装甲rna病毒样颗粒表达后菌体的裂解试剂、纯化试剂及其应用
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，尤其涉及装甲RNA病毒样颗粒表达后菌体的裂解试剂、纯化试剂及其应用。本发明提供的试剂包括超声试剂和纯化试剂，超声试剂用于表达后菌体的重悬和超声破碎，纯化试剂用于破碎后释放的装甲RNA病毒样颗粒的超滤纯化。实验表明，采用本发明提供的超声试剂和纯化试剂对装甲RNA病毒样颗粒局具有良好的纯化效果，所得装甲RNA病毒样颗粒进行RT?PCR表现出良好的扩增曲线，进行PCR则未见非特异性扩增。证明所得病毒样颗粒具有良好的纯度，能够作为标准品使用。
【专利说明】
装甲RNA病毒样颗粒表达后菌体的裂解试剂、纯化试剂及其 应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及装甲RNA病毒样颗粒表达后菌体的裂解试剂、 纯化试剂及其应用。
【背景技术】
[0002] 随着社会的发展，人们对健康越来越重视，其中就涉及到病原微生物的诊断，病毒 的检测是其主要的一个方面，主要包括病毒抗原的检测和病毒核酸的检测。进行核酸诊断 试剂的研制，为了评价其性能，不可避免的会用到企业参考品。大多数病毒为RNA病毒，其核 酸诊断试剂的参考品必须包含其核酸，若能以病毒颗粒作为其参考品，可以很好的评价该 诊断试剂的性能，但由于病毒临床样本量少，且不易获得，使得参考品的制备更加困难，且 不能保证其稳定性，运输困难。若以裸露的RNA作为参考品，可以解决样本量少的难题。但由 于环境中Rnase的存在，使得裸露的RNA不稳定，易于降解。还有一种方式就是将RNA保护起 来，使其具有耐RNase特性，其中装甲RNA病毒样颗粒就是一种有效可行的方法。装甲RNA病 毒样颗粒具有耐RNase特性，稳定性好，且易于制备，便于定量，可实现大规模生产，使其作 为RNA类核酸诊断试剂的参考品具有明显优势。
[0003] 装甲RNA病毒颗粒制备的技术路线主要有两种：单质粒表达系统和双质粒表达系 统。这两种方式都是基于MS2噬菌体的假病毒颗粒的制备方法。前者将MS2噬菌体的衣壳蛋 白和成熟酶蛋白基因与目的基因的序列整合到一个表达质粒中，将其转染大肠杆菌进行表 达。后者将MS2噬菌体衣壳蛋白和成熟酶蛋白整合到一个表达载体上，将目的基因序列整合 到另一个与之相容的载体上，将构建的两个载体共转染大肠杆菌得到双质粒表达系统。无 论采用哪种技术路线表达的装甲RNA病毒样颗粒均涉及到残留在细胞裂解中菌体基因组和 质粒以及未成功包装的RNA的去除，才能获得纯净的装甲RNA病毒样颗粒。目前，病毒样颗粒 的常用纯化方法主要有:氯仿抽提法、超速离心法、超滤法、分子筛等，四种方法得到的装甲 RNA病毒颗粒均有大量DNA的残留，严重影响其质量，使其不能达到作为参考品的要求。因 此，要得到高纯度的装甲RNA病毒样颗粒纯化是关键。一般采取的方式是用DNase和RNase进 行消化去除残留的DNA，但是，大部分情况下这些核酸不易被去除，原因在于有些核酸缠绕 在蛋白分子表面，形成核酸-蛋白复合物，使得Dnase和Rnase不易与这类核酸结合发挥其功 能，因此，获得纯净的装甲RNA病毒样颗粒的关键就在于如何将这些核酸从核酸-蛋白复合 物中解离出来，使其游离于溶液中。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供装甲RNA病毒样颗粒表达后菌体的 裂解试剂、纯化试剂及其应用。以本发明提供的裂解试剂和纯化试剂对装甲RNA病毒样颗粒 进行纯化效果良好，所得产品纯度高。
[0005] 本发明提供了一种超声试剂，包括Tris-HCl、Na2S〇4、KCl、DTT、EDTA、甘油和Triton x-100〇
[0006] 本发明提供的超声试剂中各组分的含量为：
[0007]
[0008]在一些实施例中，超声试剂中各组分的含量为：
[0009]
[0010] 在一些实施例中，超声试剂中各组分的含量为：
[0013]在一些实施例中，超声试剂中各组分的含量为：
[0011]
[0012]
[0014]
[0015] 本发明超声试剂中采用的Tr is-HCl的pH值为8.0。
[0016] 本发明提供的超声试剂在裂解装甲RNA病毒样颗粒表达菌体中的应用。
[0017] 本发明还提供了一种纯化试剂，其中包括Tris-HCl、NaCl、MgCl2、DTT和亚精胺。
[0018] 本发明提供的纯化试剂中各组分的含量为：
[0019]
[0020] 在一些实施例中，纯化试剂中各组分的含量为：
[0021]
[0022] 在一些实施例中，纯化试剂中各组分的含量为：
[0023]
[0024] 在一些实施例中，纯化试剂中各组分的含量为：
[0025]
[0026] 本发明纯化试剂中采用的Tr is-HCl的pH值为8.0。
[0027] 本发明提供的纯化试剂在纯化装甲RNA病毒样颗粒中的应用。
[0028] 本发明还提供了装甲RNA病毒样颗粒提取试剂盒，包括超声试剂和纯化试剂；
[0029] 超声试剂包括:Tris-HCl、Na2S〇4、KCl、DTT、EDTA、甘油和Triton X-100;
[0030] 纯化试剂包括:Tris-HCl、NaCl、MgCl2、DTT 和亚精胺。
[0031 ]本发明提供的试剂盒中，超声试剂中各组分的含量为：
[0032]
[0033]纯化试剂中各组分的含量为：
[0034]
[0035]
[0036] 在一些实施例中，本发明提供的试剂盒中超声试剂中：
[0037]
[0038]纯化试剂中各组分的含量为：
[0039]
[0040] 在一些实施例中，本发明提供的试剂盒中超声试剂中：
[0041]
[0042]纯化试剂中各组分的含量为：
[0043]
[0044] 在一些实施例中，本发明提供的试剂盒中超声试剂中：
[0045]
[0046] 纯化试剂中各组分的含量为：
[0047]
[0048] 在一些实施例中，本发明提供的试剂盒中超声试剂中：
[0049]
[0050]纯化试剂中各组分的含量为：
[0051]
[0052] 在一些实施例中，本发明提供的试剂盒中超声试剂中：[0053]
[0055]纯化试剂中各组分的含量为：
[0054]
[0056]
[0057] 本发明提供的试剂储存温度范围为-20°C_25°C。
[0058]本发明还提供了 一种提取装甲RNA病毒样颗粒的方法，包括：
[0059] 步骤1:以超声试剂重悬装甲RNA病毒样颗粒表达菌，超声破碎，经离心后，取上清 液；
[0060] 步骤2:使所述上清液经过超滤管后，以纯化试剂清洗获得浓缩液；
[0061] 步骤3:所述浓缩液经Dnase和Rnase消化后，经过超滤管，以纯化试剂清洗、制得装 甲RNA病毒样颗粒；
[0062] 所述超声试剂包括:Tris-HCl、Na2S〇4、KCl、DTT、EDTA、甘油和Triton X-100;
[0063] 所述纯化试剂包括:Tris-HCl、NaCl、MgCl2、DTT和亚精胺。
[0064] 本发明提供试剂盒提取的装甲RNA病毒样颗粒为甲型流感病毒的装甲RNA病毒样 颗粒。
[0065] 利用本发明提供的试剂盒对装甲RNA病毒样颗粒进行提取，该试剂可破坏核酸-蛋 白复合物结构，使结合于蛋白表面的核酸游离于溶液中，使DNase和RNase能更好的作用于 核酸，发挥其功能。使存在于裂解液中的菌体基因组DNA，质粒DNA，mRNA以及未包装RNA降解 的更充分，从而得到纯度更高的装甲RNA病毒样颗粒。
[0066] 超声破碎利用超声波在液体中的空化作用，换能器将电能量通过变幅杆在工具头 顶部液体中产生高强度剪切力，形成高频的交变水压强，使空腔膨胀、爆炸将细胞击碎。另 一方面由于超声波在液体中传播时产生剧烈地扰动作用，使颗粒产生很大的加速度，从而 互相碰撞或与器壁互相碰撞而击碎。
[0067] 本发明中，超声破碎的功率为300W，超声3s，停留5s，超声时间为15min。
[0068]本发明中，超声破碎的温度为4°C。
[0069]本发明中，每8mL超声试剂重悬50mL装甲RNA病毒样颗粒表达菌菌液中所包含的菌 体。
[0070] 菌液经检测，0D600值为3。
[0071 ] 步骤1中离心的转速为12000rpm，时间为5min。
[0072] 步骤2中采用的超滤管为Amicon Ultra-4,其粒径为lOOkDa。
[0073] 超滤管经平衡，所述平衡采用超纯水，4 °C放置1 Omin。
[0074]步骤2所述上清液经过超滤管具体为：向超滤管中加入上清液，将超滤管5000rpm， 离心15min，弃除收集管中液体。
[0075]步骤2中所述清洗具体为：向超滤管中加入的纯化试剂，并用移液器反复吹打超滤 膜8~10次，5000rpm，离心10min，倒掉收集管中液体，将超滤管重新置于收集管中。重复上 述步骤一次。用移液器将超滤管中液体吸出转至新的1.5ml的离心管中。用200μ1的纯化试 剂反复吹洗滤膜8-10次，并将洗液吸出与上步中吸出的液体混匀，重复2次。用纯化试剂补 至lml，即得浓缩液。
[0076] 步骤3中所述消化的温度为37°C，消化时间为lh。
[0077] 所述Dnase和Rnase的酶浓度比为1:10。
[0078]步骤3中所述经过超滤管为:将消化后的液体加入到已用超纯水润洗的超滤管中， 将超滤管置于离心机中5000rpm，离心15min，倒掉收集管中液体，将超滤管重新置于收集管 中。
[0079] 步骤3中所述清洗具体为：向超滤管中加入的纯化试剂，并用移液器反复吹打超滤 膜8~10次，5000rpm，离心10min，倒掉收集管中液体，将超滤管重新置于收集管中。重复上 述步骤一次。用移液器将超滤管中液体吸出转至新的1.5ml的离心管中。用200μ1的纯化试 剂反复吹洗滤膜8-10次，并将洗液吸出与上步中吸出的液体混匀，重复2次。用纯化试剂补 至lml，即得装甲RNA病毒样颗粒。
[0080] 本发明提供了一种用于装甲RNA病毒样颗粒表达后菌体裂解及超滤纯化的试剂。 可用于原核表达系统表达的装甲RNA病毒样颗粒的超声破碎和超滤纯化。本发明提供的试 剂包括超声试剂和纯化试剂，超声试剂用于表达后菌体的重悬和超声破碎，纯化试剂用于 破碎后释放的装甲RNA病毒样颗粒的超滤纯化。实验表明，采用本发明提供的超声试剂和纯 化试剂对装甲RNA病毒样颗粒局具有良好的纯化效果，所得装甲RNA病毒样颗粒进行RT-PCR 表现出良好的扩增曲线，进行PCR则未见非特异性扩增。证明所得病毒样颗粒具有良好的纯 度，能够作为标准品使用。
【附图说明】
[0081 ]图1示实施例2~4制备质粒中核酸的RT-PCR扩增结果和PCR扩增结果；
[0082]图2示实施例1和实施例5~6制备质粒中核酸的RT-PCR扩增结果和PCR扩增结果； [0083]图3-a示对比例1制得质粒中核酸的RT-PCR扩增结果和PCR扩增结果；
[0084]图3-b示实施例2制得质粒中核酸的RT-PCR扩增结果和PCR扩增结果。
【具体实施方式】
[0085] 本发明提供了装甲RNA病毒样颗粒表达后菌体的裂解试剂、纯化试剂及其应用，本 领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的 替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的 方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神 和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0086] 本发明采用的试材、试剂、仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。其中，甲型流感 病毒装甲RNA病毒样颗粒表达菌株购自博奥生物集团有限公司。病毒RNA提取试剂盒购自于 Tiangen公司。
[0087] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0088] 实施例1装甲RNA病毒样颗粒的表达
[0089]将博奥生物集团有限公司保存的甲型流感病毒的装甲RNA病毒样颗粒表达菌株 CBC NO. 150601的甘油菌进行平板划线活化，挑取活化后的单菌落接种于10ml含有Kan和Cm 抗性的LB液体培养基，37°C，220rpm，恒温震荡培养箱过夜培养。将培养菌液作为种子菌按 1 % (v/v)的比例接种于200ml的含有Kan和Cm抗性的LB液体培养基，37°C，220rpm，恒温震荡 培养值OD600 = 0.4-0.6，加入终浓度为1M的IPTG进行诱导表达，诱导表达条件为：22°C， 200rpm培养6h，将表达后的菌液按每管20ml菌液进行分装，8000rpm离心5min，弃上清，收集 菌体，并用灭菌水重悬菌体，再次SOOOrpm离心5min，弃上清，收集菌体。-20 °C保存收集的菌 体。
[0090] 实施例2~6表达菌体的超声破碎和装甲RNA病毒样颗粒的纯化 [0091 ]实施例2~6所采用的超声试剂与纯化试剂设置如表1:
[0092] 表1实施例2~6
[0093] L0094J 其中，各试剂组分如下：
[0095] 超声试剂l:35mM Tris-HCl(pH8.0)，0.5M Na2S04，15mM KCl，0.5mM EDTA，10%甘 油，0.5mM DTT，0.5%Triton X-100。
[0096] 超声试剂2:50mM Tris-HCl(pH8.0)，1.0M Na2S04,20mM KCl，lmM EDTA，20%甘 油，ImM DTT，2%Triton X-100。
[0097] 超声试剂3:100mM Tris-HCl(pH8.0)，1.5M Na2S04,25mM KCl，1.5mM EDTA，30% 甘油，2mM DTT，5%Triton X-100。
[0098] 纯化试剂l:25mM Tris-HCl(pH8.0)，20mM NaCl，10mM MgCl2,0.5mM DTT，1.5mM亚 精胺。
[0099] 纯化试剂2:50mM Tris-HCl(pH8.0)，100mM NaCl，15mM MgCl2，lmM DTT，5mM亚精 胺。
[0100] 纯化试剂3:100mM Tris-HCl(pH8.0)，200mM NaCl，20mM MgCl2,2mM DTT，7.5mM亚 精胺。
[0101] 超声和纯化方法如下：
[0102] -、表达菌体的超声破碎
[0103] 将实施例1中收集的菌体用表1超声试剂进行重悬（50ml菌液离心后，菌体沉淀用 8ml超声试剂重悬），颠倒混勾，使菌体均勾悬浮于超声试剂1中，利用超声波细胞破碎仪进 行超声破碎，超声程序为:功率300W，超声3s，停留5s，超声时间为15min。将破碎的裂解液进 行离心，12000rpm离心5min，收集上清液。
[0104] 二、装甲RNA病毒样颗粒的纯化
[0105] 1、取1个超滤管，分别加入2ml的超纯水，置于4 °C冰箱，预冷1 Omin。
[0106] 2、倒掉超滤管中的超纯水，向超滤管中加入8ml的上述破碎获得的上清液，将超滤 管置于离心机中5000rpm，离心15min，倒掉收集管中液体，将超滤管重新置于收集管中。
[0107] 3、倒掉收集管中液体，向超滤管中加入3ml的纯化试剂，并用1ml的移液器反复吹 打超滤膜8-10次，5000rpm，离心10min，倒掉收集管中废液，将超滤管重新置于收集管中。
[0108] 4、重复上述步骤3-次。
[0109] 5、用200μ1的移液器将超滤管中液体吸出转至一新的1.5ml的离心管中（超滤管经 离心，超滤管中会有25-100μ1的残留，此即为我们需要保留的部分）。
[0110] 6、用200μ1的纯化试剂反复吹洗滤膜8-10次，并将洗液吸出与上步中吸出的液体 混匀，重复2次。
[0111] 7、将所得的浓缩液用纯化试剂补至lml，即得装甲RNA病毒样颗粒的浓缩液。
[0112] 8、将步骤7所得装甲RNA病毒样颗粒的浓缩液，用DNase和RNase进行酶消化处理， 37°(：，消化111。
[0113] 9、将消化后的液体加入到已用超纯水润洗的超滤管中，将超滤管置于离心机中 5000rpm，离心15min，倒掉收集管中液体，将超滤管重新置于收集管中。
[0114] 10、倒掉收集管中液体，向超滤管中加入3ml的纯化试剂，并用1ml的移液器反复吹 打超滤膜8~10次，5000rpm，离心10min，倒掉收集管中液体，将超滤管重新置于收集管中。
[0115] 11、重复上述步骤10-次。
[0116] 12、用200μ1的移液器将超滤管中液体吸出转至一新的1.5ml的离心管中；
[0117] (超滤管经离心，超滤管中会有25-100μ1的残留，此即为我们需要保留的部分）。
[0118] 13、用200μ1的纯化试剂反复吹洗滤膜8~10次，并将洗液吸出与上步中吸出的液 体混匀，重复2次。
[0119] 14、将所得的浓缩液用纯化试剂补至lml，即得纯化的装甲RNA病毒样颗粒。
[0120] 实施例7纯化效果验证
[0121] -、提取实施例2~6制备装甲RNA病毒样颗粒的核酸
[0122] 将纯化所得的装甲RNA进行核酸提取(按天根病毒RNA提取试剂盒进行提取），提取 步骤如下：
[0123] 1、取待提取液病毒样颗粒溶液140μ1。
[0124] 2、加入560μ1 AVL buffer，涡旋混匀15s，使病毒颗粒充分裂解。
[0125] 3、室温孵育lOmin，瞬时离心。
[0126] 4、加入560μ 1的无水乙醇，涡旋混匀15s，瞬时离心。
[0127] 5、小心吸取630μ1上述混合液于吸附柱中，不要使液体粘到吸附柱的边缘，室温放 置2min，8000rpm离心lmin，将吸附柱转至一新的收集管中。
[0128] 6、重复步骤5,直至把剩余混合液全部离心，倒掉收集管中液体，将吸附柱放回收 集管中。
[0129] 7、加入500μ1溶液⑶，室温放置2min，8000rpm离心lmin，倒掉收集管中液体，将吸 附柱放回收集管中。
[0130] 8、加入500μ1溶液RW，室温放置2min，12000rpm离心2min，倒掉收集管中液体，将吸 附柱放回收集管中。
[0131] 9、重复步骤8-次。
[0132] 10、将吸附柱转至一新的离心管中，12000rpm空离2min。
[0133] 11、将吸附柱转至一新的1.5ml的离心管中，室温放置1 Omin，悬空滴加60μ 1无洗脱 缓冲液，室温放置2min，8000rpm离心2min，将离心管中液体重新加入到吸附柱中，8000rpm， 离心2min，收集RNA液体，-20 °C保存。
[0134] 对上述提取获得的核酸的验证
[0135] 将步骤四所提取的核酸进行RT-PCR和PCR验证（扩增产物为甲型流感膜蛋白基 因）AT-PCR和PCR体系及扩增程序分别如下。
[0136] 上游引物:ATGAGYCTTYTAACCGAGGTCGAAACG
[0137] 下游引物：TGGACAAANCGTCTACGCTGCAG
[0138] RT-PCR体系：20μ1 体系扩增，10*Buffer 2yl，AMV-RT 0.5yl，Taq DNA聚合酶0·5μ l，MgC12 1·2μ1，(1ΝΤΡ ΙμL，上游引物0·5μ1，下游引物0·5μ1，模板2yl，EvaGreen 0.6yl，R0X 0·2μ1，(ΜΗ20 11μ1
[0139] PCR 体系：20μ1 体系扩增，lOXBuffer 2yl，Taq DNA 聚合酶 0.5yl，MgC121.2yl， dNTP ΙμL，上游引物0·5μ1，下游引物0·5μ1，模板2yl，EvaGreen 0.6yl，R0X 0.2yl，ddH20 11·5μ1
[0140] 扩增程序：5〇1€3〇111丨11，951€5111丨11;95。(：158,58 1€3〇8,681€2〇8;重复步骤3-5 32次， 68°C10min，12°C5min。
[0141] 对扩增效果进行分析，结果如图1~2:
[0142] 由于病毒颗粒中包裹的为RNA，PCR扩增模板为DNA不会扩增RNA样品，RT-PCR先将 RNA转录出DNA再进行扩增。若样品纯度很高，则不会有DNA残留只有RNA所以RT-PCR有扩增 产物，PCR没有扩增产物。
[0143] 其中，实施例2~4制备质粒中核酸的RT-PCR扩增结果和PCR扩增结果如图1;结果 表明采用3种不同浓度的超声试剂进行超声破碎，均可得到纯度较高的装甲RNA病毒样颗 粒。
[0144] 实施例2和实施例5~6制备质粒中核酸的RT-PCR扩增结果和PCR扩增结果如图2; 结果表明3种不同浓度的纯化试剂进行纯化，均可得到高纯度的装甲RNA病毒样颗粒。
[0145] 对比例1现有技术的提取效果
[0146] 用菌体裂解液代替本发明的超声试剂，用PBS代替本发明的纯化试剂的作为对比 例，菌体破碎和装甲RNA病毒样颗粒的纯化方法与实施例2~6相同。采用实施例7的方法对 对比例制备装甲RNA病毒样颗粒的核酸进行提取，并以相同的扩增体系和扩增程序对所得 核酸进行扩增，其扩增结果如图3-a，以实施例2制备装甲RNA病毒样颗粒的核酸为末班扩增 的效果如图3-b。结果显示，过本发明提供的超声试剂和纯化试剂，可以得到高纯度的装甲 RNA病毒样颗粒。
[0147] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种超声试剂，其特征在于，包括化is-HCl、化2S化、KCl、DTT、邸ΤΑ、甘油和化iton X- 100。2. 根据权利要求1所述的超声试剂，其特征在于，其中各组分的含量为： Tris-HCI 35 mmol/L ~100 mmol/L; Na]S〇4 0.5 mol/L ~1.5mol/L; KC! 15 mmol/L ~25 mmol/L; EDTA 0.5 mmol/L ~1.5mmol''L; DTT 0.5 mmol/L ~2 mmol/L; 甘油 lOv%~30v%; Triton X-100 0.5v%~5v%。3. 权利要求1或2所述的超声试剂在裂解装甲RNA病毒样颗粒表达菌体中的应用。4. 一种纯化试剂，其特征在于，包括Tris-HCI、化C1、MgCb、DTT和亚精胺。5. 根据权利要求4所述的纯化试剂，其特征在于，其中各组分的含量为： Tris-HC! 25 mmol/L ~100 mmol/L; NaCi 2.Qm mol/L' ~200 掛 mo!/L; MgCb. 10 mmol/L ~20 mmol/L; DTT 0.5 mmol/L -2 nimol/L; 亚精胺 1 .,5 minQ:l/L ~7.5mm0l/L。6. 权利要求4或5所述的纯化试剂在纯化装甲RNA病毒样颗粒中的应用。7. -种装甲RNA病毒样颗粒提取试剂盒，其特征在于，包括超声试剂和纯化试剂； 所述超声试剂包括:Tris-肥1、化2S〇4、KCl、DTT、EDTA、甘油和Triton X-100; 所述纯化试剂包括:Tris-HCI、化Cl、MgCb、DTT和亚精胺。8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于， 所述超声试剂中各组分的含量为： Tris-HCI 35 mmol化~100 mmol/L; Na2S〇4 0.5 mol/L ~1.5|11〇1,心 KCI 15 mmol/L ~25 mmol/L; EDTA 0.5 mmol/L ~1.5mmol/L; DTT 0-5 mmol/L ~2 mmol/。 甘油 1 Ον%~3 Ον%; TrhonX-lOO 0.5ν%~5ν%; 所述纯化试剂中各组分的含量为： Tris-HCl 25 rnmol/L ~'1OQ 抑111〇1,''仁； NaCl 20m mol/L --200册〇〇1化； MgCb 10 mmol/L.~20 mmol/L; DTT 0.5 nimol/L -2 mmol/L; 亚精胺 1.5 mmol/L ~7.5ιτιη?〇1./1·;;9. 一种提取装甲RNA病毒样颗粒的方法，其特征在于，包括： 步骤1: W超声试剂重悬装甲RNA病毒样颗粒表达菌，超声破碎，经离屯、后，取上清液； 步骤2:使所述上清液经过超滤管后，W纯化试剂清洗获得浓缩液； 步骤3:所述浓缩液经Dnase和Rnase消化后，经过超滤管，W纯化试剂清洗、制得装甲 RNA病毒样颗粒； 所述超声试剂包括:Tris-肥1、化2S〇4、KCl、DTT、EDTA、甘油和Triton X-100; 所述纯化试剂包括:Tris-HCl、化Cl、MgCb、DTT和亚精胺。10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述超声的功率为300W，超声3s，停留5s， 超声时间为15min。
【文档编号】C12N7/02GK106085973SQ201610397829
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】张岩, 盖伟, 单万水, 邢婉丽, 张春涛, 宋翠丹, 周海卫, 程京
【申请人】博奥生物集团有限公司, 深圳市第三人民医院, 中国食品药品检定研究院