专利名称：Hiv-1前体蛋白早成熟化诱导剂的筛选方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种筛选Hiv-I前体蛋白早成熟化诱导剂的 筛选方法。
背景技术：
艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)是由人免疫缺陷病毒 (human immunodeficiency virus, HIV)感染导致人体免疫机能缺陷，而易于发生机会性感 染和肿瘤的临床综合征。在过去的20多年里造成2000多万人死亡，目前全世界艾滋病病 毒感染者已达4000万左右。艾滋病不仅成为我国严重的卫生健康问题，同时每年造成了上 千亿的直接经济损失。据中国卫生部2008年通报，全国累计报告HIV感染者达25万多人， 预计则高达约70万人。目前临床使用的传统的抗艾滋病药物虽在抗HIV-I方面起到了很大的作用，但仍 存在一些问题，如在人体内活性不高、口服生物利用度低、易产生耐药性或交叉耐药性及生 产成本高等。耐药是病毒的药物作用靶位蛋白变异的结果。因为耐药株经常对一组抗病毒 药物耐药，并且同一类药物之间交叉耐药非常常见。因此，急需寻找作用于新靶点的高效低 毒的抗艾滋病药物。21世纪以来，研究人员的视线已集中到很多的新的靶点上。HIV-I基因组由两条单链正链RNA组成，每个基因组约为9. 71Λ。结构上包括 LTR，结构蛋白编码区(gag)，多种酶活性的蛋白编码区(pol)，外膜蛋白(erw)编码区以 及6个调节基因。gag基因编码病毒的核心蛋白，翻译时先形成一个分子量大约是55kD 的前体蛋白(P55)，然后在HIV蛋白酶的作用下裂解成matrix(MA)、Capsid(CA)、p2、 nucleocapsid(NC)、pl和p6g#。pol基因产物与各种酶的功能相关，如HIV-1蛋白酶(PR)， 逆转录酶(RT)、整合酶(IN)等。Pol基因不能单独翻译，gag基因翻译过程中，会有5% 10%的几率发生特定的移码，使翻译继续下去，得到160kD的feig-Pol。Gag-Pol在HIV蛋 白酶的作用下裂解成MA、CA、p2、NC、移码蛋白(TF)、PR、RT、IN。HIV-I蛋白酶(protease，PR)是由HIV-lpol基因5，端所编码。该酶含99个氨 基酸，属天冬氨酸蛋白酶。全酶为旋光对称的同源二聚体，而二者界面形成酶活性中心。 HIV-II3R作为前体蛋白(precursor)Gag-Pol的一部分被翻译出来，前体蛋白形式的I3R处于 无活性状态。Gag-Pol通过与HIV-I另一前体蛋白Gag相互结合，形成未成熟的病毒颗粒。 病毒颗粒装配完成后，在病毒出芽或者出芽后的瞬间，Gag-Pol中的I3R被激活，将feg-Pol 和(iag剪切成为较小的成熟结构蛋白和酶(包括逆转录酶和整合酶)，这个过程称为病毒的 成熟化。只有经过PR酶切加工形成的成熟病毒颗粒才具有感染性。目前，针对HIV-IPR的药物研究集中在抑制其活性上，使前体蛋白Gag和(iag-Pol 不能被酶切成为结构蛋白和酶，不能形成成熟的病毒颗粒，从而可达到抗病毒的效果。HIV 蛋白酶抑制剂(proteaseinhibitor，PI)自1995年应用于临床以来已取得了显著成果，但 易产生耐药及交叉耐药，且不能彻底治愈艾滋病。HIV-II3R活性的严格调控对于病毒的生存至关重要。研究表明，如果feig-Pol中的3I3R在装配完成前被激活，会导致前体蛋白(iag-Pol和Gag被提前酶切加工，这一过程被统称 为前体蛋白早成熟化(premature)。一旦发生前体蛋白早成熟化，病毒颗粒便无法装配，因 此病毒颗粒的产量将显著减少，甚至无病毒颗粒产生。目前，HIV-I病毒装配完成前，细胞 内Gag-Pol中I3R活性的抑制机制，以及装配完成后，I3R被迅速激活的机制尚不清除。尽管 如此，如果能干扰HIV-PR活性的调控机制，特异性的激活前体蛋白中的PR，诱导前体蛋白 早成熟化，就可以直接抑制病毒的复制。然而，到目前还没有一种能够用于筛选这种诱导剂 的方法。
发明内容
针对上述不足，本发明提供一种HIV-I前体蛋白早成熟化诱导剂的筛选方法。本发明提供的HIV-I前体蛋白早成熟化诱导剂的筛选方法，包括步骤将表达 Gag/Gag-Pol的质粒与表达融合蛋白A的质粒共转染宿主细胞，添加待检样品至共转染后 的宿主细胞，检测细胞BRETl ratio的变化，BRETl ratio下降，则待检样品为早成熟化诱 导剂。所述融合蛋白A为由p2/p7连接的，一端为荧光素酶，另一端为荧光素酶激发受体的 融合蛋白。上述荧光素酶与荧光素酶激发受体之间能够产生生物发光共振能量转移 1 (Bioluminescence resonance energy transferl，BRET1)0上述荧光酶可选自海肾荧光素酶。相应的荧光酶激发受体可选自EYFP、EGFP、YFP、GFP。在发明实例中，一种优选的融合蛋白为EYFP-p2/p7-Rluc。所述表达feig/feig-Pol 的质粒为PVRC4200质粒。所述表达融合蛋白A的质粒为pEYFP-p2/p7-Rluc。所述宿主细 胞为细胞。具体地首先构建表达融合蛋白EYFP-p2/p7-Rluc的质粒pEYFP-p2/p7-Rluc，将其 与表达feig/feig-Pol的质粒pVRC4200质粒共转染细胞，转染24h后，添加样品至转染 后的细胞，再培养16h，检测细胞BRETl ratio的变化。如样品对该模型有效，即能够 提前激活Gag-Pol中的PR,则BRETl ratio下降。本发明运用生物发光共振能量转移l(Bioluminescence resonanceenergy transferl,BRETl)技术，建立了细胞水平的HIV-I前体蛋白早成熟化激活剂筛选模型。这 一模型的原理为在增强的黄色荧光蛋白(EYFP)和海肾荧光素酶(Renilla luciferase, Rluc)之间插入HIV-I PR的识别序列p2/p7 (ATI匪QRG)，表达为融合蛋白EYFP_p2/ p7-Rluc,力口 入 Rluc 底物 coelenterazine h ( λ em 475nm)，在 Rluc 与 EYFP 距离小于 IOOA时，催化产生的光波能量转移，激发受体EYFP (λ em 535nm)。生物发光共振能量转 移比例(BRET1 ratio) = 535nm发射光强度/475nm发射光强度(表达融合蛋白EYFP_p2/ p7-RluC)-535nm发射光强度/475nm发射光强度(只表达蛋白IUuc)。同HIV-1基因组 相似，PVRC4200表达Gag和feig-Pol，两者比例20 1，可形成病毒样颗粒(Virus-like particles, VLPs)。将 pEYFP-p2/p7_Rluc 质粒与 pVRC4200 质粒共转染 细胞，如加入 的化合物能够提前激活feig-Pol中的PR，细胞内的HIV-II3R活性升高，HIV-IPR识别EYFP 和Rluc之间的p2/p7序列，酶切融合蛋白EYFP-p2/p7-Rluc，使得EYFP和Rluc分开，距离 大于100A,将无生物发光共振能量转移现象，BRETl ratio将下降。4
本发明方法提供了一种用于HIV-I前体蛋白早成熟化诱导剂筛选的方法，利用该 方法能够方便、快速地筛选早成熟化诱导剂，对HIV的治疗药物的筛选提供了新途径。
图1 是 pEYFP-p2/p7_Rluc 的质粒图谱；图2是pVRC4200的质粒图谱。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例11构建表达载体应用PCR扩增pEYFP-Nl (Clontech公司)质粒中的EYFP基因片段。所用引物 上游引物 5' -TAG TAC AAG CTT C GCC ACCATG GTG AGC AAG-3 ‘，下游引物 5' -TGA TTA GGA TCC CTTGTA CAG CTC GTC CAT GC-3'。反应体系
权利要求
1.HIV-I前体蛋白早成熟化诱导剂的筛选方法，其特征在于将表达feig/feig-Pol的质 粒与表达融合蛋白A的质粒共转染宿主细胞，添加待检样品至共转染后的宿主细胞，检测 细胞BRETl ratio的变化，BRETl ratio下降，则待检样品为早成熟化诱导剂，所述融合蛋白A为由p2/p7连接的，一端为荧光素酶，另一端为荧光素酶激发受体的融 合蛋白，该荧光素酶与荧光素酶激发受体之间能够产生生物发光共振能量转移1。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光酶选自海肾荧光素酶。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述荧光酶激发受体选自EYFP、EGFP、 YFP, GFP0
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白为EYFP-p2/p7-RluC。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述表达(iag/feig-Pol的质粒为 PVRC4200 质粒。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述表达融合蛋白A的质粒为 pEYFP-p2/p7-Rluc。
7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为细胞。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤构建表达融合蛋白 EYFP-p2/p7-Rluc 的质粒 pEYFP_p2/p7_Rluc，将其与表达 Gag/Gag-Pol 的质粒 pVRC4200 质粒共转染细胞，转染24h后，添加样品至转染后的细胞，再培养16h，检测细胞 BRETl ratio 的变化。
全文摘要
本发明提供了一种用于HIV-1前体蛋白早成熟化诱导剂的筛选方法，其将表达Gag/Gag-Pol的质粒与表达融合蛋白A的质粒共转染宿主细胞，添加待检样品至共转染后的宿主细胞，检测细胞BRET1ratio的变化，BRET1 ratio下降，则待检样品为早成熟化诱导剂，所述融合蛋白A为由p2/p7连接的，一端为荧光素酶，另一端为荧光素酶激发受体的融合蛋白，该荧光素酶与荧光素酶激发受体之间能够产生生物发光共振能量转移1。利用本发明方法能够方便、快速地筛选早成熟化诱导剂，对HIV的治疗药物的筛选提供了新途径。
文档编号C12Q1/66GK102051407SQ200910237160
公开日2011年5月11日 申请日期2009年11月9日 优先权日2009年11月9日
发明者刘振龙, 岑山, 张全, 李晓宇, 杨亮, 贾平平, 魏晓露 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所