一种新型抗原群的h9n2禽流感病毒及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种禽流感病毒，具体来说是一种新型抗原群的 H9N2禽流感病毒及其用途。
【背景技术】
[0002] H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV)自上个世纪90年代以来已 经广泛在我国和世界各地流行，不仅仅给养禽业造成了巨大的经济损失，而且给公共卫生 安全造成的隐患不可估量，对人类的健康也构成了巨大的威胁。在我国，独特的地理环境及 养殖模式为此病的发生、传播提供了有利条件。而免疫压力及活禽市场的存在又为H9N2亚 型禽流感病毒的重组和变异提供了必要条件。目前，H9N2亚型的疫苗已用于常规免疫，在 一定程度上控制了 H9N2亚型AIV的暴发流行。但是，由于禽流感病毒具有传播快、感染宿 主具有多样性，病毒株血清型众多、不同毒株间毒力差异大、变异性强等特点，造成局部地 区仍有流行，且非典型性流行增多，免疫失败也屡见不鲜。Radu等及Kilbourne等指出疫 苗株应经常改变，因为老的疫苗株通常仅对新毒株产生部分的保护力。1999年，Garcia等 证实禽流感暴发期间AIV分离株有很高的变异性，从而导致疫苗无效。Suarez等认为，AIV 的变异可引起禽类甚至人类疫苗免疫的失败。刘红旗等研究指出，HA基因的变异可能与频 繁的疫苗免疫选择压力有关。本试验拟通过HI交叉试验来比较分析2002年，2006-2014年 上海地区分离的H9N2亚型禽流感病毒之间的抗原相关性，探讨其抗原性是否发生漂移，为 H9N2亚型禽流感的防制提供参考依据。为了 了解不同年份分离的H9N2亚型禽流感病毒与 目前使用的疫苗株CK/SH/F/98之间的抗原相关性，挑选2002年，2006-2014年间在上海地 区分离的14株H9N2亚型禽流感病毒以及CK/SH/F/98病毒，通过HI交叉试验进行抗原性比 较和分析。HI试验结果显示：2002年，2006-2014年间在上海地区流行的H9N2亚型不同毒 株间已经发生了抗原性的漂移，划分成4个不同的抗原群，A/chicken/Shanghai/Yl/2002， A/chicken/Shanghai/Yl/2006 和 A/duck/Shanghai/C60/2007 同属于一个抗原群，命名为 A 群；A/chicken/Shanghai /C/2011 独自成为一个抗原群，命名为B群；A/pigeon/Shanghai/ JC1/2013和A/chicken/Shanghai/1107/2013归为同一个抗原群，命名为D群；其余毒株均 为一个抗原群，命名为C群。从抗原性聚类分析发现14株病毒均从CK/SH/F/98演化而来。 综上所述，整体来看一方面H9N2病毒是随时间的增长，抗原发生了不同程度的漂变，但是 也存在在某个时间段，多种抗原群共存的情况。该研究结果从理论上为我市制定禽流感防 控策略、有效防制H9N2流行提供了科学的指导，为生产上H9N2亚型流感免疫与制苗毒株的 选择提供参考依据。
【发明内容】
[0003] 针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种新型抗原群的H9N2禽流感 病毒及其用途，所述的这种新型抗原群的H9N2禽流感病毒及其用途解决了现有技术中无 法预防新的禽流感病毒从而导致新的禽流感疫情在禽类或者人类传播的技术问题。
[0004] 本发明提供了一种分离的H9N2禽流感病毒（抗原群D群），其基因组由SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO :8所示的RNA片段组成。
[0005] 本发明还提供了一种分离的H9N2禽流感病毒，其保藏号为CGMCC NO :10925。
[0006] 本发明还提供了一种用于预防上述的H9N2禽流感病毒的疫苗，含有灭活的上述 的H9N2禽流感病毒。
[0007] 本发明还提供了上述的用于预防H9N2禽流感病毒的疫苗的制备方法，包括如下 步骤：
[0008] a)，一个疫苗抗原液制备及毒价测定的步骤，将权利要求1或2所述的H9N2 禽流感病毒用灭菌生理盐水稀释后，接种非免疫鸡胚，收取尿囊液，测定其毒价：在 l(f6-l(fsEID50, HA价在I :256-512之间，病毒液置冰箱中保存备用；
[0009] b)，一个抗原液灭活的步骤，将福尔马林溶液加入病毒液中，检验合格后作为制备 抗原液；
[0010] c)，一个制备油相佐剂的步骤；
[0011] d)，一个制备疫苗水相的步骤；
[0012] e)，一个配制疫苗的步骤，将油相与水相预混后，再将混合物注入到高压匀浆栗内 乳化，制成油包水乳剂即为疫苗。
[0013] 进一步的，所述的油相佐剂由白油、司本-80和硬脂酸铝配制混合而成。
[0014] 进一步的，在制备疫苗水相的步骤中，将吐温-80经高温灭菌后，加入到己灭活抗 原液中，吐温-80的终浓度在2% - 5%之间，经充分溶解混合即为水相。
[0015] 本发明还提供了一种抗体，抗上述的一种分离的H9N2禽流感病毒。
[0016] 本发明还提供了一种诊断试剂，含有上述的一种抗体。
[0017] 本发明还提供了一种试剂盒，含有上述的一种抗体。
[0018] 本发明对分离的抗原群D群H9N2禽流感病毒进行了保藏。上述的分离的H9N2禽 流感病毒的分类命名为甲型流感病毒H9N2亚型，该病毒保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心（CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地 址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号（中国科学院微生物研究所），保藏日期为2015年 9月8号，保藏号为CGMCC NO: 10925。
[0019] 接种本发明的疫苗，可以预防本发明的抗原群D群的H9N2禽流感病毒的感染。使 用本发明的抗体，可以治疗本发明的抗原群D群的H9N2禽流感病毒的感染。并且本发明还 可以为禽流感病毒监测系统提供生物信息。
【附图说明】
[0020] 图 1 是通过 PRIMER，version 7. 0 (PRIMER-E，Plymouth，United Kingdom)软件分 析HI滴度，得到抗原性聚类图。
【具体实施方式】
[0021] 实施例1病毒的获得
[0022] 于2013年从上海地区的活禽批发市场鸡群获得，采集活禽样品包括气管或泄殖 腔拭子，将采集样品放在含有抗菌素的pH值7. 0-7. 4的等渗磷酸盐缓冲液（PBS)内。将 鉴定为阳性样品的棉拭子充分捻动、抒干后弃去拭子，样品液经l〇〇〇r/min离心10min， 取上清液作为接种材料。取处理好的样品以〇.2mL/胚的量经尿囊腔途径接种9日龄-11 日龄SPF鸡胚，每个样品接种5个胚，于35°C -37°C孵化箱内孵育，18h后每8h观察鸡胚 死亡情况。无菌收取18h以后的死胚及96h仍存活鸡胚的鸡胚尿囊液，测血凝活性，通 过下面的实施例对从鸡胚尿囊液中的病毒进行基因测序和鉴定，是一种新抗原群的甲型 流感病毒H9N2禽流感病毒，对此进行了保藏，保藏号为：CGMCC N0:10925 (A/chicken/ Shanghai/1107/2013) 〇
[0023] 实施例2 H9N2禽流感病毒的全基因测序
[0024] 2. 1于2013年从上海地区的活禽批发市场鸡群中获得，共分离、鉴定了一株H9N2 禽流感病毒：A/chicken/Shanghai/1107/2013(保藏号为：CGMCC NO :10925)。首先对鸡气 管和泄殖腔样品用H9荧光RT-PCR试剂盒进行检测，将H9阳性样品处理后接种鸡胚尿囊 腔，将分离毒尿囊液应用β -微量法进行HA试验，以检测其血凝性及HA效价。根据HA试 验中所测得的HA效价，将分离毒尿囊液配制成4单位的溶液，分别用新城疫阳性血清，禽流 感Η5和Η9阳性血清进行HI试验，以检测该分离物的血凝性是否能被禽流感Η9阳性血清 所抑制，详细步骤按照GB/U 18936-2003高致病性禽流感诊断技术。这1株病毒感染的鸡 胚尿囊液血凝性能够被Η9型阳性血清所抑制，而不能被Η5型阳性血清所抑制，表明这1株 病毒为Η9亚型。NA基因通过测序为Ν2亚型。
[0025] 2. 2将阳性样本接种SPF鸡胚，取感染鸡胚尿囊液用TRIzoI抽提试剂进行RNA的 抽提。2. 3 8个基因片段RT-PCR扩增如下：采用20 μ L的cDNA合成体系置于0. 2mL反应 管中，取溶于DEPC处理水中的AIV RNA样品9 μ L，分别加入上游引物3 μ L，5倍RT-PCR缓 冲液 4 μ L，dNTPs (lOmmol/L) 2. 5 μ L，RNA 酶抑制剂 0· 5 μ L，AMV 反转录酶 2 μ L，用无 RNase 的超纯水加至总体积为20 μ L，置于PCR仪中进行cDNA合成，以30°C 10min，42°C 60min，进 入PCR扩增。
[0026] PCR反应体系IOOyL:在PCR反应管中分别加入cDNAlO μ L，上、下游引物各 3yL(20pmol/yL)，10XLA PCR BufferlOyL，dNTPs(2.5mmol/L)10yL，MgCl2(25mmol/ L) 8 μ L，LA Taq DNA聚合酶0. 5 μ L (5U/