包含gm-csf的汉坦病毒样颗粒及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种疫苗，具体涉及一种包含GM-CSF的汉坦病毒样颗粒及其制备方 法与应用。
【背景技术】
[0002] 肾综合征出血热（Hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)是由汉坦病毒 引起的急性病毒性传染病，该病危害严重，病死率高，中国是世界上肾综合征出血热疫情最 严重的国家，目前，对于该病尚无特异有效的治疗药物，主要靠疫苗进行预防。国内虽已研 制出肾综合征出血热灭活病毒疫苗，但是该类疫苗刺激机体产生中和抗体滴度较低，不能 有效刺激机体产生细胞免疫应答，此外，原代细胞和脑组织灭活疫苗的材料多来源于动物， 而动物饲养的质量控制问题，尤其是潜在的动物病毒对人体的可能危害是需要解决的关键 问题。随着生物技术的发展，现已涌现出有多种疫苗研制的方法。
[0003] 病毒样颗粒（Virus-like particle, VLP)是病毒复制过程中自然产生或通过基 因工程表达病毒结构蛋白并自行组装出的不含病毒核酸的颗粒样物质，除核酸外其结构与 来源病毒基本一致，并具有与病毒最接近的抗原结构和免疫学特性。VLP的这种特点使其在 疫苗的研宄中倍受青睐。现在常用昆虫细胞表达系统制备VLP，但是对于多个蛋白组成的 VLP，需要制备表达各个蛋白的杆状病毒，再将这些杆状病毒以不同的比例共同感染昆虫细 胞，包装出所需要的VLP，由于重组杆状病毒在表达中必不可少，产品中混合的杆状病毒为 后期纯化带来一定的困难。另外，昆虫细胞表达系统糖基化与哺乳动物细胞仍有差别，这可 能会影响后期的免疫效果。而哺乳动物细胞表达系统由于翻译后修饰、蛋白折叠等过程的 高保真性，成为最广泛应用于VLP研宄和工业生产的表达系统。哺乳动物细胞适用于各类 复杂的包膜VLP的表达，并且其表面的蛋白组成与原病毒最为接近。此外，哺乳动物细胞可 通过筛选构建稳定表达VLP的细胞系，有利于疫苗的研宄和工业化生产。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供包含GM-CSF的汉坦病毒样颗粒及其制备方法与应用，作为 肾综合征出血热的预防疫苗。
[0005] 本发明所采用的技术方案是： 包含GM-CSF的汉坦病毒样颗粒的制备方法，其特征在于： 基于哺乳动物细胞表达系统能够正确折叠、组装和翻译后修饰蛋白的特点，通过构建 真核表达载体，共转染dhff CHO细胞，组装含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒。
[0006] 所述制备方法由以下步骤实现： 步骤一：载体构建： 将汉坦病毒76-118株核衣壳蛋白S基因克隆入pCI-neo载体CMV启动子下，构建S基 因表达载体； 将汉坦病毒76-118株糖蛋白M基因克隆入pCI-neo载体CMV启动子下，GM-CSF基因 克隆入SV40启动子下，构建M基因和GM-CSF基因的共表达载体； 步骤二：含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒的制备： 将步骤一得到的两种载体各10 μ g共转染dhfr_ CHO细胞，于培养基培养24 h后弃去 维持培养基，PBS洗涤三次后加入无血清筛选培养基，48 h后收集含有VLP的培养上清；经 蔗糖密度梯度离心纯化后，低温保存。
[0007] 步骤二中，培养基为含10%FBS、100nM MTX、0.1 mM次黄嘌呤、0. 016mM胸腺嘧啶的 IMDM培养基。
[0008] 步骤二中，无血清筛选培养基为含500 nM MTX、800 μg/ml G418的Hycell培养基。 [0009] 如所述的包含GM-CSF的汉坦病毒样颗粒的制备方法制得的病毒样颗粒。
[0010] 如所述的包含GM-CSF的汉坦病毒样颗粒在制备肾综合征出血热预防疫苗方面的 应用。
[0011] 本发明具有以下优点： 1、通过构建真核表达载体，使嵌合VLP的各个组分均能表达，在细胞内能组装出结构 正确的含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒并释放至培养上清中，GM-CSF分子锚定在病毒样颗 粒的包膜上，从而可以有效发挥免疫增强作用。
[0012] 2、构建的真核表达载体上含有多个筛选标记，通过筛选可以建立稳定表达病毒样 颗粒的细胞株，便于大规模生产和制备。
[0013] 3、本发明制备的含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒，免疫小鼠后可以有效刺激产生 体液免疫和细胞免疫应答，并且对病毒感染的小鼠有保护作用，可用于汉坦病毒感染的预 防。
【附图说明】
[0014] 图1为含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒载体构建示意图。
[0015] 图2为间接免疫荧光检测糖蛋白GP和GM-CSF的表达。
[0016] 图3为含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒的透射电镜检查结果（A.转染细胞样品； B.细胞培养上清)。
[0017] 图4为含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒的Western-blot检测结果。
[0018] 图5为含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒免疫后小鼠血清中特异性抗体的检测。
[0019] 图6为含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒免疫后小鼠血清中中和抗体的检测。
[0020] 图7为含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒免疫后小鼠脾细胞细胞因子分泌水平检测。
[0021] 图8为含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒免疫后小鼠脾细胞CTL杀伤活性检测。
[0022] 图9为含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒免疫小鼠经汉坦病毒（HTNV 76-118)攻击 后脏器组织中病毒抗原的ELISA检测结果。
[0023] 图10为含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒免疫小鼠经汉坦病毒（HTNV 76-118)攻击 后脏器组织中汉坦病毒核酸的qRT-PCR检测结果（A.心脏B.肝脏C.脾脏D.肺脏E.肾 脏F.脑)。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细的说明。
[0025] 汉坦病毒是单负链RNA病毒，其基因组包括L、M、S三个片段，分别编码病毒RNA依 赖的RNA聚合酶、包膜糖蛋白Gn和Gc以及核衣壳蛋白。包膜糖蛋白和核衣壳蛋白都是诱 导机体免疫应答的主要结构蛋白，糖蛋白可刺激机体产生中和抗体，在机体的保护性体液 免疫应答中起主要作用，但其免疫原性弱，刺激机体细胞免疫应答的能力较弱；核衣壳蛋白 的免疫原性较强，但不能有效刺激机体产生中和抗体。本发明中利用真核表达系统，在哺乳 动物细胞表达一种含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒，其组成正确，在小鼠体内能够有效地刺 激产生体液免疫和细胞免疫应答，且对病毒感染的小鼠具有一定的保护作用。
[0026] 本发明涉及的包含GM-CSF的汉坦病毒样颗粒的制备方法，基于哺乳动物细胞表 达系统能够正确折叠、组装和翻译后修饰蛋白的特点，通过构建真核表达载体，组装含有 GM-CSF的汉坦病毒样颗粒，具体由以下步骤实现： 步骤一：载体构建： 将汉坦病毒76-118株核蛋白S基因克隆入pCI-neo载体CMV启动子下，构建S基因表 达载体（图1中A载体）； 将汉坦病毒76-118株糖蛋白M基因克隆入pCI-neo载体CMV启动子下，GM-CSF基因 克隆入SV40启动子下，构建M基因和GM-CSF-GPI基因的共表达载体（图1中B载体）； 上述两个载体具有如下特征： 1、在启动子区使用了增强转录的调控序列EASE2. 1，该序列可使转录活性提高70%，从 而提尚目的蛋白的表达量。
[0027] 2、由于GM-CSF是可溶性蛋白，不在膜表面表达，故在其3'端添加⑶59的膜锚定 区基因片段，使GM-CSF表达在细胞膜表面。
[0028] 3、表达M基因的载体切除了 G418抗性筛选基因，将GM-CSF-GPI基因构建在该 位置上，GM-CSF和糖蛋白M基因同时表达，使GM-CSF锚定在包装出的VLP包膜上，有利于 GM-CSF发挥免疫佐剂的作用，增强VLP所诱导的免疫应答；表达S基因的载体对G418抗性 基因进行了 E182D突变，以利于筛选高表达细胞株。
[0029] 4、在载体中使用了内核糖体进入位点（IRES)，利用IRES分段表达二氢叶酸 还原酶（DHFR)。表达S基因的载体只表达DHFR1-105氨基酸，表达M基因的载体只表达 DHFR105-187氨基酸，这样可高效迅速地筛选稳定表达汉坦病毒嵌合VLP的细胞株，而且在 MTX加压扩增过程中，有利于目的基因以等摩尔比例扩增，有利于进一步提高表达量，组装 出结构完整的VLP。
[0030] 5、针对DHFR进行了 L22R的突变，和野生型DHFR相比，降低了与MTX的亲和力也 降低了活性，在达到筛选高效表达目的蛋白细胞株的同时使该表达系统可以在含有野生型 DHFR的细胞中进行MTX筛选，适用于更多的细胞类型。
[0031] 步骤二：汉坦病毒样颗粒的制备： 将步骤一得到的两种载体各10 μ g共转染dhfr_ CHO细胞，于培养基培养24 h后弃去 维持培养基，PBS洗涤三次后加入无血清筛选培养基，48 h后收集含有VLP的培养上清；离 心去除细胞碎片及大的蛋白聚集体后，经蔗糖密度梯度离心纯化后，低温保存。
[0032] 上述培养基为含10%FBS、100nM MTX、0.1 mM次黄嘌呤、0. 016mM胸腺嘧啶的頂DM培 养基。
[0033] 上述无血清筛选培养基为含500 ηΜ ΜΤΧ、800 μ g/ml G418的Hycell培养基。
[0034] 所制得的病毒样颗粒可应用于制备肾综合征出血热的预防疫苗。
[0035] 、电镜观察VLP: 细胞转染后48 h将细胞用胰蛋白酶消化后，装入1.5 ml离心管，1000 rpm离心5 min， 弃上清，在细胞沉淀中加入戊二醛固定液。70%、80%、90%丙酮及纯丙酮梯度脱水处理，并制 成包埋样品，超薄切片后苯胺黑染色。在电镜下观察细胞样品中的VLP的大小及形态。另 取纯化后的VLP分别滴一小滴于铜网上，室温放置90s，再滴一小滴磷钨酸染色液于VLP液 体中，小心吸去多余液体，室温静置待其固定后在进行电镜下观察，以观察上清中的VLP。
[0036] 、Western-blot 检测： 在经纯化的各组VLP样本中加入10X SDS-PAGE loading buffer和β-巯基乙醇，混 勾后沸水浴5 min处理样品和预染蛋白marker。取处理过的样品40 μL加入蛋白凝胶进行 SDS-PAGE分析，160 V电泳50 min。电泳结束后取与凝胶相应大小的PVDF膜用电转仪进 行转膜，100 V电转45 min。电转完毕后将印迹有蛋白的PVDF膜放入含5% BSA的PBST封 闭液中，室温封闭2 h。加入稀释好的抗病毒包膜糖蛋白和核衣壳蛋白的抗体以及GM-CSF 多抗（Gn mAb 和 Ge mAb 分别检测 Gn 和 Gc，1A8