专利名称：一种金铁锁毛状根系的诱导与培养方法
技术领域：
本发明涉及一种利用生物技术诱导与培养毛状根系的方法，特别设计一种金铁锁 状根系的诱导与培养方法。
背景技术：
金铁锁是石竹科金铁锁属单种属植物(Psammosilene tunicoides W. C. Wu et C. Y. Wu)，为西南地区特有植物、民间常用草药。其根入药，常用于跌扑损伤、风湿痹痛、胃寒 痛、疮疖、创伤出血。是我国中成药保密品种“云南白药”的重要成分之一，也是多种知名中 成药的主要成份，如云南白药系列、云南红药胶囊、贵州金骨莲胶囊、福建痛血康胶囊等。近 年来随其药用需求量的不断增加，加上自然环境因素和人为作用，使金铁锁资源数量急剧 下降，目前已作为珍稀濒危物种列入《中国植物红皮书》中，属于国家二级重点保护植物。随着生物工程技术的发展，利用发根农杆菌诱导药用植物产生毛状根，并对毛状 根进行离体扩增培养，可以快速大量的提取植物体中有效化学成分，也是进行药用植物资 源可持续发展的有效途径之一。由于毛状根具有生长速度快、分枝多、弱向地性，处于器官 化水平，激素自养，生理生化、遗传特征稳定，有稳定的次生代谢物质合成能力，并且毛状根 培养不受环境、生态、气候等条件的限制。因此，利用毛状根培养技术标准化生产金铁锁替 代野生资源，不但可以缓解日益增长的市场需求，而且有利于保护、抢救和挖掘民族药，解 决日益严重的生态环保问题，也将会大大促进金铁锁等民族药的现代化发展。因此，建立金 铁锁毛状根培养系统大量生产金铁锁替代原材料具有重要意义目前，用发根农杆菌诱导形成的植物毛状根涉及到31科100余种双子叶植物，而 露水草(Cyanotis arachnoidea C. B. Clarke)是迄今单子叶植物中毛状根诱导成功的唯 一例子。毛状根培养与传统栽培获得中草药原材料相比具有如下优点(1)毛状根中染色 体和次生代谢产物的生物合成相对稳定；(2)毛状根不仅生长速度快，而且次生代谢产物 含量高，(3)不受病虫害、地理和季节等各种环境因素的影响；(4)所获得的产物可从培养 体系内直接提取，并快速、高效的回收与利用，简化了分离与纯化的步骤；(5)有利于细胞 筛选、生物转化，合成新的有效成分；(6)有利于研究植物的代谢途径，还可以利用某些基 因工程手段探索与创造新的合成路线，得到价值更高的产品；(7)节省大量用于种植原料 的农田。正是由于毛状根的上述优点，为其工业化、规模化生产优质中草药原材料提供了基 础，成为继组织培养、细胞培养之后当代生物技术领域重要的研究和开发热点。 利用植物毛状根进行天然产物的生产进入了一个崭新的发展阶段，植物细胞培养 技术生产的次生代谢产物被人类广泛应用。通过毛状根培养可以生产的次生代谢产物有生 物碱类(如莨菪烷生物碱、喹啉生物碱)、甙类、黄酮类、醌类和一些重要的酶(如超氧化物 歧化酶)等。人参毛状根的生长速度是常规激素诱导根生长速度的2倍(Yochikawa，1987)； 莨菪毛状根无性系合成莨菪碱的效率是原植物的2倍以上(Mano 1986)；刘春超和刘本叶 等对青蒿毛状根的培养条件和代谢组学进行了研究；研究发现栝楼毛状根生产天花粉蛋白 克鲜重含量到8. 16毫克。这些研究充分表明，毛状根培养体系正在成为生产次生代谢产物的重要生物技术之一。
发明内容
本发明的目的是 公开一种金铁锁毛状根系高效诱导与培养方法.本发明金铁锁毛状根系诱导与培养方法为取金铁锁幼嫩茎为外植体进行脱分化处理，获得新鲜金铁锁愈伤组织，将愈伤组 织与含有Ri质粒的发根农杆菌(ACCC10060，保藏单位缩写和菌种编号)共培养，以无菌 纸吸取多余菌液后转入到诱导培养基中诱导培养，在金铁锁愈伤组织处生长出金铁锁毛状 根；抑菌培养后将具有毛状根的外植体放入扩增培养基中进行毛状根的扩大培养。所述金铁锁幼嫩茎脱分化处理时，是取1 2cm金铁锁幼嫩茎段置于MS+2， 4-Da5mgA+NAAa3mgA培养基中，25°C 士 1下暗培养20d。获得新鲜金铁锁愈伤组织；所述发根 农杆菌与金铁锁愈伤组织共培养前，先在固体YEB培养基中25V 士 1下培养2 3d ；然后 选取单克隆到液体YEB培养基中振荡培养，菌液离心收集菌体；将菌体置于MS液体培养基 中混勻；所述共培养培养基为lOOumol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基。共培养时间为Id ； 所述诱导培养基为含有500mg/L头孢噻肟钠的MS固体培养基；所述介导转化的外植体放入 抑菌培养基中于25°C 士 1暗黑培养，每3 6d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直 至将菌除净；所述将抑菌处理后具有毛状根的外植体放入毛状根扩增培养是在25°C 士1暗 黑振荡培养；所述扩增培养基为无激素1/2MS液体基本培养基；所述振荡培养箱摇床转速 为 110 120r · mirT1。本发明金铁锁毛状根系诱导与培养方法为(1)将金铁锁幼嫩茎剪成1 5cm的小段，无菌操作台中用升汞处理6 13分钟， 酒精浸泡5 10秒，无菌水冲洗3 8遍后转入到MS+2，4-DO. 5mg/L+NAA0. 3mg/L培养基 中，25°C 士3下暗培养10 35d，获得金铁锁愈伤组织。(2)将发根农杆菌ACCC10060菌株用1 μ L无菌水稀释后的菌液涂布在20mL YEB 固体培养基上，25°C 士 3下暗培养1 6d长出克隆菌体。(3)挑取1菌环单菌落接种于50mL液体YEB培养基中，25°C 士 3振荡培养，培养 12小时，OD值为0. 3 1. 2.取Iml菌液置于IOOmlYEB液体培养基中振荡培养，培养8小 时，OD值为0. 3 0. 9.收集菌液，3500rpm下离心5 15分钟收集菌体。(4)将(3)收集的菌体置于IOOml含有lOOumol/L乙酰丁香酮、0. 9%琼脂的MS固
体培养基中并混勻。(5)用(4)混勻后得到的菌液浸染金铁锁愈伤组织10 30分钟，取出后用无菌纸 吸取多余的菌液，将浸染的金铁锁愈伤组织接入到含有lOOumol/L乙酰丁香酮、0. 9%琼脂 的MS固体培养基中1 3天。(6)把含有500mg/L头孢噻肟钠的无激素MS固体培养基作为诱导培养基，将(5) 浸染后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养；每2 9d继代培养一次，至少 五次的抑菌培养处理，直至将菌除净。(7)用无激素V2MS液体培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后Ig的诱导 出来的毛状根放入30mL的扩增培养基中，暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为110 120r · min—lo
本发明金铁锁毛状根系高效诱导与培养优选方法为(1)将金铁锁幼嫩茎剪成2cm的小段，无菌操作台中用升汞处理7分钟，酒精浸泡 6秒，无菌水冲洗4遍后转入到MS+2，4-D0. 5mg/L+NAA0. 3mg/L培养基中，25°C 士 2下暗培养 12d，获得金铁锁愈伤组织。(2)将发根农杆菌A4菌液涂于YEB固体培养基中，25°C 士3下暗培养4d长出单克
隆。 (3)挑取发根农杆菌A4克隆菌体置于YEB培养基中，25°C 士2振荡培养，OD值为
0.5.取Iml菌液置于IOOmlYEB液体培养基中振荡培养，OD值为0. 5.收集菌液，3500rpm下 离心7分钟收集菌体。(4)将(3)收集的菌体置于IOOml含有lOOumol/L乙酰丁香酮、0. 9%琼脂的MS固
体培养基中并混勻。(5)用(4)混勻后得到的菌液浸染金铁锁愈伤组织12分钟，取出后用无菌纸吸取 多余的菌液，将浸染的金铁锁愈伤组织接入到含有lOOumol/L乙酰丁香酮、0. 9%琼脂的MS 固体培养基中2天。(6)把含有500mg/L头孢噻肟钠的无激素MS固体培养基作为诱导培养基，将(5) 浸染后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养；每7d继代培养一次，至少五 次的抑菌培养处理，直至将菌除净。(7)把无激素1/2MS液体基本培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后的毛状根外 植体放入该扩增培养基中，暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为Iio 120r · min-1。本发明金铁锁毛状根系高效诱导与培养优选方法为(1)将金铁锁幼嫩茎剪成4cm的小段，无菌操作台中用升汞处理11分钟，酒精浸 泡8秒，无菌水冲洗7遍后转入到MS+2，4-D0. 5mg/L+NAA0. 3mg/L培养基中，25°C 士2下暗 培养33d，获得金铁锁愈伤组织。(2)将发根农杆菌A4菌液涂于YEB固体培养基中，25°C 士3下暗培养5d长出单克隆。(3)挑取发根农杆菌A4克隆菌体置于YEB培养基中，25°C 士2振荡培养，OD值为
1.取Iml菌液置于IOOmlYEB液体培养基中振荡培养，OD值为0.7.收集菌液，3500rpm下 离心12分钟收集菌体。(4)将(3)收集的菌体置于100ml含有lOOumol/L乙酰丁香酮、0. 9%琼脂的MS固
体培养基中并混勻。(5)用(4)混勻后得到的菌液浸染金铁锁愈伤组织25分钟，取出后用无菌纸吸取 多余的菌液，将浸染的金铁锁愈伤组织接入到含有lOOumol/L乙酰丁香酮、0. 9%琼脂的MS 固体培养基中2天。(6)把含有500mg/L头孢噻肟钠的无激素MS固体培养基作为诱导培养基，将(5) 浸染后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养；每4d继代培养一次，至少五 次的抑菌培养处理，直至将菌除净。(7)把无激素1/2MS液体基本培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后的毛状根外 植体放入该扩增培养基中，暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为Iio 120r · min-1。
图1发根农杆菌介导Ri质粒转化金铁锁愈伤组织产生发根的照片图2金铁锁毛状根扩增后悬浮培养的照片下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。实验例1毛状根系PCR检测1、基因组DNA微量提取1. 1取1. Og经过筛选的毛状根在液氮下研磨，放入50ml离心管，加入20ml 提取缓冲液(IOOmM Tris-HCl，PH 8. 0 ；0.35mMSorbitol ；5mMEDTA, pH 8. 0 ；1 % 2-Mercaptoethanol),置于冰上。2. 240C，IOOOOg离心10分钟，去上清液，用20ml提取缓冲液溶解沉淀两次并离心。3. 3去上清液并用5ml提取缓冲液悬浮沉淀，加入3. 5ml高盐CTAB缓冲液(50mM Tris-HCl, pH 8. 0 ；4M NaCl ；1. 8% CTAB ；25mM EDTA, pH 8. 0)和 0. 3ml Sarkosyl (浓度为 30 %的水溶液)，55 °C孵育70分钟。4. 4加入等体积的氯仿异戊醇(24 1)，IOOOOg离心10分钟。去上清液加入2/3 体积预冷的混合有1/10体积乙酸钠的异丙醇。4°C，IOOOOg离心20分钟。去上清液，用冷 的75%的乙醇洗涤沉淀。去乙醇，在空气中干燥DNA，并用200 μ L TE缓冲液(IOmM Tris, pH 8. 0 ； ImM EDTA，pH 8. 0)溶解。5. 5加入10 μ L Rnase (lmg/ml)在37°C下孵育40分钟，加入等体积的酚氯仿，抽 提去除蛋白质。室温下，15000g离心10分钟。5. 6取上清液加入等体积预冷的100%的氯仿，沉淀去除蛋白质。室温下高速离心 10分钟。5. 7取上清加入两倍体积的冷的无水乙醇(混合1/10体积的乙酸钠)，沉淀DNA 然后将其放于-20°C下30分钟。5. 818000rpm下离心沉淀DNA 15分钟。用75%的冷的乙醇洗涤DNA沉淀，并在空 气中干燥。用50-100 μ L TE缓冲液溶解DNA。2、毛状根的PCR检测取经过筛选的毛状根IOOng的基因组DNA为模板，以试管苗正常根作为阴 性对照，Ri质粒为阳性对照。rolC基因的引物序列(宝生物合成)引物I序列 5:GATATATGCCAAATTTACACTAG-3、引物 II 序列 _GTTAACAAAGTAGGAAACAGG_3~。PCR反应总体系为50ul
Taq Mix 25ul
引物 I2 (20pmol) ul
引物II2 (20pmol) ul
模板5 (IOOng) ul
去离子无菌水16ul在PCR仪(UN0II，Biometra)中进行反应，反应程序为 94°C，45s ；45°C,30s ；72°C, 45s共30个循环，72°C延长lOmin。
证明了 T-DNA整合到金铁锁基因组诱导形成毛状根。3、PCR-Southern分子杂交 检测目的基因3. 1 转膜将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。将电泳胶在变性液中浸泡1小时，中途换一次 液。用去离子水漂洗一次，然后转入中和液中浸泡1小时。取一块洁净玻璃板，其上方铺一 土夬 whatman3MM 滤纸，盘内倒入适量转移液 20XSSC(5M NaCl ；0. 3M Na3Citrate, pH 8.0)， 并使滤纸两端下垂完全浸入转移液。用转移液湿润滤纸，排除它与玻璃板之间的气泡。剪 取一块与凝胶大小相同的尼龙膜，漂浮于去离子水中使其完全湿润，然后置于20XSSC中5 分钟。将中和后的凝胶上下倒置后置于已浸润的Whatman3MM滤纸上方。将浸湿的尼龙膜 覆盖到凝胶上。以2XSSC浸湿两张与凝胶大小等同的Whatman3MM滤纸，并覆盖于已经湿 润的尼龙膜上方。剪裁一叠与凝胶大小相同的吸水纸，高5-8厘米，置于Whatman3MM滤纸 上，吸水纸上方置一块玻璃板。利用虹吸作用使DNA从凝胶转移到尼龙膜上。3. 2用Alkphos DIRECT试剂盒制备探针用80 μ L Alkphos DIRECT试剂盒提供的水稀释20 μ L交联剂溶液，制成交联剂工 作液。将含有rolC基因片段的质粒进行PCR反应，以扩增出大量的rolC基因片段。将PCR 反应的产物进行电泳，用UNIQ-IO柱式DNA回收试剂盒回收并纯化扩增出来的rolC基因片 段。将该DNA片段稀释到IOng/μ 1，置于沸水浴中加热15分钟使其变性，然后迅速置于冰 上5分钟。依次向其中加入10μ IL反应液和2μ L标记试剂，轻轻混勻。最后加入10 μ L 交联剂工作液，轻混后在37。C反应30分钟。3. 3预杂交与杂交转膜后将膜放于杂交缓冲液(把NaCl加入杂交缓冲液中，使其终浓度为0. 5M，再 加入阻断剂至终浓度为4% (w/v)，立即混合成阻断液悬液，继续室温混合1-2小时，55°C下 在杂交炉中进行10分钟的预杂交，然后向以上杂交缓冲液中加入制备好的探针，55°C杂交 过夜。3. 4 洗膜取出杂交后的膜，分别用初次洗液(2M尿素，0. SDS，50mM磷酸二氢钠，150mM NaCl，ImM MgC12，0. 2% 阻断剂)和二次洗液(1M Tris base，0. 3M 柠檬酸钠液，pH 7.0)洗 去膜上与DNA非特异性结合的探针。3. 5 显影将洗好的尼龙膜用保鲜膜包好，上压一张X光胶片，置于黑暗处曝光2-3个小时。 用显影液和定影液冲洗X光胶片，以得到清晰的X光显影胶片。下述实施例均能实现上述实验例所述的效果。
具体实施例方式实施例1 (1)将金铁锁幼嫩茎剪成2cm的小段，无菌操作台中用升汞处理7分钟，酒精浸泡 6秒，无菌水冲洗4遍后转入到MS+2，4-D0. 5mg/L+NAA0. 3mg/L培养基中，25°C 士 2下暗培养 12d，获得金铁锁愈伤组织。(2)将发根农杆菌A4菌液涂于YEB固体培养基中，25°C 士3下暗培养4d长出单克隆。 (3)挑取发根农杆菌A4克隆菌体置于YEB培养基中，25°C 士2振荡培养，OD值为
0.5.取Iml菌液置于IOOmlYEB液体培养基中振荡培养，OD值为0. 5.收集菌液，3500rpm下 离心7分钟收集菌体。(4)菌体置于IOOml含有lOOumol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基中并混勻。(5)将金铁锁愈伤组织浸染于上述菌液中12分钟，取出后用无菌纸吸取多余的菌 液，接入到共培养基中2天。(6)把含有500mg/L头孢噻肟钠的无激素MS固体培养基作为诱导培养基，将浸染 后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养。每7d继代培养一次，至少五次的 抑菌培养处理，直至将菌除净。(7)把无激素1/2MS液体基本培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后的毛状根外 植体放入该扩增培养基中，暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为Iio 120r · min-1。实施例2 (1)将金铁锁幼嫩茎剪成4cm的小段，无菌操作台中用升汞处理11分钟，酒精浸 泡8秒，无菌水冲洗7遍后转入到MS+2，4-D0. 5mg/L+NAA0. 3mg/L培养基中，25°C 士2下暗 培养33d，获得金铁锁愈伤组织。(2)将发根农杆菌A4菌液涂于YEB固体培养基中，25°C 士3下暗培养5d长出单克隆。(3)挑取发根农杆菌A4克隆菌体置于YEB培养基中，25°C 士2振荡培养，OD值为
1.取Iml菌液置于IOOmlYEB液体培养基中振荡培养，OD值为0.7.收集菌液，3500rpm下 离心12分钟收集菌体。(4)菌体置于IOOml含有lOOumol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基中并混勻。(5)将金铁锁愈伤组织浸染于上述菌液中25分钟，取出后用无菌纸吸取多余的菌 液，接入到共培养基中2天。(6)把含有500mg/L头孢噻肟钠的无激素MS固体培养基作为诱导培养基，将浸染 后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养。每4d继代培养一次，至少五次的 抑菌培养处理，直至将菌除净。(7)把无激素1/2MS液体基本培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后的毛状根外 植体放入该扩增培养基中，暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为Iio 120r · min-1。实施例3:(1)将金铁锁幼嫩茎剪成1 2cm的小段，无菌操作台中用升汞处理8 10分钟， 酒精浸泡8秒，无菌水冲洗5遍后转入到MS+2，4-DO. 5mg/L+NAA0. 3mg/L培养基中，25°C 士 1 下暗培养20d，获得金铁锁愈伤组织。(2)将发根农杆菌A4菌液涂于YEB固体培养基中，25°C 士 1下暗培养2 3d长出
单克隆。(3)挑取发根农杆菌A4克隆菌体置于YEB培养基中，25°C 士 1振荡培养，OD值 为0. 6 0. 8.取Iml菌液置于IOOmlYEB液体培养基中振荡培养，OD值为0. 6.收集菌液， 3500rpm下离心10分钟收集菌体。(4)菌体置于100ml含有lOOumol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基中并混勻。
(5)将金铁锁愈伤组织浸染于上述菌液中20分钟，取出后用无菌纸吸取多余的菌 液，接入到共培养基中1天。 (6)把含有500mg/L头孢噻肟钠的无激素MS固体培养基作为诱导培养基，将浸染 后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养。每3 6d继代培养一次，至少五 次的抑菌培养处理，直至将菌除净。(7)把无激素1/2MS液体基本培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后的毛状根外 植体放入该扩增培养基中，暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为Iio 120r · min-1。
权利要求
1.一种金铁锁毛状根系高效诱导与培养方法，其特征在于该方法为取金铁锁幼嫩茎为外植体进行脱分化处理，获得新鲜金铁锁愈伤组织，将愈伤组织与 含有Ri质粒的发根农杆菌共培养，以无菌纸吸取多余菌液后转入到诱导培养基中诱导培 养，在金铁锁愈伤组织处生长出金铁锁毛状根；抑菌培养后将具有毛状根的外植体放入扩 增培养基中进行毛状根的扩大培养。
2.如权利要求1所述的金铁锁毛状根系高效诱导与培养方法，其特征在于该方法中所 述金铁锁幼嫩茎脱分化处理时，是取1 2cm金铁锁幼嫩茎段置于1^+2，4-队.5 ^+織~3 ^ 培养基中，25°C 士 1下暗培养20d ；获得新鲜金铁锁愈伤组织。
3.如权利要求1所述的金铁锁毛状根系高效诱导与培养方法，其特征在于该方法中所 述发根农杆菌与金铁锁愈伤组织共培养，是先在固体YEB培养基中25°C 士 1下培养2 3d ； 然后选取单克隆到液体YEB培养基中振荡培养，菌液离心收集菌体；将菌体置于MS液体培 养基中混勻。
4.如权利要求1所述的金铁锁毛状根系高效诱导与培养方法，其特征在于该方法中所 述共培养培养基为lOOumol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基，共培养时间为Id ；所述诱导培 养基为含有500mg/L头孢噻肟钠的MS固体培养基。
5.如权利要求1所述的金铁锁毛状根系高效诱导与培养方法，其特征在于该方法中所 述介导转化的外植体放入抑菌培养基中于25°C 士 1暗黑培养，每3 6d继代培养一次，至 少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净。
6.如权利要求1所述的金铁锁毛状根系高效诱导与培养方法，其特征在于该方法中 所述将抑菌处理后具有毛状根的外植体放入毛状根扩增培养是在25°C 士 1暗黑振荡培 养；所述扩增培养基为无激素1/2MS液体基本培养基，所述振荡培养箱摇床转速为110 120r · mirT1。
7.一种金铁锁毛状根系高效诱导与培养方法，其特征在于该方法为(1)将金铁锁幼嫩茎剪成1 5cm的小段，无菌操作台中用升汞处理6 13分钟，酒 精浸泡5 10秒，无菌水冲洗3 8遍后转入到MS+2，4-DO. 5mg/L+NAA0. 3mg/L培养基中， 250C 士 3下暗培养10 35d，获得金铁锁愈伤组织；(2)将发根农杆菌ACCC10060菌株用1μ L无菌水稀释后的菌液涂布在20mL YEB固体 培养基上，25°C 士3下暗培养1 6d长出克隆菌体；(3)挑取1菌环单菌落接种于50mL液体YEB培养基中，25°C士 3振荡培养，培养12小 时，OD值为0. 3 1. 2.取Iml菌液置于IOOmlYEB液体培养基中振荡培养，培养8小时，OD 值为0. 3 0. 9.收集菌液，3500rpm下离心5 15分钟收集菌体；(4)将(3)收集的菌体置于IOOml含有lOOumol/L乙酰丁香酮、0.9%琼脂的MS固体培 养基中并混勻；(5)用(4)混勻后得到的菌液浸染金铁锁愈伤组织10 30分钟，取出后用无菌纸吸取 多余的菌液，将浸染的金铁锁愈伤组织接入到含有lOOumol/L乙酰丁香酮、0. 9%琼脂的MS 固体培养基中1 3天；(6)把含有500mg/L头孢噻肟钠的无激素MS固体培养基作为诱导培养基，将( 浸染 后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养；每2 9d继代培养一次，至少五次 的抑菌培养处理，直至将菌除净；(7)用无激素1/2MS液体培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后Ig的诱导出来的毛状 根放入30mL的扩增培养基中，暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为110 120r · min-1。
8.如权利要求7所述的金铁锁毛状根系高效诱导与培养方法，其特征在于该方法为(1)将金铁锁幼嫩茎剪成2cm的小段，无菌操作台中用升汞处理7分钟，酒精浸泡6秒， 无菌水冲洗4遍后转入到MS+2，4-D0. 5mg/L+NAA0. 3mg/L培养基中，25°C 士 2下暗培养12d， 获得金铁锁愈伤组织；(2)将发根农杆菌A4菌液涂于YEB固体培养基中，25°C士3下暗培养4d长出单克隆；(3)挑取发根农杆菌A4克隆菌体置于YEB培养基中，25°C士2振荡培养，OD值为 0. 5.取Iml菌液置于IOOmlYEB液体培养基中振荡培养，OD值为0. 5.收集菌液，3500rpm下 离心7分钟收集菌体；(4)将(3)收集的菌体置于IOOml含有lOOumol/L乙酰丁香酮、0.9%琼脂的MS固体培 养基中并混勻；(5)用(4)混勻后得到的菌液浸染金铁锁愈伤组织12分钟，取出后用无菌纸吸取多余 的菌液，将浸染的金铁锁愈伤组织接入到含有lOOumol/L乙酰丁香酮、0. 9%琼脂的MS固体 培养基中2天；(6)把含有500mg/L头孢噻肟钠的无激素MS固体培养基作为诱导培养基，将( 浸染 后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养；每7d继代培养一次，至少五次的 抑菌培养处理，直至将菌除净；(7)把无激素1/2MS液体基本培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后的毛状根外植体 放入该扩增培养基中，暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为110 120r · min-1。
9.如权利要求7所述的金铁锁毛状根系高效诱导与培养方法，其特征在于该方法为(1)将金铁锁幼嫩茎剪成4cm的小段，无菌操作台中用升汞处理11分钟，酒精浸泡8 秒，无菌水冲洗7遍后转入到MS+2，4-D0. 5mg/L+NAA0. 3mg/L培养基中，25°C 士 2下暗培养 33d，获得金铁锁愈伤组织；(2)将发根农杆菌A4菌液涂于YEB固体培养基中，25°C士3下暗培养5d长出单克隆；(3)挑取发根农杆菌A4克隆菌体置于YEB培养基中，25°C士2振荡培养，OD值为1.取 Iml菌液置于IOOmlYEB液体培养基中振荡培养，OD值为0. 7.收集菌液，3500rpm下离心12 分钟收集菌体；(4)将(3)收集的菌体置于100ml含有lOOumol/L乙酰丁香酮、0.9%琼脂的MS固体培养基中并混勻；(5)用(4)混勻后得到的菌液浸染金铁锁愈伤组织25分钟，取出后用无菌纸吸取多余 的菌液，将浸染的金铁锁愈伤组织接入到含有lOOumol/L乙酰丁香酮、0. 9%琼脂的MS固体 培养基中2天；(6)把含有500mg/L头孢噻肟钠的无激素MS固体培养基作为诱导培养基，将( 浸染 后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养；每4d继代培养一次，至少五次的 抑菌培养处理，直至将菌除净；(7)把无激素1/2MS液体基本培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后的毛状根外植体 放入该扩增培养基中，暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为110 120r · min-1。
全文摘要
本发明公开一种金铁锁毛状根系高效诱导与培养方法，该诱导与培养方法为取金铁锁幼嫩茎为外植体进行脱分化处理，获得新鲜金铁锁愈伤组织，将愈伤组织与含有Ri质粒的发根农杆菌(ACCC10060，保藏单位缩写和菌种编号)共培养，以无菌纸吸取多余菌液后转入到诱导培养基中诱导培养，在金铁锁愈伤组织处生长出金铁锁毛状根；抑菌培养后将具有毛状根的外植体放入扩增培养基中进行毛状根的扩大培养。
文档编号C12Q1/68GK102057868SQ200910237579
公开日2011年5月18日 申请日期2009年11月18日 优先权日2009年11月18日
发明者刘同祥, 崔箭, 张宗申, 张继永, 王伟, 韦玮 申请人:刘同祥