一种寨卡病毒假病毒颗粒及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种寨卡病毒假病毒颗粒及其制备方法。本发明提供了寨卡病毒假病毒颗粒，为外壳蛋白包裹寨卡病毒NS5基因形成的假病毒颗粒；所述外壳蛋白由噬菌体MS2成熟酶和噬菌体MS2衣壳蛋白组成；所述寨卡病毒NS5基因的核苷酸序列为序列2第19?2727位。本发明的实验证明，本发明用表达噬菌体衣壳蛋白和成熟酶蛋白重组载体和表达寨卡病毒基因组部分片段的重组载体导入宿主菌，培养，包装得到寨卡病毒假病毒颗粒，为首次获得寨卡病毒假病毒颗粒。
【专利说明】
一种寨卡病毒假病毒颗粒及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种寨卡病毒假病毒颗粒及其制备方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 寨卡病毒(Zika virus)是一种由蚊子传播的病毒，该病毒可能导致婴儿患上"小 头症"。该病毒属于黄病毒科黄病毒属，单链RNA病毒，与登革热病毒属同源同宗。2015年，巴 西有2700名婴儿怀疑患上小头症，其中29人死亡，主要集中在东北部，而2014年巴西只有 147宗小头症个案。寨卡病毒首次被发现是在上世纪40年代的乌干达，之后一度在非洲流 行。寨卡病毒之后流传到南太平洋和亚洲地区，近期刚刚流传到拉丁美洲。巴西在2015年4 月出现第一例寨卡病毒，随后快速扩散到18个省份。对寨卡病毒诊断试剂的研制迫在眉睫， 尤其是核酸诊断试剂的研制，这就需要用到内对照参考品。虽然，用真实病毒作为参考品更 能真是的反应核酸诊断试剂的性能，但由于真实的寨卡病毒具有一定的传染性，易引起生 物安全问题，且不易于保存和运输。若以裸露的RNA作为其参考品，由于环境中Rnase的大量 存在，使得裸露的RNA不稳定，易被降解。这就需要一种具有耐Rnase特性的RNA，装甲RNA假 病毒就是其中的一种。装甲RNA可将RNA包裹在MS2噬菌体的衣壳蛋白中，使RNA具有耐RNase 特性，同时可以用来模拟真实样本的提取过程，且能实现大规模生产。
[0003] 装甲RNA是一类包装有外源RNA的假病毒颗粒，一般采用MS2噬菌体包装系统。该系 统制备假病毒颗粒简单，安全，制备周期短。主要是利用噬菌体的衣壳蛋白和成熟酶蛋白识 别并包装含有MS2噬菌体识别序列的外源RNA并将其组装，形成成熟的假病毒颗粒。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种寨卡病毒假病毒颗粒。
[0005] 本发明提供的寨卡病毒假病毒颗粒，为外壳蛋白包裹寨卡病毒NS5基因形成的假 病毒颗粒；
[0006] 所述外壳蛋白由噬菌体MS2成熟酶和噬菌体MS2衣壳蛋白组成；
[0007] 所述寨卡病毒NS5基因的核苷酸序列为序列2第19-2727位。
[0008] 本发明另一个目的是提供一种制备上述寨卡病毒假病毒颗粒的方法。
[0009] 本发明提供的方法，是采用MS2噬菌体包装系统包装寨卡病毒NS5基因，得到寨卡 病毒假病毒颗粒；
[0010] 所述寨卡病毒NS5基因的核苷酸序列为序列2第19-2727位。
[0011] 上述方法中，所述采用MS2噬菌体包装系统包装寨卡病毒NS5基因为在宿主菌中表 达寨卡病毒NS5基因、噬菌体MS2成熟酶编码基因和噬菌体MS2衣壳蛋白编码基因，表达的噬 菌体MS2衣壳蛋白会自动识别NS5基因上MS2包装位点，在成熟酶蛋白作用下进行病毒颗粒 的包装，从而得到包装得到寨卡病毒假病毒颗粒。
[0012] 寨卡病毒NS5基因以含有寨卡病毒NS5基因的片段的形式在宿主菌表达;含有寨卡 病毒NS5基因的片段由MS2噬菌体包装位点识别片段和所述寨卡病毒NS5基因组成。
[0013]所述寨卡病毒NS5基因的核苷酸序列为序列2第19-2727位。
[0014]上述方法包括如下步骤：
[0015] 1)将含有寨卡病毒NS5基因的片段、噬菌体MS2成熟酶编码基因和噬菌体MS2衣壳 蛋白编码基因导入宿主菌中，得到重组菌；
[0016] 所述含有寨卡病毒NS5基因的片段由MS2噬菌体包装位点识别片段和所述寨卡病 毒NS5基因组成；
[0017] 2)诱导培养所述重组菌，即得到寨卡病毒假病毒颗粒。
[0018] 上述方法中，
[0019] 所述含有寨卡病毒NS5基因的片段通过重组载体A导入宿主菌中，
[0020] 所述重组载体A为将含有寨卡病毒NS5基因的片段插入表达载体得到的载体；
[0021] 所述含有寨卡病毒NS5基因的片段为如下1)_3)中任一种：
[0022] 1)编码区为序列表中序列2所示的DNA分子；
[0023] 2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；
[0024] 3)与1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98 %或至少具 有99 %同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；
[0025] 上述严格条件可为在6 X SSC，0.5 % SDS的溶液中，在65 °C下杂交，然后用2 X SSC， 0 · 1 % SDS和 1 X SSC，0· 1 % SDS各洗膜一次。
[0026] 所述噬菌体MS2成熟酶编码基因和噬菌体MS2衣壳蛋白编码基因通过重组载体B导 入宿主菌中，
[0027] 所述重组载体B为将含有噬菌体MS2成熟酶编码基因和噬菌体MS2衣壳蛋白编码基 因的片段插入表达载体得到的载体；
[0028] 所述含有噬菌体MS2成熟酶编码基因和噬菌体MS2衣壳蛋白编码基因的片段为如 下1)_3)中任一种：
[0029] 1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；
[0030] 2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；
[0031] 3)与1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98 %或至少具 有99%同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。
[0032]上述方法中，
[0033]所述重组载体A中的表达载体和所述重组载体B中的表达载体相同或不同。
[0034]上述方法中，
[0035] 所述重组载体B中的表达载体为pET_30a+;
[0036] 所述重组载体A中的表达载体为pACY⑶uet-1;
[0037] 所述宿主菌为大肠杆菌。
[0038]上述方法中，
[0039] 所述步骤2)中，所述诱导培养后还包括如下步骤:将所述诱导培养后的菌体破碎， 收集破碎产物上清液，得到寨卡病毒假病毒颗粒。
[0040] 上述的寨卡病毒假病毒颗粒或上述的方法制备的寨卡病毒假病毒颗粒在作为用 于寨卡病毒核酸检测试剂内的对照参考品中的应用也是本发明保护的范围；
[0041 ]或上述的寨卡病毒假病毒颗粒或上述的方法制备的寨卡病毒假病毒颗粒在制备 用于寨卡病毒核酸检测试剂中的应用也是本发明保护的范围。
[0042]上述方法制备的寨卡病毒假病毒颗粒也是本发明保护的范围。
[0043]本发明的实验证明，本发明用表达噬菌体衣壳蛋白和成熟酶蛋白重组载体和表达 寨卡病毒基因组部分片段的重组载体导入宿主菌，培养，包装得到寨卡病毒假病毒颗粒，为 首次获得寨卡病毒假病毒颗粒。
【附图说明】
[0044] 图1为重组质粒pET-30a_MS2阳性克隆鉴定。
[0045] 图2为重组质粒pACY⑶-NS5的阳性克隆鉴定。
[0046] 图3为寨卡病毒装甲RNA假病毒颗粒的RT-PCR与PCR实时荧光定量PCR。
【具体实施方式】
[0047] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0048] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0049] 下述实例中采用的菌种、质粒和试剂如下：
[0050] 质粒 pACYCDuet-1 购自 Novagen 公司。
[0051 ]质粒 pET_30a+购自 Novagen公司。
[0052] 产品菌株BL21 (DE3)，Top 10购自 Tiangen公司。
[0053] 限制性内切酶，DNA polymerase均购自NEB公司。
[0054] T4 DNA ligase，AMV逆转录酶购自于Promega公司。
[0055] 质粒小提试剂盒，病毒RNA提取试剂盒均购自于Tiangen公司。
[0056]实施例1、表达MS2噬菌体衣壳蛋白基因和成熟酶蛋白基因的重组载体pET-30a_ MS2的构建
[0057] 一、MS2噬菌体衣壳蛋白和成熟酶蛋白基因序列的扩增
[0058] 以质粒pMS27(该质粒购自Department of Biomedical Molecular Biology, GhentUniversity，货号：LMBP05349)为模板，用下面的MS2上游引物和MS2下游引物进行PCR 扩增，得到PCR产物，得到含有MS2噬菌体的衣壳蛋白基因和成熟酶蛋白基因的DNA片段。
[0059] MS2 上游引物：5 ' -catgCCATGGtgcgagcttttagtacccttgatag-3 '
[0060] MS2 下游引物：5 ' -gcgcAAGCTTtggccggcgtctattagtagatgc-3 '
[0061 ] 扩增体系：50μ1体系扩增4管，5*Buffer 10yl，DNA聚合酶0.5yl，dNTP ΙμL，上游引 物ΙμL，下游引物ΙμL，模板PMS27 1μ1，(ΜΗ20 35.5μ1
[0062] 扩增程序：981€5111丨11;981€3〇8,58 1€3〇8,721€6〇8;重复步骤2-440个循环，721€ 10min，12°C5min〇
[0063] 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，大小为1611bp，与预期相符。回收目的条带。
[0064] 将PCR产物送去测序，该PCR产物具有序列表中序列1所示的核苷酸。
[0065] 序列表中序列1所示的DNA分子由MS2噬菌体成熟酶蛋白编码基因（第1-1182位核 苷酸)和MS2噬菌体衣壳蛋白编码基因（第1183-1611位核苷酸)组成。
[0066] 二、重组载体pET-30a_MS2的构建
[0067] 利用限制性内切酶BamH I和Hind ΙΠ 双酶切扩增上述制备的PCR产物和载体pET-30a+，37°C酶切2小时，反应体系：BamH I2yl，HindIII2yl，Buffer 4μ1，上述一制备的PCR产 物（或载体 pET-30a+) 32μ1。
[0068]将酶切产物进行纯化，将纯化的目的片段和载体按以下体系进行酶连反应:T4DNA Ligase 0.5yl，T4DNA Ligase Buffer ΙμL，目的片段5·5μl，pET-30a+3μl;22。C连接2h。取5 μL连接产物与50μ1 ToplO感受态细胞在冰上轻轻混匀，冰浴30min，42°C热激90s，立即置于 冰上3min，加入800μ1无抗性的LB培养基，37°C，150rpm孵育60min，将孵育后产物5000rpm离 心4min，弃600μ1上清，将剩余上清与菌体沉淀混勾，涂布含有kan抗性的LB固体平板，37°C， 倒置过夜培养。结果:平板上长出细菌的单菌落，符合预期。
[0069]挑取平板上的单菌落，重悬于20μ1的生理盐水中，进行菌落PCR验证阳性克隆；
[0070] 扩增体系：20μ1 体系扩增8管，10*Buffer lyl，Taq DNA聚合酶0.5yl，MgC12 1·2μ l，dNTP ΙμL，上游引物0.5μ1，下游引物0.5μ1，单菌落重悬液1μ1，(ΜΗ20 13.3μ1
[0071] 扩增程序：95 °C 5min; 95 °C30s，58 °C 30s，72 °C60s ;重复步骤2-4 40个循环，72°C lOmin，12°C5min〇
[0072] 将扩增产物进行0.8%的琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，扩增出目的条带的扩 增出目的条带的送擎科公司进行测序，测序正确的为构建成功的阳性克隆，将该单菌落接 种于10ml的Kan抗性的LB液体培养基，37°C，220rpm过夜培养。将培养的菌液收集至1.5ml离 心管中，12000rpm离心2min，弃上清，收集菌体沉淀，按天根公司的质粒小提试剂盒进行质 粒提取，即得到重组载体pET-30a-MS2。将重组质粒保存于-20°C，菌种保存于-80°C。
[0073] 将重组载体pET-30a_MS2送去测序，其为将序列表中序列1所示的DNA分子替换载 体pET-30a+的BamH I和Hi nd ΙΠ 酶切位点间的DNA片段，得到的载体。
[0074] 实施例2、表达寨卡病毒NS5基因的重组载体pACY⑶-NS5载体的构建 [0075] 一、肠道基质蛋白基因序列的扩增
[0076]以含有肠道基质蛋白的克隆载体pUC_NS5(该质粒为生工生物公司合成，选取序列 gi | 226377833 I)为模板，用下面的NS5上游引物和NS5下游引物进行PCR扩增，得到含有寨卡 病毒NS5基因的片段。
[0077] NS5 上游引物：5 ' -cccAAGCTTccggaggatcaccacgggAGGTGGGACGGGAGAGACTCTG-3 '
[0078] NS5 下游引物：5 ' -cccCTCGAGccggaggatcaccacgggCTCGTCTGAATCAGATGTCGGCC-3 '
[0079] 扩增体系：50μ1体系扩增4管，5*Buffer 10yl，DNA聚合酶0.5yl，dNTP ΙμL，上游引 物ΙμL，下游引物ΙμL，模板 1μ1，(ΜΗ20 35.5μ1
[0080] 扩增程序：981€5111丨11;981€3〇8,58 1€3〇8,721€6〇8;重复步骤2-440个循环，721€ lOmin，12°C5min〇
[0081] 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，大小为2727bp，与预期相符。回收目的条带。
[0082] 将PCR产物送去测序，该PCR产物具有序列表中序列2所示的核苷酸。
[0083]序列2所示的含有寨卡病毒NS5基因的片段由MS2噬菌体包装位点识别片段(序列2 第1-18位)和寨卡病毒NS5基因（序列2第19-2727位）。
[0084] 二、重组载体pACYCD-NS5的构建
[0085]利用限制性内切酶Hindm和Xho I双酶切扩增的上述一制备的PCR产物(含有寨卡 病毒NS5基因的片段)和载体pACYCDuet-1 (购自Novagen公司，目录号：71147-3)，37°C酶切2 小时，反应体系:HindIII2yl，Xho Ι2μ1，Buffer 4μ1，PCR产物(或载体pACYCDuet-l)32yl ·
[0086]将酶切产物进行纯化，将纯化的目的片段和载体按以下体系进行酶连反应:T4DNA 1^8&86〇.5以1，了40财1^8386 811打61141，目的片段5.541，？厶〇￥0)116卜1341;22。(：连接 2h。取5μ1连接产物与50μ1 ToplO感受态细胞在冰上轻轻混匀，冰浴30min，42 °C热激90s，立 即置于冰上3min，加入800μ1无抗性的LB培养基，37°C，150rpm孵育60min，将孵育后产物 5000rpm离心4min，弃600μ1上清，将剩余上清与菌体沉淀混勾，涂布含有Cm抗性的LB固体平 板，37°C，倒置过夜培养。结果:平板上长出细菌的单菌落，符合预期。
[0087]挑取平板上的单菌落，重悬于20μ1的生理盐水中，进行菌落PCR验证阳性克隆；采 用分段式鉴定，同一菌株分别采用两对引物进行菌落PCR。
[0088] 扩增体系：20μ1 体系扩增8管，10*Buffer 2yl，Taq DNA聚合酶0.5yl，MgC12 1·2μ l，dNTP ΙμL，上游引物0.5μ1，下游引物0.5μ1，单菌落重悬液1μ1，(ΜΗ20 13.3μ1
[0089] 扩增程序：951€5111丨11;951€3〇8,58 1€3〇8,721€6〇8;重复步骤2-440个循环，721€ lOmin，12°C5min〇
[0090] 将扩增产物进行0.8%的琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，两对引物扩增条带大 小分别为1700bp和1200bp，结果符合预期。将扩增出目的条带送擎科公司进行测序，测序正 确的为构建成功的阳性克隆，将该单菌落接种于1 〇m 1的Cm抗性的LB液体培养基，37 °C， 220rpm过夜培养。将培养的菌液收集至1.5ml离心管中，12000rpm离心2min，弃上清，收集菌 体沉淀，按天根公司的质粒小提试剂盒进行质粒提取，即得到重组载体PACYCD-NS5。将重组 质粒保存于_20°C，菌种保存于_80°C。
[0091] 将重组载体pACY⑶-NS5送去测序，其为将序列表中序列2所示的含有寨卡病毒NS5 基因的片段替换载体pACY⑶uet-Ι的Hindm和Xho I酶切位点间的DNA片段得到的载体。 [0092]实施例3、包装寨卡病毒假病毒
[0093] 一、重组菌的构建
[0094] 分别取实施例1和实施例2中所构建的重组质粒pET-30a-MS2和pACYCD-NS5按5μ1+ 5μ1的体积混匀，取5μ1加入到50μ1的BL21 (DE3)的感受态细胞中，用枪轻轻吹打混匀，置于 冰上，冰浴30min，42 °C热激90s，立即置于冰上3min，加入800μ1无抗性的LB培养基，37 °C恒 温震荡培养箱，150rpm孵育60min，将孵育后产物5000rpm离心4min，弃600μ1上清，将剩余上 清与菌体沉淀混匀，涂布含有Cm和Kan抗性的LB固体平板，37°C，倒置过夜培养。结果:平板 上长出细菌的单菌落，符合预期。
[0095]挑取平板上的单菌落，重悬于20μ1的生理盐水中，进行菌落PCR验证阳性克隆，同 时对MS2基因（引物为MS2上游引物和MS2下游引物，扩增产物大小为1611bp)和NS5基因（弓丨 物为NS5上游引物和NS5下游引物，扩增产物大小为2727bp)序列进行扩增。
[0096] 扩增体系：20μ1 体系扩增8管，10*Buffer 2yl，Taq DNA聚合酶0.5yl，MgC12 1·2μ l，dNTP ΙμL，上游引物0.5μ1，下游引物0.5μ1，单菌落重悬液1μ1，(ΜΗ20 13.3μ1
[0097] 扩增程序：95 °C 5min; 95 °C30s，58 °C 30s，72 °C60s ;重复步骤2-4 40个循环，72°C 10min，12°C5min〇
[0098] 将扩增产物进行0.8%的琼脂糖凝胶电泳，结果如图1，图2所示，图1为鉴定的MS2 阳性克隆，图2为鉴定的NS5阳性克隆。扩增出目的条带的为构建成功的阳性克隆，将该单菌 落接种于l〇ml的Cm和Kan抗性的LB液体培养基，37°C，220rpm培养。保存菌体，该菌命名为 pET-30a-MS2-ACYCD-NS5，即为含有双载体的重组菌。
[0099]二、诱导表达包装得到寨卡病毒假病毒颗粒
[0100] 将上述一制备的含有双载体的重组菌pET-30a-MS2-ACYCD-NS5进行平板划线，使 其长出单菌落，挑取单菌落接种于Cm加 Kan抗性的LB液体培养基，37°C，220rpm恒温振荡培 养箱过夜培养。将过夜培养的菌液按1:100的比例接种于新的Cm加 Kan抗性的的LB液体培养 基，37 °C，220rpm恒温振荡培养箱至0D600 = 0.4-0.6，加入0.5M的IPTG至终浓度为ImM，22 °C，200rpm培养6h，收集菌体；
[0101] 用裂解液（100mM Tris-HCl(pH8.0)，10% 甘油，l%Triton X-10)重悬菌体，置于 冰水混合物中，使冰水混合物没过菌悬液液面，利用超声波细胞破碎仪对菌悬液进行菌体 破碎;超声破碎参数为:超声3s，停留4s，破碎时间为15min，破碎功率为总功率的60% ;将破 碎后的溶液于12000rpm离心5min，收集上清液，得到寨卡病毒假病毒颗粒。
[0102] 三、假病毒颗粒的验证
[0103] 将上述二制备的寨卡病毒假病毒颗粒进行核酸提取(按天根病毒RNA提取试剂盒 进行提取），得到RNA。
[0104] 以RNA为模板，用如下引物进行RT-PCR和PCR验证(7500real time PCR)。
[0105] 引物为:ZK-NS5-F: AGGCATGGGGGAGGATTAGT
[0106] ZK-NS5-R：CCCATCCAATGGTCCTCGTT
[0107] RT-PCR体系：20μ1 体系扩增，10*Buffer 2yl，AMV-RT 0.5yl，Taq DNA聚合酶0·5μ l，MgC12 1·2μ1，(1ΝΤΡ ΙμL，上游引物0·5μ1，下游引物0·5μ1，模板2yl，EvaGreen 0.6yl，R0X 0·2μ1，(ΜΗ20 11μ1
[0108] ?〇財广增程序：5〇1€3〇11^11，951€511^11 ;95。(：158,581€3〇8,681€2〇8;重复步骤3-5 32 个循环，68°C10min，12°C5min。
[0109] PCR体系：20μ1 体系扩增，10*Buffer 2yl，Taq DNA聚合酶0.5yl，MgC121.2yl，dNTP 叫1，上游引物0.541，下游引物0.541，模板2414丫&6代6110.641，1?(^0.241，(1诎20 11.541
[0110] RT-PCR扩增程序:95°C5min;95°C15s，58°C30s，68°C20s;重复步骤3-5 32个循环， 68°C10min，12°C5min。
[0111] 扩增结果如图3所示，可以看出，得到寨卡病毒NS5片段，证明得到的假病毒颗粒为 寨卡病毒假病毒颗粒。
【主权项】
1. 一种寨卡病毒假病毒颗粒，为外壳蛋白包裹寨卡病毒NS5基因形成的假病毒颗粒； 所述外壳蛋白由噬菌体MS2成熟酶和噬菌体MS2衣壳蛋白组成； 所述寨卡病毒NS5基因的核苷酸序列为序列2第19-2727位。2. -种制备权利要求1所述寨卡病毒假病毒颗粒的方法，是采用MS2噬菌体包装系统包 装寨卡病毒NS5基因，得到寨卡病毒假病毒颗粒； 所述寨卡病毒NS5基因的核苷酸序列为序列2第19-2727位。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述采用MS2噬菌体包装系统包装寨卡病 毒NS5基因为在宿主菌中表达噬菌体MS2成熟酶编码基因、噬菌体MS2衣壳蛋白编码基因和 寨卡病毒NS5基因，包装得到含有寨卡病毒NS5基因的寨卡病毒假病毒颗粒； 所述寨卡病毒NS5基因的核苷酸序列为序列2第19-2727位。4. 根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于： 所述方法包括如下步骤： 1) 将含有寨卡病毒NS5基因的片段、噬菌体MS2成熟酶编码基因和噬菌体MS2衣壳蛋白 编码基因导入宿主菌中，得到重组菌； 所述含有寨卡病毒NS5基因的片段由MS2噬菌体包装位点识别片段和所述寨卡病毒NS5 基因组成； 2) 诱导培养所述重组菌，即得到寨卡病毒假病毒颗粒。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于： 所述含有寨卡病毒NS5基因的片段通过重组载体A导入宿主菌中， 所述重组载体A为将含有寨卡病毒NS5基因的片段插入表达载体得到的载体； 所述含有寨卡病毒NS5基因的片段为如下1)-3)中任一种： 1) 编码区为序列表中序列2所示的DNA分子； 2) 在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子； 3) 与1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至 少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99% 同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子； 所述噬菌体MS2成熟酶编码基因和噬菌体MS2衣壳蛋白编码基因通过重组载体B导入宿 主囷中， 所述重组载体B为将含有噬菌体MS2成熟酶编码基因和噬菌体MS2衣壳蛋白编码基因的 片段插入表达载体得到的载体； 所述含有噬菌体MS2成熟酶编码基因和噬菌体MS2衣壳蛋白编码基因的片段为如下1)- 3)中任一种： 1) 编码区为序列表中序列1所示的DNA分子； 2) 在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子； 3) 与1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至 少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99% 同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于： 所述重组载体A中的表达载体和所述重组载体B中的表达载体相同或不同。7. 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于： 所述重组载体B中的表达载体为pET-30a+; 所述重组载体A中的表达载体为pACY⑶uet-1; 所述宿主菌为大肠杆菌。8. 根据权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于： 所述步骤2)中，所述诱导培养后还包括如下步骤:将所述诱导培养后的菌体破碎，收集 破碎产物上清液，得到寨卡病毒假病毒颗粒。9. 权利要求1所述的寨卡病毒假病毒颗粒或权利要求2-8中任一所述的方法制备的寨 卡病毒假病毒颗粒在作为用于寨卡病毒核酸检测试剂内的对照参考品中的应用； 或权利要求1所述的寨卡病毒假病毒颗粒或权利要求2-8中任一所述的方法制备的寨 卡病毒假病毒颗粒在制备用于寨卡病毒核酸检测试剂中的应用。10. 由权利要求2-8任一所述方法得到的寨卡病毒假病毒颗粒。
【文档编号】C12N7/04GK106085974SQ201610398517
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】张岩, 盖伟, 邢婉丽, 张春涛, 刘东来, 程京
【申请人】博奥生物集团有限公司, 中国食品药品检定研究所