Dc诱导活化剂、dc体外培养方法和dc、及cik的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞免疫技术领域，具体涉及一种DC诱导活化剂、DC体外培养方法和DC、及 CIK。
【背景技术】
[0002]过继免疫治疗是将自身或异体的抗肿瘤效应细胞的前体细胞，在体外采用IL-2、抗CD3单抗，特异性多肽等激活剂进行诱导、激活和扩增后，再转输给肿瘤患者，从而提高患者抗肿瘤免疫力，以达到治疗的目的。目前在临床中使用最多的过继细胞免疫治疗主要是 DC(dendritic cell，树突状细胞)治疗、CIK (Cytokine-1nduced Killer，细胞因子诱导的杀伤细胞)治疗和DC-CIK联合免疫治疗。其中，DC主要从骨髓组织、血液中分离出，具有很强的捕获抗原、呈递抗原的能力和分泌能力，能够诱导持久有力的特异性抗肿瘤免疫反应。CIK是人外周血中单个核细胞在体外经多种细胞因子刺激后获得的一群异质细胞。它具有增殖能力强、杀瘤活性高和杀瘤谱广、临床应用不良反应小的特点，是肿瘤过继免疫治疗中更为有效的杀瘤效应细胞。而相对前两者，将DC和CIK进行共培养之后形成的DC-CIK联合免疫具有更优的使用效果，因为在共培养的过程中，两者之间相互既促进DC的成熟，更能促进C1K的增殖并且加强CIK的肿瘤杀伤效力。
[0003]然而现有技术通常的DC体外增殖和诱导过程中，由于DC本身分离自单个核细胞(PBMC)体外培养中的半贴壁细胞，这些贴壁细胞直接贴附在加工处理的塑料培养容器中，而这一体外的培养环境不能具备体内的原始生存环境，因此DC的生长、成熟以及表达的性状、免疫活性等方面都不能达到原始体内环境的水平，大大影响了 DC所要具备的抗原提呈效果。
[0004]而进一步在DC-CIK联合免疫中，由于CIK功能的强弱与DC提呈的专一性和数量有关，将培养的DC与CIK进行共培养时，DC体外增殖能力低、相反CIK增殖能力强大，会造成DC和CIK的接触机会低，从而影响DC的抗原提呈作用，最终降低CIK的治疗效力。
【发明内容】
[0005]本发明实施的目的在于克服现有培养出DC抗原提呈性能以及与CIK共培养时生长能力不足影响CIK杀伤力的缺陷，提供一种能够在DC进行体外培养的过程中大大提升其抗原提呈能效、细胞活性，但同时又能保持其分化程度的DC诱导活化剂，以及采用该DC诱导活化剂进行DC体外培养的方法和方法得到的DC、CIKo
[0006]为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下:
[0007]—种DC诱导活化剂，包括小细胞肺癌特异性EGFR和铝佐剂。
[0008]本发明的上述DC诱导剂利用EGFR本身具有很多肿瘤细胞表面结构簇，在DC进行培养的过程中作为模拟抗原对DC进行刺激和诱导，使其细胞活性能维持在较高的状态；同时搭配铝佐剂形成EGFR缓释，以及保护EGFR降解、衰减，还与DC质膜相互作用，最终能强化DC对抗原的处理和提呈能力。
[0009]本发明在上述DC诱导活化剂的基础上还提出一种采用上述DC诱导活化剂进行DC体外培养的方法，包括如下步骤:
[0010]获取DC，对所述DC进行体外培养；
[0011 ] 在所述体外培养的过程中，用上述DC诱导活化剂对所述DC进行诱导处理。
[0012]本发明的上述DC体外培养的方法，为了克服免疫细胞治疗存在的单核贴壁细胞贴壁环境不佳、DC提呈效果不强、活性抗原不易储存的现象，添加小细胞肺癌特异性抗原EGFR和铝盐佐剂进行诱导和活化，相比现有方式培养的DC具有更高的对抗原的处理和提呈能力和更强大的肿瘤特异性杀伤细胞。
[0013]本发明还提出一种采用上述DC体外培养的方法培养得到的DC，以及将该DC应用于DC-CIK联合免疫，进行DC-CIK共培养制备的CIK。
[0014]本发明制备得到的DC和CIK相比现有的通常培养的方式制备的DC和CIK，DC活性和增值能力高，在共培养的过程中能具有与CIK更多的接触几率；并且在培养的过程中，DC经过EGFR的诱导，能提呈更多的抗原信息，使得最终制备得到的CIK具有更高的活性和肿瘤特异性杀伤能力。
【具体实施方式】
[0015]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0016]本发明实例提出一种用于DC体外培养过程中提升DC对抗原的处理和提呈能力的DC诱导活化剂，该DC诱导活化剂能够在DC进行体外培养的过程中大大提升其抗原提呈能效、细胞活性，但同时又能保持其分化程度。本发明的DC诱导活化剂包括小细胞肺癌(Small Cell Lung Cancer，SCLC)特异性EGFR (epidermal growth factor receptor，表皮生长因子受体)和铝佐剂的混合物。
[0017]其中，EGFR本身是上皮生长因子细胞增殖和信号传导的受体，是一种糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体，EGFR在实体肿瘤中会存在高表达或异常表达，而EGFR的过表达或者异常表达是和肿瘤细胞的转移、侵润、预后差有关。因此在本发明中采用小细胞肺癌特异性EGFR，利用其本身具有很多肿瘤细胞表面结构簇，在DC进行培养的过程中作为模拟抗原对DC进行刺激和诱导，使其细胞活性能维持在较高的状态。同时，EGFR相比通常使用的人工合成和直接通过患者肿瘤切除组织的特意性抗原，除了结构簇丰富、效果好之外；更主要的是在体外液体培养环境或者存储过程中，人工合成和直接通过患者肿瘤切除组织抗原特性会逐渐的减弱，需要较严格的存储或者使用环境以保证其特效，而EGFR自身是糖蛋白，在胞内成熟之后，其形态结构不容易再发生较大的变化，抗原稳定性和存储便易度都更好。
[0018]针对DC培养中的液相培养的环境和过程结合上述EGFR，DC诱导活化剂进一步还包括有铝佐剂，其是一种优良的呈半胶状的蛋白吸附剂，能从溶液中强烈吸附蛋白质抗原，形成非变性的物理沉淀；当其接种到类似机体环境内后可形成一个“抗原库”，缓慢释放出抗原，充分延长了 EGFR的作用时间；并且更进一步还能对EGFR进行保护，避免EGFR在环境变化中发生自身结构或者性能变化、降解等等而导致抗原特性衰减的情形。同时，除了上述保护作用之外，铝佐剂自身也可以通过与DC质膜相互作用，提升DC的细胞活性，具有免疫佐剂功能；因此本发明的DC诱导活化剂最终能强化DC对抗原的处理和提呈能力，获得更强大的肿瘤特异性杀伤细胞。
[0019]在上述实施方式中，铝佐剂根据使用情况可以选择氢氧化铝、氢氧化铝凝胶、磷酸铝、硫酸铝、铵明矾及钾明矾中的至少一种。在实施中，基于其用于结合蛋白共同发挥效果的目的，一般根据用于蛋白质作为的溶剂和保护的PBS缓冲系，铝佐剂优选采用磷酸铝进行，可以尽量地避免额外引入其他的元素或者离子、基团等对培养过程中的培养液元素比例和成分造成破坏。进一步在使用中，根据铝佐剂吸附能力，DC诱导活化剂中小细胞肺癌特异性EGFR和铝佐剂的质量比控制在2:1?8:1。
[0020]在本发明提出的上述DC诱导活化剂的基础上，本发明进一步还提出一种DC体外培养的方法，包括如下步骤:
[0021]S10，从单个核细胞中获取DC ;
[0022]S20，将获取的DC进行体外培养；
[0023]S30，在体外培养的过程中用上述DC诱导活化剂对DC进行活化诱导。
[0024]其中，步骤S10中制备获取DC，在本发明实施中优选建议采用从新鲜血液中获取，相比经过冷库储存或者培养传代之后的DC，从新鲜血液中制备的DC离体时间不长，其细胞活性和状态的减弱或者形态改变程度都较少，更加利于保持其免疫性能。具体制备的过程可以按照通常DC制备试剂盒说明书进行制备获取，而在本发明中为了更适于本发明的诱导的效果和细胞活性，可以参考如下过程进行:
[0025]S11，获取新鲜血液(为了防止血液凝固，可以先用抗凝剂进行抗凝处理)；
[0026]S12，将血液300g离心分离后弃去血浆，取细胞沉淀物备用；
[0027]S13，用淋巴细胞分离液分离提取细胞沉淀物中的单个核细胞(PBMC)；
[0028]S14，将步骤S13获取的单个核细胞用基础培养