一种禽流感病毒株的制作方法
【专利摘要】本发明的目的提供一株H9亚型禽流感毒株，保藏编号为CCTCC No.V201617。本发明的H9亚型禽流感病毒FJ11株新毒株的HA及EID50效价高、免疫原性好并能抵御H9亚型禽流感病毒各地方流行分离毒的攻击。其制备的疫苗安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，结果与同类产品相比较，各项指标均稳定有效。CCTCC No.V20161720160331
【专利说明】
_种禽流感病毒株
技术领域
[0001] 本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种禽流感病毒株。
【背景技术】
[0002] 禽流感是禽类烈性传染病之一，由A型流感病毒引起的，家禽在感染H9亚型禽流感 病毒，特别当伴有混合感染时，可导致并引起高死亡率及产蛋率严重下降。而且是主要流行 于动物和人类中的一种传染性、死亡率高的急性、高度传染性疾病，广泛发生于世界各地， 对人类和养禽业危害很大。
[0003] 禽流感病毒在禽类疫病病毒中的变异是相对最频繁的，使得虽然推出的多种选择 的疫苗，但仍然出现控制不住疫情发展的局面，所以需要筛选获得新的流行毒株来应对变 异所造成的新的危害。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是筛选出一株新的H9亚型禽流感毒株，并将其毒株制备成灭活疫 苗，从而弥补现毒株变异所造成的危害。
[0005] 本发明首先提供一种禽流感病毒H9N2亚型FJ11株，于2016年3月31日保藏在中国 武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No. V201617。
[0006] 本发明还提供一种灭活疫苗，其中抗原为灭活的H9亚型禽流感病毒；
[0007] 上述的灭活疫苗，其中病毒的灭活采用甲醛灭活；
[0008] 本发明的灭活疫苗的制备方法如下：
[0009] D油相制备：
[0010] 取矿物油95份，硬脂酸铝1份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80°C后，再加5份 司本80 (Span-80 )，至温度达到115 °C时维持40分钟，冷却后完成油相制备；
[0011] 2)水相制备：
[0012] 取灭活的H9亚型禽流感抗原液95份，灭菌的5份吐温80，充分混匀；
[0013] 3)乳化
[0014] 取油相2份放入乳化罐中，加入水相1份后，再以3500r/min搅拌30~40分钟完成乳 化制备。
[0015]本发明的疫苗所使用的H9亚型禽流感病毒FJ11株新毒株的HA及EID5Q效价高、免疫 原性好并能抵御H9亚型禽流感病毒各地方流行分离毒的攻击。本发明制备的疫苗的安全性 良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试 验、效力试验数据的分析，结果与同类产品相比较，各项指标均稳定有效;效力试验结果证 明，H9亚型禽流感灭活疫苗抗体均比同类产品产生抗体快，重要的是免疫后能够抵御流行 株的保护。
【具体实施方式】
[0016]
【申请人】筛选获得了一株新型变异的H9亚型禽流感病毒，将该病毒制备成灭活疫 苗，从而促成了本发明。
[0017] 下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
[0018] 实施例1:H9亚型禽流感毒株的筛选
[0019] 1.流行病学调查自1998年我国北方地区发现H9亚型禽流感以来，我们就一直对H9 亚型禽流感的流行情况及病毒变异情况进行跟踪研究，近几年来，好多地区出现了禽流感 症状的发病或死亡鸡，经过大量的流行病学调查研究，2015年我们成功从福建某养鸡场的 鸡群中分离出一株H9亚型禽流感病毒。
[0020] 2.病毒分离根据文献报道的方法作AIV的分离。将病料按l:5(w/v)比例加入到含 双抗的生理盐水中，研磨制成悬液，l〇〇〇r/min离心5分钟，取上清尿囊腔接种10~11日龄 SPF鸡胚，每胚0.2ml，36°C~37°C孵化3~4日，每日照胚2次，取24小时后死亡的鸡胚，置2~ 8°C冷却8~16小时，收获鸡胚液，进行HA及HI试验。
[0021] 3. HA和HI试验按现行《中国兽药典》进行。
[0022] 4.病毒继代和病毒含量测定病毒在10~11日龄SPF鸡胚中继代，收获尿囊液。病毒 含量测定采用下列方法:将病毒尿囊液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，每个稀释度经尿 囊腔内接种10~11日龄SPF鸡胚各5个，每胚0. lml，观察120小时，计算EID50。
[0023] 5.亚型的鉴定将分离的FJ11株和其他毒株的鸡胚尿囊液用0.05%甲醛溶液灭活 后，送国家流感中心，做HI和NI试验，确定病毒的亚型。
[0024] 6.对鸡胚的毒力将FJ11株E0代尿囊液毒，用灭菌生理盐水作10-4稀释，接种10~11 日龄SPF鸡胚20个，每胚尿囊腔接种0. lml (约含1000EID5Q)，36~37°C孵育至120小时，弃去 60小时前死亡的鸡胚，以后每日观察两次，记录死亡胚数。
[0025] 7.对雏鸡的毒力按"0ΙΕ"标准用4周龄SPF鸡和按"欧盟指令"标准用6周龄SPF鸡进 行对雏鸡的毒力试验。
[0026] 8.免疫原性试验用7~10日龄SPF鸡20只，其中10只鸡每只皮下接种10倍稀释的 YBF003株尿囊液，另10只皮下接种生理盐水作对照，分别隔离饲养，21日后采血分离血清， 对标准H9抗原作HI试验。
[0027] 9.抗原特异性试验
[0028] 9.1对!19亚型特异性抗血清的!11试验将毒种分别与禽流感（!15、!17、!19亚型）、冊、 EDS抗血清做HI试验。
[0029] 9.2将FJ11株尿囊液用灭菌生理盐水作1000倍稀释，与等量抗AIV H9亚型特异抗 血清混合，置室温中和1小时后，尿囊腔接种SPF鸡胚10个，每胚0.2ml，同时设H9亚型特异抗 血清中和NDV的对照和FJ11株尿囊液作1000稀释未经中和的对照各10个(接种0. lml)。观察 并记录结果。
[0030]实施例2: H9亚型禽流感抗原的制备
[0031] 1接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释（如10-3或10-4)，按《全自动接 种机使用说明》要求，接种10~11日龄易感鸡胚，每胚o.lml，接种后密封针孔，置36~37°C 继续孵育，不必翻胚。
[0032] 2孵育和观察鸡胚接种后，每日照胚1次，将48小时前死亡的鸡胚弃去。此后，每4 ~6小时照胚1次，死亡鸡胚随时取出，直至96小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上直 立，置于2~8°C冷却12~24小时。
[0033] 3收获将冷却的鸡胚取出，按《全自动收获机使用说明》要求，收获鸡胚尿囊液(先 收活胚后收死胚）。吸取胚液放于50000ml灭菌容器内，抽样测定红细胞凝集价。凝集价低于 1:256(微量法)者应弃去。同时按《中国兽药典》进行无菌检验(可不移植），应无细菌生长。 收获的胚液灭活前在2~8°C保存，应不超过5日。
[0034] 4灭活将H9亚型禽流感病毒液导入灭活罐内，计量加入10%甲醛溶液，开启搅拌 机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1%。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免 罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37°c灭活16小时（以罐内温度达到37°C开始计时，开 启搅拌机连续搅拌)后取出，放2~8 °C保存，应不超过1个月。
[0035] 5半成品检验
[0036] 5.1无菌检验取灭活的胚液按现行《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。
[0037] 5.2灭活检验取10日龄SPF鸡胚6个，尿囊腔内接种灭活浓缩胚液，每个0.2ml，置 36~37°C继续孵育，每日照胚2次，观察5日，对所有胚液分别测定红细胞凝集价，均应不出 现凝集，将胚液收获再盲传一代，仍无凝集价时，认为灭活完全。
[0038] 5.3红细胞凝集价测定将灭活前的胚液测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:256 (微量法)者，方可用于制苗。
[0039] 5.4病毒含量测定将灭活前取出的胚液进行10倍系列稀释，取10_6、1(^、1(^ 83个 稀释度，各尿囊腔内接种10~11日龄SPF鸡胚5个，每胚0. lml，置36~37°C继续孵育，每日照 胚2次，观察5日，无论死胚、活胚均应测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:16(微量法)者，判 为感染，计算EID 5Q，每0.1ml病毒含量多107·3ΕΠ )5〇时，方可用于制苗。
[0040] 实施例3:疫苗的制备
[0041] 1油相制备取矿物油95份，硬脂酸铝1份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80°C 后，再加司本一80 5份，至温度达到115 °C时维持40分钟，冷却后备用。
[0042] 2水相制备将灭活的H9亚型禽流感病毒毒液以1:2比例混合。取混合抗原液95份， 灭菌的吐温一 80 5份，充分混匀，使吐温一 80完全溶解。
[0043] 3乳化取油相2份放入乳化罐中，开动电机，慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份 后，再以3500r/min搅拌30~40分钟。乳化后，取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心 15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。
[0044] 4分装定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2~8 °C保存。
[0045] 5成品检验
[0046] 5.1性状
[0047]外观乳白色乳剂。
[0048] 剂型油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均应不扩 散。
[0049] 稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相 应不多于0.5ml。
[0050] 黏度按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
[0051 ] 5.2装量检查按现行《中国兽药典》附录进行检查，应符合规定。
[0052] 5.3无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
[0053] 5.4安全检验用7~14日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下分点注射疫苗1.0ml，观察14 日，应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。
[0054] 5.5效力检验
[0055] 5.5.1血清学方法用30~60日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗0.2ml， 另5只不免疫作对照。接种后21~28日，每只鸡分别采血，分离血清，按现行《中国兽药典》进 行HI抗体效价测定。免疫组HI抗体效价的几何平均值应不低于1:180(微量法），未免疫对照 组HI抗体效价的几何平均值应不高于1:4(微量法）。
[0056] 5.5.2免疫攻毒法用30~60日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗0.2ml， 另5只不免疫作对照。接种后21~28日，每只鸡翅静脉注射10倍稀释的YBF003株毒液，每只 0.2ml，于攻毒后5日，采集泄殖腔拭子，经处理后，尿囊腔接种10~11日龄SPF鸡胚5个，孵育 观察5日，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液红细胞凝集价，每个拭子样品接种的5个鸡胚中只 要有1个鸡胚液的凝集价不低于1:16(微量法），即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的 样品，应盲传一次后再进行判定。免疫组应至少9只鸡病毒分离为阴性;对照组应至少4只鸡 病毒分尚为阳性。
[0057]实施例4:免疫交叉保护试验(能抵御流行的各地方分离株）
[0058]用FJ11株制备的灭活疫苗，免疫21日龄SPF鸡，每只0.2ml。免疫后21日，分别用10 倍稀释的FJ11株及各地方分尚毒株翅静脉注射，每个毒株各攻击10只免疫鸡及5只同条件 的未免疫对照鸡。攻毒后，免疫组鸡均未出现AI的典型临床症状;用棉拭子进行病毒分离， 阳性率均不超过10% (1/10);而未免疫对照组，也无典型临床症状，但病毒分离均为阳性。 表明FJ11株所制备的H9亚型禽流感灭活疫苗能抵御FJ11株及各地方分离株的攻击而起到 保护作用。详细结果见表1。
[0059] 而且，对比实验表明，用目前市场上出售的H9亚型禽流感灭活疫苗对SPF鸡进行免 疫，再用本发明筛选的FJ11株进行攻毒实验;结果表明目前市场上出售的疫苗的免疫效果 远低于本发明的FJ11株制备的灭活疫苗的免疫效果;推测是由于FJ11株发生变异导致目前 疫苗的免疫效果不好。
[0060]表1:FJ11株疫苗对不同毒株的免疫交叉保护试验结果
【主权项】
1. 一种禽流感病毒，其特征在于，所述的禽流感病毒，其保藏编号为CCTCC N〇.V201617。2. 如权利要求1所述的禽流感病毒，其特征在于，所述的禽流感病毒为H9C2亚型FJ11 株。3. 权利要求1所述的禽流感病毒在制备疫苗中的应用。4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的疫苗为灭活疫苗。
【文档编号】A61P31/16GK106085966SQ201610399186
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月5日
【发明人】李陆梅, 宋新宇, 马爽, 宫晓, 刘 东, 郑欢, 郭伟伟
【申请人】青岛易邦生物工程有限公司