左右。
【具体实施方式】
[0018] 以下合通过具体实施例结合附图的方式对本发明做进一步说明，目的在于本发明 的内容而非限制发明的保护范围。下面实施例中，除非特别注明试验方法的具体条件，通 常按照常规条件，如Sambrook等人著的《分子克隆：试验指南》（New York, Cold Spring Habour Laboratory Press)中所述条件，或按照制造厂商建议条件进行。实验所需菌种、质 粒、试剂等均为商品化产品，均可通过生物制品厂商购买获得。
[0019] 实施例1 :T7核酸内切酶I的制备
[0020] 制备方法：将T7基因的编码序列构建表达克隆，于大肠杆菌中表达，重组蛋白经 过层析纯化后，获得目标蛋白。
[0021] 具体流程如下：
[0022] (1)构建带BsaI酶切位点的pET28-gIIIs表达载体
[0023] 在pET28表达载体XhoI酶切位点上游加入一个BsaI识别及切割位点 (5'-GGTCTCT/AGGT-3'），并在BsaI位点的上游加上起始密码子ATG和gllIs信号肽编码序 列，信号肽氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0024] SEQ ID NO:1KKLLFAIPLVVPFYSHS
[0025] (2)构建含基因片段的表达克隆
[0026] 设计含有BsaI酶切位点的上游引物（SEQ ID NO: 2)和XhoI (SEQ ID NO. 3)酶切 位点的下游引物，从大肠杆菌T7噬菌体基因组中进行PCR扩增，获得459bp含有T7核酸内 切酶I基因编码序列的插入片段，其开放阅读框中不含有终止密码子。用BsaI和XhoI两 个内切酶对片段及载体进行酶切，酶切之后的片段与载体含有相同的粘性末端。
[0027] SEQ ID NO:25' -atatatGGTCTCgTAGCatggcaggttacggcgct-3'
[0028] SEQ ID NO. 35，-atatatCTCGAGtttctttcctcctttcctttttaa-3'
[0029] 用T4DNA连接酶连接插入片段和pET28载体。插入片段开放阅读框的下游包含有 一个His6标签，以用于下游Ni柱纯化。His6标签后含有一个终止密码子TGA。连接产物 进行转化到E. Coli2Tl感受态，在LB培养基上37°C过夜培养。通过鉴定后筛选出正确的转 化子在LB液体培养基中扩大培养。
[0030] (3)收集菌液，细胞沉淀悬浮缓冲液A (20mMTris、50mM Nacl、2. 5%甘油，PH7. 0)和 2X OTG等体积混合的溶液中，然后以大约18000psig通过高压破碎机，裂解物于12000rmp 离心40min后收集上清。上清按1000:1的比例加入Polyethylenimine充分混匀30分钟， 12000rmp离心40分钟收集上清过0. 22 μ m滤膜。
[0031] (4)将上清加到已用缓冲液A平衡好的Histrap-Ni柱上。用缓冲液A冲平基线， 然后用0_500mM的Imidazole线性梯度洗脱收集。对各收集组份进行SDS-PAGE检测（图 1 )，收集含目的蛋白的组份。
[0032] (5)含目的蛋白的组份被汇集到一起，将样品上样到已经平衡好的！feparin柱子 上。用缓冲液A冲平基线，然后用O-IM的Nacl线性洗脱。对各收集组份进行SDS-PAGE检 测（图2)，收集含目的蛋白的组份。
[0033] (6)将上述各组份汇集到一起透析到缓冲液A后，样品上样到已用缓冲液A平衡好 的Hitrap SPP柱子上。用缓冲液A冲平基线，然后用O-IM的Nacl线性洗脱。对各收集组 份进行SDS-PAGE检测（图3)，收集含目的蛋白的组份。
[0034] (7 )将上述各组份汇集到一起透析到贮存缓冲液（200mM Nac I、20mMTri s-Hc 1 PH7.5、0.01mM EDTA、lmM DTT、0.15%TritonX-100、50%Glycerin)。纯化后的酶在-2(TC保 存。
[0035] 实施例2 :T7核酸内切酶I的活性检测
[0036] 设计两个含有10个碱基差异的克隆，取相同的上游和下游引物进行扩增，得到一 对有10个碱基不匹配的PCR产物。序列见SEQ ID NO :4及SEQ ID NO :5。
[0037] 将两种PCR产物等量混合，在含有IX缓冲液（50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgC121mM DTT，pH7.9@25°C)中95°C变性5min，再退火至室温，形成具有一个重组中间体 (HJ)的产物。在上述退火体系中加入IU实施例1所制备的T7核酸内切酶I，37°C孵育1小 时。以NEB T7核酸内切酶I (Catalog#M0302)为阳性对照（PC)，并设置不加酶的阴性对照 (NC)。反应结束后加入含有SDS的上样缓冲液终止反应。反应产物用于琼脂糖凝胶电泳， 结果见图4。
[0038] 结果分析表明：本发明所述方法得到的T7核酸内切酶I能特异地识别DNA片段 中不匹配的位点，并在这此位点附近进行切割。其切割效率与商品化的T7核酸内切酶I相 当，证明其活性保持良好。
【主权项】
1. 一种17核酸内切酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (a) 17核酸内切酶的表达载体的构建； (b) 将不含有终止密码子的编码序列插入到步骤a所获得的蛋白表达载体中；以及 (c) 采用与标签相适应的纯化方法，获得目标蛋白质即17核酸内切酶。2. 根据权利要求1所述的17核酸内切酶的制备方法，其特征在于，所述表达载体包 括： 用于插入目的蛋白即17核酸内切酶的编码序列的识别和切割位点； 在所述识别和切割位点的上游具有如SEQ ID NO: 1所示的gills信号肽编码序列，其 前面是起始密码子； 在所述识别和切割位点的下游具有His6标签，其后面是终止密码子。3. 根据权利要求2所述的17核酸内切酶的制备方法，其特征在于：所述的识别和切割 位点为BsaI识别及切割位点。
【专利摘要】本发明涉及一种核酸内切酶的制备方法。本发明所述的一种T7核酸内切酶的制备方法，包括以下步骤：（a）T7核酸内切酶的表达载体的构建；（b）将不含有终止密码子的编码序列插入到步骤a所获得的蛋白表达载体中；以及（c）采用与标签相适应的纯化方法，获得目标蛋白质即T7核酸内切酶。本发明所述方法获得的T7核酸内切酶I的切割效率与商品化的T7核酸内切酶I相当，活性良好。本发明所述方法操作更为简便、易于规模化生产，并能有效节约成本。
【IPC分类】C12N15/70, C12N9/22
【公开号】CN104974993
【申请号】CN201410141111
【发明人】李华平, 张金阔, 钱柳青, 范名俊, 朱苗苗
【申请人】广州复能基因有限公司
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2014年4月9日