专利名称：α1β1整联蛋白的可诱导的配体和用途的制作方法
背景一种特殊的整联蛋白受体——整联蛋白α1β1，在与阿尔波特综合征(Alport syndrome)相关的间质病的发展过程中发挥作用。这种作用是通过将阿尔波特小鼠(Alport mouse)与整联蛋白α1基因剔除小鼠杂交证实的(Cosgrove等，Am.J.Path.，157，1649-1659(2000))。尽管该整联蛋白在肾脏中广泛表达，但所述整联蛋白剔除突变对正常小鼠的肾脏发育或功能没有明显影响(Gardner等，Dev.Biol.175，301-313(1996))。不过，当在阿尔波特小鼠的遗传背景中添加α1整联蛋白突变时，显著减轻了肾小球病和肾小管间质病。肾小球病理的减轻与对肾小球膜扩张的影响和GBM中肾小球膜层粘连蛋白的沉积相关(Cosgrove等，Am.J.Path.，157，1649-1659(2000))。不过，α1整联蛋白无效突变对肾小管间质病的影响尚不很清楚。
概述本发明正是基于发现在阿尔波特小鼠肾的血管内皮细胞表面上存在特异的，可诱导的配体。重要的是，由此提供了多种治疗方法和鉴定适合用于所述治疗方法中的化合物(例如，小有机分子和肽)的方法。
优选地是，该特异的可诱导的配体存在于阿尔波特小鼠肾而不是正常肾的血管内皮细胞表面上。该配体结合纯化的整联蛋白α1β1，并且阿尔波特(Alport)肾中单核细胞是整联蛋白α1β1-阳性的。根据单核细胞运输测定，新流出的单核细胞是整联蛋白α1β1-阳性的，而只有一部分骨髓衍生的单核细胞(10％)是整联蛋白α1β1-阳性的。整联蛋白α1β1-缺陷型阿尔波特(DKO)小鼠中单核细胞流出速度比非阿尔波特小鼠中的流出速度低得多。通过注射纯化的整联蛋白α1β1(从Chemicon，Temecula，CA购买)功能性地阻断所述配体降低了单核细胞流入阿尔波特肾的间质间隙的速度。总之，该证据证明了阿尔波特血管内皮上存在整联蛋白α1β1的可诱导的配体，该配体介导整联蛋白α1β1-阳性单核细胞选择性流入间质。DKO数据显示流出开始的延迟，流出速度慢得多，DKO数据与通过注射纯化的α1β1整联蛋白得到的配体阻断数据一起说明了功能性阻断该配体(配体定义为肾脏中能结合Alexa-标记的整联蛋白α1β1的物质，其中结合在将该试剂注射到7周龄的纯合的129Sv/J遗传背景的阿尔波特小鼠的尾静脉内之后6小时内出现)将降低单核细胞流出的速度，这对于任何慢性炎性疾病来说都具有治疗益处，其中，在这些疾病中观察到整联蛋白α1β1-阳性间质单核细胞/淋巴细胞积累。
在一种实施方案中，本发明提供了治疗患有慢性炎性疾病的患者的方法。该方法包括给所述患者施用阻断剂(例如，肽或中和抗体)，以便中和胶原XIII结合α1β1整联蛋白的能力。所述慢性炎性疾病优选以由浸润性单核细胞、淋巴细胞，或这两者导致的渐进性病理为特征。所述慢性炎性疾病的实例包括肾脏纤维化，肺纤维化、肝纤维化、类风湿关节炎、牛皮癣、实验性结肠炎、或新月体性肾小球肾炎。优选的是，所述阻断剂能阻断外周血单核细胞和/或淋巴细胞上的α1β1整联蛋白与慢性发炎组织的血管内皮上胶原XIII的相互作用。
在另一种实施方案中，本发明提供了用于治疗患有炎性疾病或其他状况的受试者的方法，在该疾病或状况中观察到整联蛋白α1β1-阳性间质单核细胞和/或淋巴细胞积累。该方法包括给所述受试者施用能破坏胶原XIII和α1β1整联蛋白之间的相互作用的活性剂。优选地，所述活性剂阻断胶原XIII(位于慢性发炎组织血管内皮上)和α1β1整联蛋白(位于外周血单核细胞和/或淋巴细胞上)的结合。优选地，所述阻断剂是肽或抗体。优选地，所述炎性疾病或其他状况是肾脏纤维化、肺纤维化、肝纤维化、类风湿关节炎、牛皮癣、实验性结肠炎、或新月体性肾小球肾炎。
在另一种实施方案中，本发明提供了一种减弱整联蛋白α1β1-阳性单核细胞选择性流入慢性发炎组织的间质的方法。该方法包括将外周血单核细胞和/或淋巴细胞上的α1β1整联蛋白与干扰胶原XIII和α1β1整联蛋白之间的相互作用的活性剂接触。这一目的可以通过几种不同的途径实现。例如，减弱整联蛋白α1β1-阳性单核细胞选择性流入慢性发炎组织的间质包括让所述α1β1整联蛋白与具有胶原XIII的至少一部分氨基酸序列的能特异结合α1β1整联蛋白的肽接触。备选地，减弱整联蛋白α1β1-阳性单核细胞选择性流入慢性发炎组织的间质包括在能有效封闭胶原XIII的结合位点的条件下与抗体接触，该抗体结合发炎组织的血管/毛细血管内皮细胞的细胞表面上的胶原XIII配体。在另一种备选实施方案中，减弱整联蛋白α1β1-阳性单核细胞选择性流入慢性发炎组织的间质包括在能有效防止胶原XIII蛋白在所述细胞表面上表达的条件下让所述血管内皮与小的抑制性RNAs接触。
在另一种实施方案中，本发明提供了一种降低单核细胞和/或淋巴细胞流入慢性发炎组织的间质间隙的速度的方法。该方法包括阻断胶原XIII与α1β1整联蛋白结合。这一目的可以通过阻断胶原XIII配体实现或可以通过阻断α1β1整联蛋白实现。在一种实施方案中，所述阻断剂是含有α1β1整联蛋白的结合位点的胶原XIII的肽片段。在备选实施方案中，所述阻断剂是单特异性抗体，它能结合发炎组织的血管/毛细血管内皮细胞表面上的胶原XIII。
在另一种实施方案中，本发明提供了一种降低单核细胞和/或淋巴细胞流入慢性发炎组织的间质间隙的速度的方法。该方法包括阻断胶原XIII与α1β1整联蛋白结合。
在另一种实施方案中，本发明提供了一种阻断外周血单核细胞和/或淋巴细胞上的α1β1整联蛋白与慢性发炎组织的血管内皮上的胶原XIII相互作用的方法。该方法包括让单核细胞和/或淋巴细胞、血管内皮、或这两者与一种试剂接触，该试剂占据α1β1整联蛋白上的胶原XIII结合位点(例如，肽抑制剂)或封闭胶原XIII上的α1β1结合位点(例如，中和性单克隆抗体)。
本发明提供了鉴定能抑制单核细胞流入模型的间质间隙的试剂的方法，该模型中，涉及到间质单核细胞或淋巴细胞。该方法包括鉴定能破坏胶原XIII和α1β1整联蛋白之间的相互作用的试剂。在一种实施方案中，所述试剂抑制Alexa-缀合的纯化α1β1整联蛋白与MCP-1处理的原代内皮细胞的结合。在备选实施方案中，所述试剂是能阻断Alexa-缀合的经纯化的α1β1整联蛋白与培养物中MCP-1处理的血管内皮细胞相互作用的抗体。
本发明还提供了具有序列GAEGSPGL(SEQ ID NO.1)的分离的肽，其中，所述肽能破坏(例如，阻断)胶原XIII和α1β1整联蛋白之间的相互作用。优选地，所述分离的肽具有序列GEKGAEGSPGLL(SEQ ID NO2)。在某些实施方案中，所述分离的肽的长度为8-16个氨基酸。在其他实施方案中，所述分离的肽长度为12-16个氨基酸。对某些实施方案来说，所述分离的肽由GAEGSPGL(SEQ ID NO.1)组成。对某些实施方案来说，所述分离的肽由GEKGAEGSPGLL(SEQ IDNO2)组成。
本发明还提供了分离的肽，它的氨基酸序列与GAEGSPGL(SEQ IDNO.1)具有至少70％的序列同一性，其中，所述序列能破坏胶原XIII和α1β1整联蛋白之间的相互作用。在另一种实施方案中，本发明提供了分离的肽，它的氨基酸序列与GEKGAEGSPGLL(SEQ ID NO2)具有至少70％的序列同一性，其中，所述肽能破坏胶原XIII和α1β1整联蛋白之间的相互作用。
本发明还提供了针对本文所描述的肽的抗体。
在本文中，“一个(a)”或“一个(an)”表示一个或多个(或至少一个)，从而例如，活性剂(即活性氧化应激调节剂)的组合可用于本发明的组合物和方法中。因此，包括“一个”多肽的组合物表示包括一个或多个多肽的组合物。
本文所使用的“氨基酸”表示具有以下通式的化合物NH2---CRH---COOH，侧链R是H或有机基团。当R是有机基团时，R可以改变，并且是极性的或非极性的(即，疏水的)。本发明的氨基酸可以是天然存在的或合成的(通常称作非蛋白原的)。在本文中，有机基团是归类为脂族基团的烃基、环状基团或脂族和环状基团的组合。术语“脂族基团”表示饱和的或非饱和的线性或支链烃基。例如，该术语被用于包括烷基、链烯基、和炔基。术语“环状基团”表示闭合的环状烃基，它被归类为脂环基、芳基、或杂环基。术语“脂环基”表示环状烃基，其具有类似于脂族基团的性质。术语“芳基”表示单环或多环芳族烃基。在本文中，有机基团可以是取代的或未取代的。
术语“多肽”和“肽”在本文中可以互换使用，用于表示氨基酸的聚合物。这些术语并不表示氨基酸聚合物的特定长度。因此，例如，术语寡肽、蛋白、和酶包括在多肽或肽的定义内，无论该寡肽、蛋白和酶是采用重组技术、化学或酶促合成生产的或天然存在的。该术语还包括业已修饰或衍生化的多肽，如通过糖基化、乙酰化、和磷酸化等修饰或衍生。
在本申请中使用了以下缩略语
附图简述
图1A和1B.阿尔波特间质中的单核细胞主要是整联蛋白α1β1-阳性的。图片表示来自所标明的年龄的阿尔波特肾皮质组织切片的免疫荧光免疫染色的图片，该免疫荧光免疫染色使用了抗CD11b的抗体(图1A)和抗整联蛋白α1β1的抗体(图1B)。注意到所有单核细胞对α1β1整联蛋白都是免疫阳性的。
图2A-2E.大约10％的骨髓衍生的单核细胞表达整联蛋白α1β1。荧光激活细胞分类术(FACS)用于骨髓衍生的淋巴细胞的双色分析，其中使用单核细胞(CD11bPE)和整联蛋白α1β1(VLA Alexa)的抗体标记，和同种型匹配的对照抗体。大约10％的CD11b-阳性细胞同样是整联蛋白α1β1阳性的(图2E，双重-阳性细胞，位于频率分布图的上部右侧象限)。
图3A-3D.尾静脉注射Alexa 568-标记的葡聚糖使得CD11b-阳性单核细胞能够运输；募集到阿尔波特小鼠的肾小管间质中的所有单核细胞都是整联蛋白α1β1阳性的。用1μg的Alexa-568-缀合的葡聚糖注射7-周龄的阿尔波特小鼠。在注射3天之后，收获肾脏，将其包埋在OCT含水包埋介质中，并且制作冰冻切片。用FITC-缀合的抗整联蛋白α1β1-特异抗体(图3C)或FITC-缀合的抗-CD11b抗体(图3A)对组织切片进行免疫染色。结果明确地表明新渗入阿尔波特肾小管间质的Alexa-标记的细胞都是单核细胞，并且都是整联蛋白α1β1-阳性的。图3B和3D显示在尾静脉注射Alexa 568-缀合的葡聚糖三天后，在阿尔波特肾的间质中的Alexa 568-阳性细胞。只有单核细胞(CD11b是单核细胞的特异标记)被标记(图3B中的所有荧光信号与图3A中的荧光信号进行相位对正)。新流出的单核细胞(图3D)对整联蛋白α1β1都是免疫-阳性的(VLA1，图3C)。
图4A和4B.与阿尔波特小鼠相比，在整联蛋白α1β1-缺陷型阿尔波特小鼠的肾皮质中单核细胞流出被推迟，并且单核细胞流出的速度降低。用纯化的α1β1整联蛋白阻断该配体可以降低单核细胞流入间质的速度。图4A.通过尾静脉注射Alexa 568-标记的葡聚糖单核细胞评估的单核细胞运输是在阿尔波特小鼠中相对α1β1-整联蛋白-缺陷型(DKO)阿尔波特小鼠进行分析的，作为肾病发展的函数。数据点表示两种独立动物的20个视野(放大200倍)。仅使用ImagePro-Plus(Media Cybernetics，Bethesda，MD)软件对CD11b-阳性/Alexa-阳性信号打分。所述明确的数据表明，与阿尔波特小鼠相比，DKO小鼠中单核细胞流出的开始推迟了。曲线的斜率(来自采用Sigma Plot(Sigma，St.Louis，MO)软件的线性回归)表明与阿尔波特小鼠相比，在DKO小鼠中单核细胞的流出速度显著降低了。图4B表示在用标记的葡聚糖注射前1天，用5μg纯化的α1β1整联蛋白注射阿尔波特小鼠或不用它注射，并且每天用5μg强化，直到注射标记过的葡聚糖之后三天。对单核细胞(抗-cd11b)的冰冻切片进行染色，并且按上述方法计数双重标记的细胞。结果表明了在用纯化的整联蛋白注射的小鼠中单核细胞流出减弱，确定了整联蛋白介导单核细胞流入肾小管间质间隙的功能。线条表示标准误。
图5A-5C.α1β1整联蛋白能结合阿尔波特肾的血管内皮，但不能结合正常肾的血管内皮。将纯化的α1β1整联蛋白缀合到Alexa 568荧光染料，并且注射到正常(A)小鼠和阿尔波特(B)小鼠的尾静脉中。24小时之后，收获肾脏，冰冻切片，并且使用荧光显微镜成像。图5C表示Alexa-标记的整联蛋白结合在单核细胞中不是被吞噬的整联蛋白，因为这两种信号(比较图5B中信号和图5C中信号的位置)不是共定位的。
图6.与对照相比，来自阿尔波特小鼠的血管内皮细胞中诱导了胶原XIII mRNA。从野生型和阿尔波特肾中分离内皮细胞，然后提取RNA。用寡聚dT引物逆转录RNA。用GAPDH(泳道1-3)和胶原XIII-880bp(泳道4-6)实施PCR扩增。泳道1水对照GAPDH；泳道2野生型GAPDH；泳道3阿尔波特GAPDH；泳道4水对照ColXIII；泳道5野生型Col XIII；泳道6阿尔波特Col XIII；和泳道M100bp序列梯。
图7.MCP-1能促进VLA1重组蛋白在体外的内皮细胞结合。用标明浓度的重组MCP-1处理来自小鼠肾脏的经培养的原代内皮细胞。对一式三份的孔进行分析，分析与纯化的荧光染料-缀合的整联蛋白α1β1结合的能力。数据表示来自3次独立实验的平均值和标准差。
图8.过氧化氢能促进VLA1重组蛋白在体外的内皮细胞结合。用标明浓度的过氧化氢处理来自小鼠肾脏的经培养的原代内皮细胞。对一式三份的孔进行分析，分析与纯化的荧光染料-缀合的整联蛋白α1β1结合的能力。数据表示来自3次独立实验的平均值和标准差。
图9.来自培养的肾内皮细胞的胶原XIII的间接免疫沉淀反应。对未处理过的或MCP-1处理的原代内皮细胞进行间接免疫沉淀反应分析。裂解细胞，并且将纯化的α1β1整联蛋白添加到裂解液中。用抗-α1整联蛋白抗体使复合体免疫沉淀。通过用抗-胶原XIII抗体检测的蛋白印迹分析免疫沉淀。用箭头表示胶原XIII的预期的带(分别为93和115千道尔顿)。
图10.在阿尔波特肾中，胶原XIII与血管内皮细胞标记CD31是共定位的，但在正常肾中则不是。用针对胶原XIII或CD31的抗体对来自正常对照和阿尔波特小鼠的肾冰冻切片进行免疫荧光分析。用线条框起来的区域是胶原XIII与血管内皮明确相位对正的区域。这些区域只在纤维化的肾脏中观察到。
本发明阐明性实施方案详述本发明基于发现阿尔波特小鼠肾的血管内皮细胞表面上存在特异的可诱导的配体。重要的是，它提供了目的在于破坏可诱导的配体及其受体(α1β1整联蛋白)之间的相互作用的多种治疗方法。
所述特异的可诱导的配体是胶原XIII。与对照相比，在来自阿尔波特肾的内皮细胞中诱导了胶原XIII mRNA。通过MCP-1和过氧化氢诱导了纯化的α1β1整联蛋白的结合。注射到阿尔波特小鼠而不是正常小鼠的尾静脉中的标记过的α1β1整联蛋白能结合所述血管内皮。不过，应当指出的是，在正常小鼠血管内皮上和未处理过的内皮细胞培养物中观察到了胶原XIII表达的基础水平。可能有其他因素促进了“可诱导的”结合。可能的候选物是选择蛋白，它是能促进淋巴细胞、单核细胞、和B-细胞在血管内皮上“缓慢滚动(slowrolling)”的蛋白家族的成员。这种缓慢滚动是通过较典型的配体/受体相互作用促进牢固粘附所需的。所述选择蛋白是在炎性组织，而不是正常组织的血管内皮上诱导的。
重要的是，本发明提供了用于治疗炎性疾病或其他状况的方法，其中，观察到了整联蛋白α1β1-阳性间质单核细胞和/或淋巴细胞累积。所述方法包括对患有所述状况的受试者施用能破坏(例如，阻断或中和)所述可诱导的配体胶原XIII及其受体α1β1整联蛋白之间的相互作用的活性剂。所述状况包括，例如，肾脏纤维化、肺纤维化、肝纤维化、类风湿关节炎、牛皮癣、实验性结肠炎、和新月体性肾小球肾炎。本发明还提供了鉴定适用于所述治疗方法的试剂(例如，小有机分子、肽、抗体、SiRNAs)。
具体地讲，本发明提供了以下发现所述可诱导的配体能结合纯化的整联蛋白α1β1；阿尔波特肾中的所有单核细胞是整联蛋白α1β1-阳性的；根据单核细胞运输测定，新流出的单核细胞都是整联蛋白α1β1-阳性的，而只有一部分骨髓衍生的单核细胞(10％)是整联蛋白α1β1-阳性的；整联蛋白α1β1-缺陷型阿尔波特(DKO)小鼠中单核细胞流出的速度明显比非阿尔波特小鼠的慢；通过注射纯化的整联蛋白α1β1功能性阻断所述配体，能降低单核细胞流入阿尔波特肾的间质间隙的速度。总之，该证据证实了在阿尔波特血管内皮上存在整联蛋白α1β1的可诱导的配体，该配体介导了整联蛋白α1β1-阳性单核细胞选择性流入所述间质。
因此，本发明提供了阻断/减弱整联蛋白α1β1-阳性单核细胞选择性流入慢性发炎组织间质的方法。该方法包括让循环的外周血单核细胞/淋巴细胞上的α1β1整联蛋白与本文所描述的活性剂(例如，具有胶原XIII的部分组成的肽，它能特异结合α1β1整联蛋白)接触。备选地，该方法包括施用一种活性剂(例如，人源化单特异性抗体制剂)，它能以如下方式结合发炎组织的血管/毛细血管内皮细胞的细胞表面上的胶原XIII配体，使得结合的活性剂(例如，抗体)封闭胶原XIII的结合位点，从而防止外周血单核细胞/淋巴细胞上的α1β1整联蛋白与血管/毛细血管内皮细胞上的胶原XIII结合。另外，该方法可以包括活性剂(例如，小的抑制性RNAs)的用途，它能以如下方式靶定所述血管内皮，从而防止胶原XIII蛋白在所述细胞表面上的表达，从而防止/减弱α1β1整联蛋白-阳性单核细胞/淋巴细胞向发炎组织的粘附/跨内皮迁移。
所述DKO数据表明流出的开始推迟，并且具有明显变慢的流出速度，与通过注射纯化的α1β1整联蛋白获得的配体封闭结果结合在一起，阐明了功能性地封闭该配体(被定义为肾脏中结合Alexa-标记的整联蛋白α1β1的物质，它能在将该试剂注射到纯的129Sv/J遗传背景的7周龄阿尔波特小鼠的尾静脉6小时之内结合Alexa-标记的整联蛋白α1β1)能降低单核细胞流出速度。
因此，本发明提供了降低单核细胞(和/或淋巴细胞)流入慢性发炎组织间质间隙的速度的方法。该方法包括通过让淋巴细胞和/或单核细胞的细胞表面上的α1β1整联蛋白与能破坏(例如，阻断或中和)胶原XIII和α1β1整联蛋白之间的相互作用的试剂接触来阻断胶原XIII与α1β1整联蛋白结合，特别是当α1β1整联蛋白受体呈递给循环的外周血单核细胞或淋巴细胞表面上的胶原XIII配体的时候。这可由使用诸如含有α1β1整联蛋白结合位点的胶原XIII的肽片段的活性剂导致。备选地，该方法包括使用诸如单特异性抗体的活性剂，该活性剂能以如下方式结合发炎组织的血管/毛细血管内皮细胞表面上的胶原XIII从而阻断血管内皮细胞上的胶原XIII与循环的外周血单核细胞/淋巴细胞上的α1β1整联蛋白相互作用(例如，结合)的能力，从而防止/减弱整联蛋白α1β1-阳性淋巴细胞/单核细胞的粘附和向发炎组织的间质间隙中转移。
用Alexa-568葡聚糖-加载的单核细胞进行的骨髓转移研究显示了与对照相比，来自α1整联蛋白无效小鼠的细胞的单核细胞流出速度明显降低。采用用于检测相互作用结合配偶体(partner)的噬菌体展示方法，鉴定胶原XIII是α1β1整联蛋白的内皮细胞配体。这种独特的膜结合胶原以前业已显示能结合α1β1整联蛋白，不过该胶原的功能在本发明记载的发现之前是未知的。与对照相比，在来自阿尔波特小鼠的内皮细胞上发生了胶原XIII的增强的表达。通过单核细胞化学引诱蛋白1(MCP-1)在肾脏内皮细胞培养物中诱导了胶原XIII，MCP-1是以前记载的在阿尔波特肾中诱导的趋化因子，并且业已表征了它在慢性发炎的组织中募集单核细胞的作用。阻断胶原XIII与α1β1整联蛋白结合的能力对于任何慢性炎性疾病来说都有治疗益处，在所述疾病中观察到整联蛋白α1β1-阳性间质单核细胞积累。因此，本发明提供了治疗慢性炎性疾病的方法，该疾病为诸如肾脏纤维化、肺纤维化、肝纤维化、类风湿关节炎、牛皮癣、实验性结肠炎，和新月体性肾小球肾炎。该方法包括阻断胶原XIII与α1β1整联蛋白的结合(或中和它们的相互作用)。在本文中，“治疗”表示在所述状况的至少一种临床症状上出现了改善。例如，治疗涉及通过抑制或减弱单核细胞/淋巴细胞流入慢性炎症位点的间质间隙延缓或抑制慢性炎性状况的发展。
使用本文所描述的Alexa-缀合的葡聚糖注射方法，本领域技术人员可以测定治疗剂(即，活性剂)抑制单核细胞流入模型(例如，小鼠模型)的间质间隙的能力，在该模型中涉及到间质单核细胞或淋巴细胞。在本文中，“抑制”表示通过阻断或减少外周血淋巴细胞/单核细胞细胞表面上的α1β1整联蛋白受体粘附在炎性组织的血管/毛细血管内皮上的胶原XIII配体上来抑制或减弱淋巴细胞/单核细胞从外周血循环跨内皮迁移到发炎组织的间质间隙中。
所述测定包括，例如至少两种实验策略。第一种测定包括分析讨论中的治疗剂抑制Alexa-缀合的纯化的α1β1整联蛋白与MCP-1处理的原代内皮细胞结合的能力。例如，这一目的可以通过使用在具体方法中描述的96孔微量滴定板形式和荧光平板读出器实现。可以将制剂滴定到所述结合测定中，并且通过抑制结合所需要的浓度判断它们的相对效力。然后能够以多种剂量将肽、抗体或SiRNAs导入阿尔波特小鼠模型。可以按照本文所描述的具体方法注射Alexa荧光染料-缀合的葡聚糖对体内效力进行定量评估。间质中的标记过的细胞都是单核细胞(例如，参见图3A和3B)。与年龄和性别匹配的载体注射的阿尔波特小鼠相比，Alexa-标记的单核细胞数量的百分比(％)减少可以被认为是讨论中的特定试剂的体内效力的直接量度。
第二种测定方法涉及使用单特异性抗体。这种抗体是通过将包含胶原XIII的整联蛋白结合结构域(例如，SEQ ID NO2)的肽抗原注射到小鼠或注射到大鼠体内，以便产生抗体以引起针对所述肽抗原的免疫反应。从脾脏分离来自所述动物的能产生抗体的B细胞，并且采用常规技术(聚乙二醇融合方法)将该B细胞与骨髓瘤细胞融合。来自抗体产生性细胞的克隆群体(杂交瘤)的培养物上清液含有单特异性(或单克隆)抗体。首先测定用这种方法制备的抗体阻断Alexa-缀合的纯化的α1β1整联蛋白与本文描述的培养物中MCP-1处理的血管内皮细胞的相互作用的能力。在体内分析具有这种特性的单特异性抗体。所述抗体是从培养物上清液中纯化的，该纯化包括与A蛋白琼脂糖结合并且随后从它上面洗脱，这是用于从杂交瘤上清液中纯化/浓缩抗体的标准化方法。将有效量的抗体注射到阿尔波特小鼠模型体内，并且在24小时之后，用Alexa-缀合的葡聚糖注射相同小鼠。在注射葡聚糖三天后，收获所述肾脏，并且用FITC-缀合的抗-CD11b抗体(用以标记单核细胞)对冰冻切片复染，并且对Alexa-阳性单核细胞进行计数。将Alexa-阳性单核细胞的数量与被提供等量的同种型匹配的不相关抗体的年龄和性别匹配的阿尔波特小鼠的Alexa-阻性单核细胞的数量进行比较。Alexa-阳性(新流出的)的单核细胞的显著减少表明抗体具有潜在的治疗益处。所述治疗剂包括，但不局限于小有机分子、具有序列GAEGSPGL(SEQ ID NO.1)或更具体地讲、具有序列GEKGAEGSPGLL(SEQ ID NO2)的分离的肽、所述肽的抗体、以及小的抑制性RNAs(SiRNAs)。在这里，“分离的”肽是天然存在的或合成来源的，并且不存在于它的天然环境中的肽。
优选的是，所述分离的肽可以具有至少8个氨基酸。更优选的是，它们具有至少12个氨基酸。所述肽的长度足以获得所希望的功能。对某些实施方案来说，它们的长度不超过16个氨基酸。
血管内皮上的胶原XIII上的该氨基酸序列与循环的白细胞上的α1β1整联蛋白相互作用。另外，活性肽(即，SEQ ID NOs1或2的活性类似物)可以包括这样的序列，它与GAEGSPGL(SEQ ID NO.1)，或更具体地讲与GEKGAEGSPGLL(SEQ ID NO2)具有至少70％的序列同一性。优选的是，活性类似物与SEQ ID NOs1或2之一的结构相似性具有至少80％的同一性，更优选的是至少90％的同一性，更优选的是，至少95％的同一性。所述肽不包括胶原XIII。
还可以将针对这些肽的至少一个或针对α1β1整联蛋白制备的中和抗体用于破坏胶原XIII结合α1β1整联蛋白的能力。还可以使用小的抑制性RNAs(SiRNAs)，其被递送到内皮细胞，导致胶原XIII转录物的细胞内破坏，并因此防止翻译的胶原XIII蛋白到达内皮细胞表面。
这些试剂可以单独使用或者组合使用，以便部分或完全抑制整联蛋白α1β1-阳性单核细胞/淋巴细胞跨内皮迁移到慢性发炎组织的间质间隙中。
所述抑制剂在本文中被称作“活性剂”，重要的是，所述活性剂能够作为药物或饮食(例如营养物)添加剂单独或者以多种组合施用于患者(例如，包括人在内的动物)，其剂量足以在患者的全身，在特定组织位点，或在组织的集合(器官)中产生所希望的作用。
本文所描述的多肽(例如，包括SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸的多肽)可以以它们的游离酸形式存在，或者这些多肽可以在C-末端酸基上被酰胺化。
正如上文所讨论的，本发明还包括SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的多肽的类似物，这些类似物包括具有结构类似性的多肽。这些多肽还可以形成更大肽的一部分。多肽的“类似物”包括所述多肽的至少一部分，其中，所述部分含有一个或多个邻接的或不邻接的氨基酸的缺失或添加，或含有一个或多个氨基酸替代。因此，“类似物”包括位于上面所列多肽一端或两端的额外的氨基酸。用于本发明多肽的氨基酸的替代优选是保守替代，这些替代选自所述氨基酸所属类型的其他成员。例如，蛋白生物化学领域中众所周知的是，属于具有特定大小或特征(如电荷、疏水性和亲水性)的氨基酸类别的氨基酸通常可以替代为另一种氨基酸，而不会明显改变多肽的结构。
对于本发明来说，保守性氨基酸替代被定义为是由于改变来自以下残基类别之一的氨基酸残基的互换所导致的I类Ala，Gly，Ser，Thr，和Pro(代表小的脂族侧链和羟基侧链)；II类Cys，Ser，Thr和Tyr(代表包括-OH或-SH基团的侧链)；III类Glu，Asp，Asn和Gln(含有羧基的侧链)IV类His，Arg和Lys(代表碱性侧链)；V类Ile，Val，Leu，Phe和Met(代表疏水性侧链)；和VI类Phe，Trp，Tyr和His(代表芳族侧链)。以上类别还包括相关的氨基酸，如I类中的3Hyp和4Hyp；II类中的高半胱氨酸；III类中的2-氨基己二酸、2-氨基庚二酸、γ-羧基谷氨酸、β-羧基天冬氨酸、和相应氨基酸酰胺；IV类中的鸟氨酸、高精氨酸、N-甲基赖氨酸、二甲基赖氨酸、三甲基赖氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸、高精氨酸、肌氨酸和羟赖氨酸；V类中的取代的苯丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、2-氨基辛酸、2-氨基庚酸，statine和β-缬氨酸；以及VI类中的萘基丙氨酸、取代的苯丙氨酸，四氢异喹啉-3-羧酸和卤化酪氨酸。
正如上面所指出的，活性类似物包括具有结构相似性(即，序列同一性)的多肽。结构相似性通常是通过比对两个氨基酸序列的残基以便沿它们的序列长度最优化相同氨基酸的数目确定的；在进行比对时，允许在一个或两个序列上存在缺口，以便最优化相同氨基酸的数目，不过，在每一个序列中的氨基酸仍然要保持它们的正确顺序。优选的是，采用BLAST 2检索算法的NCBI BLASTB，2.2.6版来比较两种氨基酸序列。优选的是，将BLAST 2的所有检索参数的默认值稍微改变地用于ProteinsSearch for Short Nearly ExactMatches，其可以从以下网址获得
http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi？CMD＝Web&LAYOUT＝TwoWindows&AUTO_FORMAT＝Semiauto&ALIGNMENTS＝50&ALIGNMENT_VIEW＝Pairwise&CLIENT＝web&DATABASE＝nr&DESCRIPTIONS＝100&ENTREZ_QUERY＝％28none％29&EXPECT＝20000&FORMAT_OBJECT＝Alignment&FORMAT_TYPE＝HTML&GAPCOSTS＝9+1&I_THRESH＝0.005&MATRIX_NAME＝PAM30&NCBI_GI＝on&PAGE＝Proteins&PROGRAM＝blastp&SERVICE＝plain&SET_DEFAULTS.x＝24&SET_DEFAULTS.y＝10&SHOW_OVERVIEW＝on&WORD_SIZE＝2&END_OF_HTTPGET＝Yes&SHOW_LINKOUT＝yes&GET_SEQUENCE＝yes包括矩阵＝PAM30；开放缺口罚分(open gap penalty)＝10，延长缺口罚分(extension gap penalty)＝1，预期值(expect)＝20000，字符大小(wordsize)＝3，以及过滤器开(filter on)＝低复杂性。在用BLAST检索算法比较两种氨基酸序列时，结构相似性被称作“同一性”。
所述肽抑制剂可以是天然来源的(优选分离的和纯化的)，如通过噬菌体展示或用以鉴定相互作用的蛋白的酵母双杂交方法产生，或者这些肽抑制剂可以是使用已知的肽聚合技术合成构建的。无论是天然存在的或合成构建的，这些肽在本文中都被称作“分离的”。例如，本发明的肽可以是通过固相合成方法采用基于叔-丁氧基羰基(BOC)或9-芴基甲氧基-羰基(FMOC)保护基团的标准方法合成的。该方法描述于以下文献中G.B.Fields等，参见SyntheticPeptidesA User′s Guide，W.M.Freeman & Company，New York，NY，77-183页(1992)。
在本发明的方法中所使用的肽能够以单价状态(即游离的肽或与载体分子偶联的单一肽片段)使用。还可以将所述肽用作缀合物，其具有结合在一个载体分子上的一个以上(相同或不同)肽片段。所述载体可以是生物载体分子(例如，粘多糖、蛋白聚糖、清蛋白等)或合成聚合物(例如，聚亚烷基二醇或合成的层析支持物)。通常，将卵清蛋白、人血清清蛋白、其他蛋白、聚乙二醇等用作载体。所述修饰可以提高肽的表观亲和力和/或改变肽的稳定性。与每一种载体结合或连接的肽片段的数目可改变，不过在标准偶联条件下，通常获得的是每个载体分子大约4-8个肽。
例如，可以通过用诸如碳二亚胺的偶联剂处理肽和载体分子的混合物来制备肽/载体分子缀合物。所述偶联剂能够激活所述肽或载体分子上的羧基，从而所述羧基能够与所述肽/载体分子的另一成员上的亲核物质(例如，氨基或羟基)反应，导致所述肽和所述载体分子的共价连接。例如，可以通过将等量的冷冻干燥的肽和卵清蛋白溶解在少量水中制备肽与卵清蛋白偶联的缀合物。在第二个试管中，将1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC；为肽用量的10倍)溶解在少量水中。将所述EDC溶液添加到所述肽/卵清蛋白混合物中，并且让它们反应数小时。然后透析该混合物(例如，透析到磷酸缓冲的盐溶液中)，以便获得肽/卵清蛋白缀合物的纯化溶液。通过这种方法制备的肽/载体分子缀合物通常含有每个卵清蛋白分子大约4-5个肽。
本发明还提供了能够特异地结合与包括SEQ ID NO1或SEQ IDNO2的氨基酸的肽具有至少70％(更优选至少80％，更优选至少90％，且更优选至少95％)的序列同一性的肽的抗体。在一种实施方案中，所述抗体是单克隆抗体，在另一种实施方案中，所述抗体是多克隆抗体。在另一种实施方案中，所述抗体是抗体片段，其包括在所使用的术语抗体的含义内。所述抗体可以从小鼠、大鼠、人或兔获得。制备针对肽的抗体的方法为本领域技术人员所熟知。在优选实例中，所述抗体可以是来自人的、来自大鼠的、来自小鼠的、或来自兔的。结合蛋白的抗体片段和嵌合片段同样是公知的，并且在本发明的范围内。
本发明还提供了包括本发明的一种或多种活性剂和一种或多种载体，优选药学上可接受的载体的组合物。本发明的方法包括对患者(即，受试者)，优选哺乳动物，更优选人施用，或在皮肤上施用能产生所希望的效果的有效量的本发明组合物。本发明的活性剂被制备成用于经肠施用(例如，经口、直肠等)或肠胃外施用(注射、内部泵(internal pump)等)。所述施用可以通过直接注射到组织，关节间注射，静脉间注射或其他内在施用方法，如通过使用植入的泵或通过让所述组合物与粘膜接触，该组合物存在于用于促进所述组合物通过粘膜转移而设计的载体中，如栓剂、滴眼剂、吸入剂，或其他类似的施用方法或以糖浆、液体、药丸、胶囊、凝胶包衣的片剂形式经口施用，或其他类似的经口施用方法。所述活性剂可以掺入粘性药膏、贴剂、树胶等，或者可以胶囊化，或掺入用于控释的可生物腐蚀的基质中。
用于内部施用的载体可以是常用于促进组合物的内部施用的任何载体，如血浆、无菌盐溶液、IV溶液等。用于通过粘膜施用的载体可以是本领域众所周知的任何载体。用于经口施用的载体可以是本领域所熟知的任何载体。
所述制剂可适宜地以单位剂量形式存在，并且可以通过药剂学领域的任何众所周知的方法制备。所有方法包括使所述活性剂与载体结合的步骤，所述载体构成了一种或多种辅助成分。一般，所述制剂是通过让所述活性剂与液态载体、细碎的固态载体，或这两者均匀地并且紧密地结合而制备，然后如果必要的话，将所述产品成型成所希望的制剂。
适合肠胃外施用的制剂适宜地包括所述活性剂的无菌含水制剂，或所述活性剂的无菌粉末的分散体，该含水制剂或分散体优选是与受者的血液等渗的。所述液体制剂中可以包含的等渗剂包括糖、缓冲液、和氯化钠。所述活性剂的溶液可以用水制备，任选地与无毒的表面活性剂混合。所述活性剂的分散体可以用水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、和液态聚乙二醇等)、植物油、甘油酯，以及它们的混合物制备。最终的剂型是无菌的、流体的，并且在生产和保存条件下是稳定的。必须的流动性可以通过以下方式获得，例如，通过使用脂质体，对于分散体来说采用合适的粒度，或者通过使用表面活性剂。液体制剂的灭菌可以通过任何方便的方法实现，该方法能保存所述活性剂的生物活性，优选通过过滤灭菌。制备粉末的优选方法包括所述无菌注射液的真空干燥和冷冻干燥。使用各种抗微生物剂可以防止随后的微生物污染，这些抗微生物剂为例如，抗细菌剂、抗病毒剂和抗真菌剂，包括对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。所述活性剂的长期吸收可以通过包含延迟试剂实现，该延迟试剂为例如，一硬脂酸铝和明胶。
本发明的适合经口施用的制剂能够以不连续的单位存在，如片剂、锭剂、胶囊、糖锭、薄片(water)、或扁胶剂(cachet)，各自含有粉末或颗粒状的预定数量的活性剂，含有所述活性剂的脂质体，或存在于含水液体或无水液体中的溶液或悬浮液，如糖浆、酏剂、乳剂或顿服药(draught)。活性剂的用量是这样的，所述剂量水平能在受试者体内有效产生所希望的的结果。
鼻喷雾制剂包括所述活性剂的纯化的水溶液，含有防腐剂和等渗剂。优选将所述制剂调节到pH和等渗状态与鼻粘膜相容。直肠或阴道施用的制剂能够以栓剂形式存在，使用合适的载体，如可可油、或氢化脂肪或氢化脂肪羧酸。
眼科制剂是通过与鼻喷雾剂类似的方法制备的，所不同的是，优选将pH和等渗因素调节到与眼睛匹配。
局部制剂包括溶解或悬浮在一种或多种介质中的该活性剂，该介质为如矿物油、DMSO、多羟基醇、或用于局部药物制剂的其他基质。
所述活性剂的有用剂量可以通过比较它们的体外活性和在动物模型体内的活性确定。用小鼠和其他动物中的有效剂量外推至人的方法为本领域所公知。
片剂、锭剂、药丸、和胶囊等还可以含有下列一种或多种成分粘合剂，如西黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸二钙；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂，如硬脂酸镁；增甜剂，如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜；以及天然或人工增香剂。当所述单位剂型是胶囊时，它还可以含有液态载体，如植物油或聚乙二醇。各种其他材料能够以涂层形式存在，或以其他方式改变所述固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、药丸、或胶囊可以用明胶、蜡、虫胶、或糖等涂覆。糖浆或酏剂可以含有一种或多种增甜剂，防腐剂，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯，延缓所述糖结晶的试剂，增加任何其他成分的溶解度的试剂，如多元醇，例如甘油或山梨醇、染料，和增香剂。用于制备任何单位剂型的材料是在所采用的用量下大体上无毒的。所述活性剂可以整合在缓释制剂和装置中。
通过以下实施例对本发明的目的和优点作进一步说明，不过，在这些实施例中所提到的具体材料及其用量以及其他条件和细节不应当被理解成是对本发明的不适当限制。
实施例前言为了了解整联蛋白α1在阿尔波特间质病中起作用的机理，采用Affymetrix基因芯片方法对基因表达进行总体分析。所述实验描述于以下文献中Sampson等，J.Biol.Chem.，276，34182-34188(2001)。将7周龄的阿尔波特小鼠与7周龄的DKO(双重剔除小鼠，整联蛋白α1和胶原α3(IV)都是无效的)进行比较。使用Adams等Nature，377，3-174(1995)的分类方案对上调或下调的基因进行分类，并且采用GENE CLUSTER和TREEVIEW程序对这些基因归类。在所进行的观察中，发现了在阿尔波特小鼠中出现了多种单核细胞/巨噬细胞-特异转录物。这些转录物包括巨噬细胞化学引诱蛋白1(MCP-1)、巨噬细胞可诱导蛋白(IP-10)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、巨噬细胞甘露糖受体、和F4/80。与对照同窝崽相比，在阿尔波特小鼠中所有转录物都提高了6-24倍。在来自7周龄DKO小鼠的肾脏中，所有上述基因的表达都恢复到野生型水平。这些研究导致我们得出以下结论整联蛋白α1对阿尔波特肾小管间质病的作用可能是通过组织单核细胞介导的。用单核细胞特异性标记(CD11b)免疫染色证实了以上推测，因为很明确的是，在DKO小鼠中存在很少的单核细胞，而这种细胞在阿尔波特小鼠的间质中大量存在(Sampson等，J.Biol.Chem.，276，34182-34188(2001))。在阿尔波特肾脏纤维化中，T-细胞和B-细胞实际上是缺乏的(Rodgers等，Kidney Int.，63，1338-1355(2003))。
业已显示阻断α1β1整联蛋白能减缓其他慢性炎性疾病模型的发展，这些疾病包括类风湿关节炎、实验性结肠炎，和新月体性肾小球肾炎。业已推测这种影响可能涉及白细胞向组织中转移的抑制；不过，驱动这种推测的影响的机制尚不清楚。最近业已显示，所述单核细胞介导与阿尔波特小鼠模型中肾脏的渐进性炎症相关的细胞破坏(Rodgers等，Kidney Int.，63，1338-1355(2003))，强调了间质单核细胞积累在与慢性炎性疾病相关的病理中的重要性。
在这里，显示骨髓中少数单核细胞能表达α1β1整联蛋白，并且阿尔波特小鼠的肾小管间质中的单核细胞是α1β1整联蛋白阳性的。将单核细胞运输测定用于显示与阿尔波特小鼠相比，α1β1-无效阿尔波特小鼠中单核细胞流出显著减少，并且实际上所有在阿尔波特小鼠中新流出的单核细胞都能表达α1β1整联蛋白。使用Alexa-缀合的纯化的α1β1整联蛋白，证实了整联蛋白能结合阿尔波特小鼠而不是正常小鼠的血管内皮细胞，并且，注射纯化的整联蛋白能抑制单核细胞流出。另外，移植到α1整联蛋白-无效阿尔波特小鼠体内的来自正常小鼠的标记的单核细胞比来自整联蛋白α1无效小鼠的单核细胞更有效地流入皮质间质空间。总之，这些数据强烈暗示了α1β1整联蛋白的可诱导的配体在肾脏血管内皮上的存在，该配体能介导α1β1整联蛋白-阳性单核细胞流入血管内皮。使用内皮细胞-来源的噬菌体展示文库与“生物淘选(biopanning)”方法结合，鉴定胶原XIII是α1β1整联蛋白的内皮细胞配体。α1β1整联蛋白在单核细胞上的相互作用介导单核细胞向慢性炎性疾病的间质间隙中的转移。在早期研究中，提供了引人注目的证据，即单核细胞造成与纤维化过程相关的肾小管间质损伤(Rodgers等，Kidney Int.，63，1338-1355(2003)。因此，内皮细胞-特异性配体的鉴定可以提供重要的治疗靶标。用中和抗体或肽抑制剂封闭所述配体可能单独使用或与封闭外周血单核细胞上的α1β1整联蛋白联合使用。该策略可用于治疗其他慢性炎性疾病。
方法Alexa 568葡聚糖复合体方案按照Luby-Phelps描述的方法(Methods in Cell Biology，卷29，第4章，59-73页，(1989))制备荧光葡聚糖。简单地讲，将1mg荧光探针，Alexa 568(Molecular Probes，Inc.Eugene，OR)与39mg葡聚糖(分子量大约144,000)在吡啶、二甲基亚砜(DMSO)、和二月桂酸锡(Sigma-Aldrich Co.St.Louis，MO)存在下混合。用95％乙醇沉淀标记过的葡聚糖，在玻璃-蒸馏水中透析并且冷冻干燥。然后，将干燥的产物以500微克(μg)等分试样置于干燥器中-20℃下避光保存。
用50μg在100微升(μL)Hanks平衡盐溶液(pH 7.2)中重构的Alexa 568标记的葡聚糖经尾静脉注射雄性野生型129SV和129SVJ小鼠(4-12周龄)和胶原IVα3(-/-)(阿尔波特5-8周龄)和胶原IVα3(-/-)/整联蛋白α1(-/-)双剔除(DKO8-12周龄)小鼠。在注射三天之后，给这些动物注射致死剂量的阿佛丁(averitin)(0.55克/千克(g/kg)体重；腹膜内(ip))，然后用冰冷的PBS进行心脏灌注。取出肾脏，并且浸泡在浓度增加的冰冷的蔗糖(最大30％)溶液中，然后包埋在Tissue Tek OCT封固剂(Sakura Finetek USA，Inc.，Torrence，CA)中，并且在-80℃下保存。
用新鲜冰冻的组织切片(4μm)在2％低聚甲醛中固定5分钟，并且在4℃下干燥过夜，然后在-20℃下长时间保存，或用大鼠单克隆抗体α-CD11b(Cedar Lane laboratories，Hornby，Ontario)和山羊抗大鼠Alexa 488(Molecular Probes，Inc.Eugene，OR)抗体分别以1∶100和1∶200的稀度对单核细胞进行免疫组织化学检测。用vectorshield封固剂(Vector Corp.Burlingme，CA)对切片盖片。对三个切片中的每一个进行大约10次拍照，拍照点间隔至少100微米(μm)，该拍照使用Olympus BH2-RFCA显微镜，安装了绿色和红色滤光片。用Image Pro Plus软件(MediaCybernetics，Inc.Silver Spring，MD)来测量绿色荧光以及测定共同定位的双重荧光。
ADC568标记的单核细胞移植物给7周龄的DKO小鼠静脉内注射从α1整联蛋白缺陷型或野生型小鼠骨髓中分离的Alexa 568缀合的葡聚糖(ADC568)标记的单核细胞。通过用补充了2％胎牛血清(FCS)和青霉素/链霉素的Dulbecco氏改进的Eagle培养基(DMEM)冲洗股骨和胫骨的骨髓腔收集骨髓。用1x磷酸缓冲的盐溶液(PBS)(或Hanks氏平衡盐溶液(HBSS))洗涤细胞2次。用氯化铵(20mM Tris，140mM NH4Cl，pH 7.2)除去红细胞，然后，在含有2％FCS的DMEM中洗涤2次，最后用HBSS洗涤。细胞在补充了2％FCS、青霉素/链霉素的DMEM中，在37℃下，在潮湿的具有5％CO2的室中培养24小时。用HBSS洗涤细胞2次，并且添加125μg ADC568/ml新鲜培养基。将洗涤过的细胞重新悬浮在ADC568溶液中，并且在37℃下，在具有5％CO2的潮湿室中培养24小时(尽量使长时间接触光线最小化)。用HBSS洗涤细胞3次。对细胞进行计数，并且制备细胞样品，以便用荧光显微镜证实ADC568标记。通过尾静脉注射将标记的单核细胞注射到受体DKO小鼠体内(用等量的α1整联蛋白-无效或野生型单核细胞注射小鼠)。在尾静脉注射72小时之后，从受体小鼠收获肾脏。制备新的冰冻块，并且切成4μm的不连续切片，以便用荧光显微镜观察，并且用ImagePro Plus分析。
α1β1整联蛋白/CD31 cDNA文库和噬菌体展示制备重组VLA1涂覆的金属珠按照生产商的方案，用重组蛋白对M450金属珠(DYNAL Inc.，Lake Success，NY)进行涂覆。简单地讲，使用磁性小室，在磷酸缓冲液(0.26g NaH2PO4，1.44gNa2HPO4，溶解在100mL ddH2O中，pH 7.4)中洗涤1×108个珠子。将珠子(/107珠/5mg蛋白)与50μg纯化的人α1β1整联蛋白(Chemicon International，Inc.，Temecula CA)混合，并且放置在章动器(nutator)上，在37℃下放置16小时。将珠子在4℃下缓冲液D{PBS0.88g NaCl，0.26g NaH2PO4，1.44g Na2HPO4，溶解在100ml ddH2O中，pH 7.4，含有0.1％BSA}中洗涤2次，5分钟，在37℃下缓冲液E{0.2M Tris pH 8.5，含有0.1％ BSA}中洗涤1次，4小时。珠子在+4℃下缓冲液D中保存。在4℃下，在补充了1mm MgCl2和1mm CaCl2的缓冲液D中将细胞与α1β1整联蛋白涂覆的珠子一起温育30分钟。
制备抗-CD31磁珠用磷酸缓冲液洗涤连接链亲和素的金属珠(DNA酶I识别结构域接头)(DYNAL Inc.，Lake Success，NY)，并且将该金属珠与生物素化的抗-CD31抗体(ABCAM，Ltd.，Cambridgeshire英国)合并，比例为1.0μg该抗体/1×107个珠子。将所述金属珠/抗-CD31混合物放置在章动器上，在室温下保持30分钟。温育后，用磷酸缓冲液洗涤珠子2次，然后将珠子在缓冲液D中再洗涤1次。珠子在4℃下保存。
从VLA1结合的小鼠肾脏内皮细胞中分离mRNA对10周龄的四只DKO小鼠提供致死剂量的阿佛丁。用冰冷的PBS灌注动物。收获肾脏，并且将其马上放置在冰上的HBSS(Gibco BRL)中。切碎肾脏，并且将其用20mL的(4个切碎的肾脏在20mL胶原酶A中消化)的1毫克/毫升(mg/mL)胶原酶A(Roche Diagnostics Corp.，Indianapolis，IN)HBSS溶液在37℃下消化45分钟，轻微搅拌。消化的材料通过70μm的尼龙网孔过滤，并且收集到50mL锥形管中。
从消化物中回收细胞(在室温下以1000转/分钟(rpm)的速度离心5分钟(min))，并且用PBS洗涤2次，然后最终用缓冲液D洗涤。对于每20mL的胶原酶A，将来自组织消化液的产物重新悬浮在6mL缓冲液D中。将一毫升(1mL)的细胞悬浮液与1×107抗-CD31金属珠合并，并且在4℃下，在章动器上混合30分钟。将莲座细胞(rosetted cell)用含有0.1％ BSA的PBS洗涤4次。通过在室温下，在DNA酶溶液(释放缓冲液)中温育莲座细胞15分钟，从分离的内皮细胞释放金属珠。将内皮细胞重新悬浮在含有0.1％ BSA的PBS中，与VLA1缀合的金属珠合并，然后保持在4℃下章动30分钟。用含有0.1％ BSA的PBS洗涤莲座细胞4次。保留每一次的洗涤液，并且使未结合的内皮细胞沉淀，重新悬浮在裂解缓冲液(AmbionInc.，Austin TX)中，并且从该内皮细胞提取mRNA。最后洗涤后，将莲座细胞重新悬浮在裂解缓冲液(Ambion Inc，Austin TX)中。在室温下5分钟之后，除去金属珠，并且从VLA1结合的内皮细胞中提取mRNA。
使用Orient express(Novagen，Inc.，Madison WI)在T7选择噬菌体中制备cDNA文库Superscript III(Invitrogen，Corp.，Carlsbad CA)逆转录酶和甲基化的dNTPs与HIND III随机引物(Novagen，Inc.，Madison W)一起用于制备可以用限制酶消化的cDNA。利用标准dNTPs和T4 DNA聚合酶在甲基化的cDNA上产生足够可消化的平端，并且连接到EcoRI/HIND III接头上，然后用HINDIII和EcoRI限制酶消化。消化产物通过大小分级柱(Novagen，Inc.，Madison WI)过滤，并且收集大于300个碱基对(bp)的cDNA。然后将收集的cDNA连接到T7选择载体臂上，以便利用T7选择噬菌体包装提取物(Novagen，Inc.，Madison WI)制备噬菌体文库，并且通过利用细菌菌株BLT5403(Novagen，Inc.，Madison WI)进行的噬斑测定确定重组体的数量。在噬斑测定之后，通过平板裂解液扩增来扩增噬菌体文库，将噬菌体文库用提取缓冲液(20毫摩尔(mM)Tris-HCL，pH 8.0，100mM NaCl，6mM MgSO4)洗脱，滴定，并且通过添加0.1倍体积的无菌80％甘油准备在-70℃下长期保存。
通过PCR证实CD31/VLA1 cDNA噬菌体文库的完整合成，该PCR使用T7选择引物和以下制剂10μL噬菌体裂解液；5μL含有MgCl2的10×NOVATAQ缓冲液(Novagen)；1μL T7选择上引物(GGAGCTGTCGTATTCCAGTC(SEQ ID NO3))；1μL T7选择下引物(AACCCCTCAAGACCCGTTTA(SEQ ID NO4))；1μL dNTP混合物(各10mM)；1.25U NOVATAQ DNA聚合酶(Novagen)；并用PCR级水补足到50μL。将反应液加热到80℃保持两分钟，然后为30个循环，其中每个循环为94℃保持50秒(sec)，50℃保持1分钟，和72℃保持1分钟。最终的延伸在72℃下进行6分钟。
VLA1结合表达蛋白序列的生物淘选用存在于涂覆缓冲液(0.035M NaHCO3，0.015M Na2CO3)中的5μg/mL的重组人α1β1整联蛋白(VLA1)在4℃下涂覆96孔高结合塑料平板过夜。在用VLA1涂覆之后，用1×20mM Tris-Cl(pH 7.4)-0.5M NaCl(TBS)洗涤孔3次，将孔用5％脱脂乳TBS缓冲液封闭，然后用蒸馏水洗涤5次。根据扩增的噬菌体文库的计算的效价，将8×108(VLA1-CD31)和5.9×108(CD31)噬菌体制剂添加到VLA1涂覆的孔中的200μl生物淘选缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 8.0，0.15M NaCl，0.1％ Tween-20，1mM MgCl2，1mM CaCl2)中，并且在室温下保持45分钟。用生物淘选缓冲液洗涤孔5次，并且用洗脱缓冲液(20mM Tris，中性pH，1.0％SDS)洗脱结合的噬菌体20分钟。然后将BLT5403细菌细胞添加到所述涂覆的孔中，以便回收高亲和力噬菌体，这些噬菌体有可能还没有收集到所述洗脱液中。将百分之九十(90％)洗脱的噬菌体与50ml细菌细胞培养物(OD600＝0.5)合并，并且在37℃下振荡扩增3小时。剩余10％被用于测定从每一轮生物淘选中回收的噬菌体的数量。通过噬斑测定滴定来自每一轮生物淘选的扩增的噬菌体。用1×108噬菌体/VLA1涂覆的孔重复所述生物淘选过程3次，并且对用于每一种文库的不超过2个涂覆孔进行筛选，一共进行4轮生物淘选。
VLA1选择的噬斑的PCR和测序对在第四轮生物淘选之后收集的经扩增噬菌体文库进行充分稀释以便得到不超过100pfu/平板。刮取12个独立的噬斑，并且为每个文库收集刮取的每一个噬斑的块。将一毫升噬菌体提取缓冲液添加到每一个块中，并且在4℃下保存。将通过用移液管头刮顶层琼脂糖收集的噬斑分散到100μL的10mM EDTA，pH 8.0中，涡旋搅拌，并且在65℃下保持10分钟。将样品冷却到室温，并且以14000×g离心3分钟。
用以下试剂进行PCR2μL澄清的噬菌体裂解液；5μL 10×TAQGold缓冲液(Perkin Elmer)；5μL 25mM MgCl2；1μL T7选择上引物(GGAGCTGTCGTATTCCAGTC(SEQ ID NO3))；1μL T7选择下引物(AACCCCTCAAGACCCGTTTA(SEQ ID NO4))；1μL dNTP混合物(各10mM)；0.5μL TAQ Gold DNA聚合酶(Perkin Elmer)；和用PCR级水将体积补足到50μl。将反应物与DNA聚合酶一起加热到94℃保持2分钟，然后为30个循环，其中每个循环为94℃50秒，50℃1分钟，和72℃1分钟。最终的延伸在72℃下进行6分钟。
在用TAE(40mM Tris，10mM EDTA，20mM冰醋酸)和EtBr(10μg/ml)制备的1％琼脂糖凝胶上对十微升(10μL)的PCR反应物进行电泳。用蒸馏水将剩余的PCR反应物补足到150μL。将该反应物转移到MANU 030平板上，并且将该平板真空干燥20分钟。通过添加40μL纳米纯净水到所述平板的合适的孔中回收所述PCR产物。将五微升(5μL)产物与1μL正向或反向引物，2μL ReadyReaction Mix(Applied Biosystems Inc.，Foster City，CA)和2μL 5倍缓冲液(Applied Biosystems Inc)混合。
在循环测序之后，添加40μL70％乙醇(EtOH)，并且将混合物在室温下温育15分钟。然后以3400转/分钟将该混合物离心30分钟。除掉PCR试管的盖子，将试管颠倒，并且1000转/分钟的速度短时间(1分钟)离心。让沉淀的产物干燥30分钟至1小时。将产物重悬在加入甲酰胺的染料溶液中，在96℃下温育该混合物3分钟，在冰上放置2分钟，然后，在添加甲酰胺溶液15分钟之内将样品加样到测序凝胶上。
内皮细胞MCP-1 H2O2实验用抗-CD31涂覆的金属珠从野生型小鼠肾脏分离原代内皮细胞。在含有20％FCS的内皮细胞培养基(DMEM/F12，50μg/ml内皮有丝分裂原，1％青霉素/链霉素，20mM L-谷氨酰胺，和1U/mL刚制备的未经过滤的肝素)中培养细胞。在无菌PBS中的1％明胶涂覆的96孔板中，32个孔具有5×104细胞/孔。将细胞保持在含有20％FCS的内皮细胞培养基中，直到细胞汇合。用HBSS洗涤汇合的细胞，然后将细胞用无血清内皮细胞培养基覆盖，用量为200μL/孔，并且将细胞在潮湿的室中在37℃，5％CO2中保持。24小时之后添加无血清的新鲜内皮细胞培养基，在进行细胞结合α1β1整联蛋白的测定之前24或48小时添加各种浓度的MCP-1和H2O2，如下面的表1所示。
表1
免疫沉淀让内皮细胞培养物生长到汇合，并且放入无血清的内皮细胞培养基中培养24小时。然后用1600皮克(pg)人重组MCP-1或200μM H2O2在无血清条件下处理细胞48小时。用冰冷的HBSS洗涤细胞2次，并且在冰上含有蛋白酶抑制剂的整联蛋白裂解缓冲液(50mM HepespH 7.4，100mM NaCl，0.4％ Triton X-100，1mM CaCl2，1mM MgCl2，10％甘油)中对细胞进行超声波处理(10次脉冲，每次15秒)。通过Bradford测定(BioRad)确定蛋白浓度。用A蛋白琼脂糖珠预先澄清相等浓度的裂解液。将重组人VLA1(0.2μg)添加到预先澄清的裂解液中，并且在4℃下温育1小时，然后添加兔抗VLA1抗体(Chemicon)和A蛋白琼脂糖珠。在章动条件下在4℃下温育样品过夜。在4℃下用整联蛋白裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂洗涤珠6次，然后与50μl 6×Laemmli样品缓冲液合并，并且煮沸5分钟，并且保持在冰上。
样品在10％ SDS PAGE凝胶上电泳，并且转移到PVDF膜(BioRad)。在4℃下将膜与胶原XIII抗体一起温育过夜，所述抗体是在兔子体内针对NC3结构域的合成肽产生的，该抗体由TainaPihlajaniemi博士提供(Hagg等，J.Biol.Chem.273，15590-15597)，其中该抗体已经以1∶2000的比例在1％BSA、0.05％Tween20、20mM Tris.Cl(pH 7.4)，0.5M NaC(TTBS)中稀释。用TTBS洗涤所述膜若干次，并且与以1∶25000的比例在1％BSA TTBS中稀释的山羊抗兔-HRP一起温育1小时。用化学发光检测试剂盒(Amersham)和X-光片检测带。
RT-PCR按照生产商的说明书用Trizol(GibCo/BRL，Gaithersberg，MD)制备总RNA。通过使用第一股链cDNA合成试剂盒SuperScript III(GibCo BRL)对2微克总RNA进行逆转录。通过RT-PCR使用特异引物对胶原XIII mRNA转录物进行半定量分析。作为内标，还分析了甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)-一种细胞管家基因的表达。在PTC100(M.J.Research，Waltham，MA)中用amplitaq gold(AppliedBiosystems，Branchburg，NJ)进行PCR反应94℃2分钟，1个循环，94℃60秒，60℃60秒，72℃90秒，30个循环，然后72℃10分钟，然后保持在4℃下。在下面的表2中列举了使用的寡核苷酸引物对。
表2
引物是根据公开的序列设计的。在2％琼脂糖凝胶上分离扩增产物，在用溴化乙锭染色后通过UV透照仪显示，并且照像。所有PCR实验都包括对照反应，这些反应包括除了互补DNA之外的所有组分。在这些对照反应物中没有可检测的带。所有PCR产物都是通过DNA测序证实的。
免疫荧光将四微米新鲜冰冻肾脏切片安装在载玻片上，并且用冰冷的丙酮固定。通过免疫荧光显微术检查组织切片，使用对内皮细胞特异的第一抗体(抗-小鼠CD31，(Abcam))或对胶原XIII特异的第一抗体(由Taina Pihlajaniemi博士馈赠(Hagg等，J.Biol.Chem.273，15590-15597)，抗体浓度分别为以1∶100和1∶200在1％BSA，5％小鼠血清，1×PBS中的稀释浓度。肾脏切片在第一抗体中温育60分钟，用1×PBS洗涤3次，然后与各个制备的抗-兔Alexa fluor 568(red-coIXIII)、抗-大鼠Alexa fluor 488(green-CD31)(Molecular Probes，Inc.Eugene，OR，美国)一起温育60分钟，所述温育在1％BSA，5％小鼠血清，1×PBS中进行，浓度为1∶200。用1×PBS洗涤3次之后，添加封固剂(0.1g N-没食子酸丙酯，5ml 1XPBS，5ml甘油)，并且用盖玻片盖上样品。
用Olympus BH2-RFCA荧光显微镜(Hitschfel InstrumentsInc.，St.Louis，MO)观察免疫染色，并且拍照，放大倍数为200倍，该显微镜上安装有SPOT-RT-Slider成像系统和软件(DiagnosticInstraments Inc.，Sterling Heights，M1)。
结果单核细胞流入阿尔波特肾是通过整联蛋白α1β1的内皮细胞表面配体介导的。
在早期的报道中(Sampson等，J.Biol.Chem.，276，34182-34188(2001))，存在于阿尔波特小鼠(它同样是整联蛋白α1β1无效的(DKO′s))的肾脏中的单核细胞和肌成纤维细胞的数量明显少于在年龄匹配的阿尔波特小鼠中的数量。尽管这一数据明确表明了α1β1整联蛋白在纤维化中的作用，但是它没有清澄这一发现潜在的机理。尽管存在多种可能的解释(例如，α1β1整联蛋白通过管状上皮细胞或延缓了的肾小球病理的下游作用影响趋化因子/细胞因子表达)，但探讨了α1β1整联蛋白在单核细胞流入肾小管间质中的直接作用。阿尔波特肾小管间质中的单核细胞主要是α1β1整联蛋白阳性的(图1)。这可能反映了α1β1整联蛋白-阳性单核细胞从外周血的募集，或在α1β1整联蛋白进入肾小管间质之后在单核细胞中的表达被激活。
通过荧光激活细胞分类术(FACS)分析骨髓衍生的单核细胞，该分析使用针对CD11b(单核细胞的标记，监控到的荧光强度表示在图2中的频率分布图的Y-轴上)的荧光标记的抗体和抗α1β1整联蛋白的荧光标记的抗体(监控到的荧光强度表示为图2中的频率分布图的X-轴上)。图2中的结果表明骨髓中的一部分(大约10％)单核细胞能表达α1β1整联蛋白。为了确定新流出的单核细胞是否表达α1β1整联蛋白，用Alexa 568(购自Molecular Probes的红色荧光标记)标记葡聚糖。由于单核细胞是外周血中的唯一的吞噬细胞，在将这些葡聚糖注射到尾静脉中时，只有单核细胞被标记了。在注射三天之后，收获肾脏，并且用FITC-缀合的(绿色)抗-CD11b抗体进行冰冻切片的免疫染色。图3A和3B中的结果表明Alexa-标记的细胞是单核细胞。用FITC-缀合的抗α1β1整联蛋白抗体对第二张切片进行免疫染色。图3C和3D表明Alexa-标记的细胞是α1β1整联蛋白免疫阳性的。总之，这些数据表明了标记的葡聚糖方法对监控单核细胞运输到肾小管间质的特异性，并且表明了新流出的单核细胞表达α1β1整联蛋白，支持了这种整联蛋白在促进单核细胞进入肾小管间质间隙中的直接作用的可能性。
如果α1β1整联蛋白介导单核细胞流出，那么在阿尔波特小鼠中的流出速度应当比在α1β1-缺陷型阿尔波特(DKO)小鼠中的流出速度快。在时程研究中，用标记的葡聚糖注射这两种模型。在注射三天之后，收获肾脏，并且将其用FITC-缀合的抗-CD11b免疫染色。对间隔100μM的10个切片的20个视野进行标记的单核细胞计数。在每一个时间点上使用两只独立的动物。图4中的结果表明，在DKO小鼠中单核细胞流出的开始比在阿尔波特小鼠中的开始晚得多。更重要的是，与阿尔波特小鼠相比，DKO小鼠中单核细胞进入肾小管间质间隙的速度慢得多，这提供了α1β1整联蛋白在介导单核细胞流入肾小管间质中的直接作用的进一步的证据。图4中的线条表示标准误，而不是标准差。由于单核细胞流出是不规则的，所以对代表纵向冰冻切片的整个外周肾皮质的视野进行成像和计数。
如果存在这种直接作用，在阿尔波特小鼠的肾皮质血管内皮上必然存在α1β1整联蛋白的配体，这种配体在正常小鼠是缺乏的。为了检验所述配体的存在，用Alexa 568标记纯化的α1β1整联蛋白(从Chemicon，Temecula，CA购买)，并且将标记过的整联蛋白注射到正常、阿尔波特和DKO小鼠的尾静脉中。在注射24小时之后，收获肾脏，并且检查冰冻切片。图5A中的结果表明在对照小鼠中缺少标记，而阿尔波特小鼠在血管内皮中表现出强烈标记(图5B)。由于单核细胞能吞噬标记的葡聚糖，可被解释为整联蛋白可能是单核细胞中被吞噬的整联蛋白。比较图5B和5C发现单核细胞和Alexa-标记的整联蛋白α1β1不共定位(因为在这两幅图片中没有重叠的荧光)。这些数据表明，在阿尔波特血管内皮中存在α1β1整联蛋白的配体。这种配体在年龄匹配的DKO小鼠中的存在进一步暗示α1β1整联蛋白在这些小鼠中的缺乏可以解释单核细胞流出速度的变慢。
为了提供对α1β1在单核细胞流入病变肾脏中的功能的更明确的试验，将5μg纯化的α1β1整联蛋白每日一次注射到阿尔波特小鼠尾静脉中，在注射标记的葡聚糖一天之前开始，并且在注射葡聚糖三天之后收获肾脏。用Alexa-缀合的整联蛋白α1β1进行初步研究，以便在阻断实验之前评估稳定性。发现纯化的整联蛋白能稳定至少72小时(数据未发表)。如果单核细胞跨内皮转移到间质间隙是部分通过配体结合在内皮细胞上介导的，那么与未处理过的年龄匹配的阿尔波特小鼠相比，应当观察到在用α1β1整联蛋白处理过的阿尔波特小鼠中标记的单核细胞减少，因为所述纯化的整联蛋白会占据配体，使得可用于结合单核细胞的配体数量减少。图4B中的结果表明，用纯化的α1β1整联蛋白处理过的小鼠的单核细胞流出减少的倾向。它表明了配体可能确实在单核细胞募集到阿尔波特肾的间质间隙中起作用。
为了进一步验证α1β1整联蛋白对外周血单核细胞的影响是否会促进单核细胞迁移到纤维化肾脏的间质间隙，采用了移植方法。已经证明辐射和化学肌部分切除术(myoloablation)策略在阿尔波特小鼠中有毒性，能加快纤维化。选择被动移植方法，其中，来自正常对照或α1整联蛋白无效小鼠的骨髓产生的单核细胞是通过在存在Alexa-568荧光染料-缀合的葡聚糖的条件下培养细胞而标记的。将标记过的细胞注射到整联蛋白α1-缺陷型阿尔波特(DKO)小鼠体内，并且通过在移植三天之后统计间质中荧光细胞的数量评估跨内皮转移速度。下面的表3显示了5次独立实验的结果。尽管实验组的动物数量彼此不同，但是在所有情况下，与用正常单核细胞移植的小鼠相比，在用整联蛋白α1-缺陷型单核细胞移植的小鼠中迁移的单核细胞数量显著减少。
表3
克隆并且鉴定整联蛋白α1β1的血管内皮细胞配体胶原III。
迄今所提供的数据预测了α1β1整联蛋白的配体是在渐进性纤维化期间在肾脏血管内皮细胞上表达的。尽管有多种方法被用于克隆所述配体，但是肾脏内皮细胞-特异的噬菌体展示文库的生物淘选方法被成功地使用。利用与磁珠缀合的抗体从α1整联蛋白缺陷型阿尔波特小鼠分离内皮细胞。将肾脏切碎，并且用胶原酶处理，以便从间质基质中释放出细胞。将所述细胞与磁珠混合，所述磁珠与通过商业渠道获得的对内皮细胞特异的抗体(抗-CD31)化学缀合。利用磁体将结合的细胞与未结合的细胞分离，并且洗涤若干次。所得到的细胞直接用于制备RNA或用与纯化的α1β1整联蛋白缀合的磁珠进一步选择，然后用于RNA制备。对以上两种不同的RNA制剂进行聚腺苷酸(PolyA)选择，并且将聚腺苷酸+RNA用于构建丝状噬菌体展示文库。将所述丝状噬菌体人工改造成能展示小部分克隆的cDNAs，作为位于所述丝的一端的肽展示。利用被称为“生物淘选”的方法选择特异相互作用肽。用要寻找其相互作用结合配偶体的蛋白对塑料微量滴定板进行涂覆(在这种情况下，该蛋白是纯化的α1β1整联蛋白)。然后让所述噬菌体文库与涂覆的平板在通常能促进整联蛋白/配体相互作用的条件下反应。将不能反应的噬菌体洗掉，并且洗脱结合的噬菌体并且将其扩增。将该方法依次重复若干次，在经过三次或三次以上连续的结合和扩增步骤之后，导致能与用于对所述平板涂覆的蛋白特异相互作用的噬菌体被纯化。在这种情况下，使用这种技术仅纯化了其中所述一种噬菌体克隆。对插入片段进行的DNA序列分析发现所述噬菌体展示了胶原XIII的片段，胶原XIII是质膜结合胶原(Hagg等，J.Biol.Chem.，273，15590-15597，1998)。有趣的是，业已证实能结合胶原XIII的唯一的受体是α1β1整联蛋白(Nykvist等，J.Biol.Chem.，275，8255-8261，2000)。
胶原XIII/α1β1相互作用的生物学功能是完全未知的，不过被认为与细胞/细胞粘附有关系。应当强调的是，由于噬菌体展示测定的原理，胶原XIII被鉴定为α1β1整联蛋白的内皮细胞配体。由于插入噬菌体的与胶原XIII同源的DNA的小的尺寸，业已鉴定了α1β1整联蛋白的结合位点。这是一个重要事实，因为它使得能够测定包含该氨基酸序列的肽抑制剂的效力。所述克隆片段(即，与α1β1整联蛋白结合有关的胶原XIII的部分)的氨基酸序列如下GEKGAEGSPGLL(SEQ ID NO2)。
在来自慢性炎性肾脏的血管内皮细胞上诱导了胶原XIII。
利用上述正常和7周龄阿尔波特(晚期纤维化)肾脏制备内皮细胞聚腺苷酸+mRNA，并且通过RT-PCR分析胶原XIII表达。如图6所示，相对正常小鼠而言，在阿尔波特肾的血管内皮细胞中诱导了胶原XIII的表达。将平行反应扩增的GAPDH(一种管家基因)用作对照。在两个样品中GAPDH转录物是非常类似的。
以前业已证实了与对照肾相比，在阿尔波特肾中显著诱导了单核细胞化学引诱蛋白-1(MCP-1)(Sampson等，J.Biol.Chem.，276，34182-34188(2001))。有大量文献记载了这种有效的趋化因子能够促进单核细胞和淋巴细胞迁移到发炎组织的间质(参见Conti等的综述，Allergy Asthma Proc.，22，133-7(2001))。该迁移被认为主要是通过诱导粘附分子和/或它们的各自配体诱导的(Kim，J.Neurol.Sci.，137，69-78(1996))。基于这一发现，用各种浓度的重组MCP-1处理原代肾内皮细胞培养物，并且测量该内皮细胞与Alexa-568-缀合的α1β1整联蛋白的粘附。图7表示α1β1整联蛋白对用MCP-1预处理的内皮细胞的粘附和与未处理的细胞的粘附相比显著增强了。这种增强的粘附依赖于时间和剂量。
除了趋化因子之外，氧化应激与炎性组织的内皮细胞中的细胞因子、基质蛋白、金属蛋白酶、和细胞粘附分子的诱导相关(Yoon等，2002 J.Biol.Chem.，277，30271-30282)；Roebuck，Int.J.Mol.Med.，4，223-30(1999))。在体内，这主要是由于内皮氧化氮合成酶(eNOS)和可诱导的氧化氮合成酶(iNOS)的表达增强造成的，该表达的增强导致了过氧化氢的产生(Heeringa等，J.Pathology，193，224-32(2001))。在图8中，示出了过氧化氢促进Alexa-缀合的α1β1整联蛋白与培养的原代肾内皮细胞结合。这种作用是依赖浓度和时间的。
为了确定α1β1整联蛋白在培养的血管内皮细胞上的结合活性是否确实是胶原XIII，进行了间接共免疫沉淀测定。在存在或缺乏MCP-1的条件下培养内皮细胞48小时。在整联蛋白结合缓冲液中裂解细胞，并且将纯化的整联蛋白α1β1添加到澄清的混合物中。在温育之后，添加抗-整联蛋白α1-特异抗体，并且用A蛋白琼脂糖珠使复合物免疫沉淀。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分级分离免疫沉淀的材料，并且使用抗-胶原XIII抗体通过蛋白印迹进行分析。图9中的结果表明一条带具有XIII型胶原的适宜的分子大小(85-95kDa)，与早先的报道吻合(Hgg等，J.Biol.Chem.273，15590-15597(1998)；Hgg等，Matrix Biology，19，727-742(2001))。
为了确定是否在体内在血管内皮上诱导了胶原XIII，使用对胶原XIII和CD31(一种特异的内皮细胞标记)特异的抗体对来自正常和阿尔波特小鼠的肾冷冻切片进行双重免疫荧光分析。图10中的数据表明了在阿尔波特肾皮质中胶原XIII和CD31明显共定位的区域(加框的区域)。在对照中没有观察到了这两种蛋白的共定位。
讨论以前的研究业已证实，与具有相同近亲交配背景(129 Sv)的阿尔波特小鼠相比，整联蛋白α1无效阿尔波特(DKO)小鼠中间质纤维化的发展明显变慢(Cosgrove等，Am.J.Path.，157，1649-1659(2000)；Rodgers等，Kidney Int.，63，1338-1355(2003))。该项研究工作扩展到使用整联蛋白α1无效小鼠模型(Gardner等，Dev.Biol.，175，301-313(1999))和中和抗体方法的相关研究中，所述研究能有效延缓包括类风湿关节炎(De Fougerolles等，The Journal of Clinical Investigation，105，721-729(2000))、新月体性肾小球肾炎(Cook等，Am.J.Path.，161，1265-1272(2002))、和实验性结肠炎(Krieglstein等，J.Clin.Invest.，110，1173-1782(2002))在内的其他炎性疾病的发展速度。尽管在所有场合下整联蛋白α1β1中和作用的有益效果是显著的，但是导致这些观察结果的机理尚属未知。
为了确定单核细胞和肌成纤维细胞在间质破坏中的相关作用而进行的研究得出的压倒性的结论是，所述组织单核细胞介导肾细胞的细胞凋亡，促进了与渐进性肾脏纤维化相关的组织破坏(Rodgers等，Kidney Int.，63，1338-1355(2003))。在这里，证实了与阿尔波特小鼠相比，整联蛋白α1-无效阿尔波特小鼠中间质单核细胞的积累显著减少了。这种积累速度的减慢可能是由于单核细胞流入间质间隙的速度降低和/或对间质单核细胞增殖的影响。在本申请中，通过注射荧光染料缀合的葡聚糖证实了，与阿尔波特小鼠相比，在整联蛋白α1-缺陷型阿尔波特小鼠中单核细胞流入间质间隙的速度明显变慢。实际上，在本测定中在阿尔波特间质中观察到的荧光染料-标记的单核细胞主要是整联蛋白α1β1-阳性细胞。利用来自野生型和整联蛋白α1-缺陷型小鼠的骨髓的荧光染料标记的培养的单核细胞进行移植研究证实了该单核细胞在注射到α1整联蛋白-缺陷型阿尔波特小鼠体内时流出速度显著降低，直接证实了外周血单核细胞上的整联蛋白α1β1能提高这些单核细胞跨内皮转移到慢性炎性肾脏的间质间隙中的速度。
由于上述原因，以及其他支持性证据，推测在发生活性纤维化的阿尔波特肾的内皮细胞表面上必然存在α1β1整联蛋白的配体。将荧光染料-缀合的纯化的α1β1整联蛋白注射到阿尔波特、整联蛋白α1-缺陷型阿尔波特和正常对照小鼠的尾静脉中，证实了所述整联蛋白附着在病变小鼠，而不是正常小鼠的血管内皮上。通过用于鉴定相互作用蛋白的噬菌体展示方法(Ruoslahti等，Cancer Biology，10，435-442(2000)；Laakkonen等，Nature Medicine，8，751-755(2002))将胶原XIII鉴定为α1β1-阳性外周血单核细胞的内皮细胞受体。胶原XIII是一种质膜胶原(Hgg等，J.Biol.Chem.，273，15590-15597(1998))。业已确定胶原XIII为α1β1整联蛋白的特异配体(Nykvist等，J.Biol.Chem.，275，8255-8261(2000))，不过相互作用的功能性作用尚不清楚。有趣的是，在我们的噬菌体展示测定中鉴定的胶原XIII肽的氨基酸序列与A类清除受体(scavenger receptor)的胶原结构域同源(在氨基酸序列上具有67％的同一性)，这业已被确定为巨噬细胞附着在胶原上的机制(Gowen等，J.Leuk.Biol.，69，575-582(2001)；Kosswig等，J.Biol.Chem.，278，34219-34225(2003))。
以前的报道提示结合整联蛋白α1β1和α2β1的胶原参与了活化T-细胞迁移到炎性组织，不过，没有研究介导这种作用的细胞机制(Andreasen等，J.Immunol.，171，2804-2811(2003))。在关节炎患者中，发现整联蛋白α1β1-阳性淋巴细胞是引发与IV型胶原粘附的T-细胞亚群(Bank等，Clinical Immunol.，105，247-258(2002))，表明了α1β1-阳性淋巴细胞在促进人体慢性炎症中的特殊作用。
本文所提供的研究将这些观点综合在一起，提供了对发炎的组织如何选择循环单核细胞和淋巴细胞的该亚群的解释。不过，选择这些细胞用于迁移的生物学原因还是一个谜。可能的原因是，通过α1β1整联蛋白信号传导对这些细胞的激活赋予了对解决炎性状态通常有益的特征。业已发现，尽管炎症相关的单核细胞对TGF-β1是免疫阳性的，而定居的(resident)单核细胞则不是(Rodgers等，KidneyInt.，63，1338-1355(2003))。尽管单核细胞急剧升高可能有利于解决炎性状态，但是单核细胞持续接触升高的TGF-β是已知具有破坏性的(Border等，Nature(London)，346，371-374(1990))。
尽管有关这种机制的生物学原因尚不清楚，根据本申请所描述的研究，阻断α1β1整联蛋白-介导的淋巴细胞/单核细胞的迁移对于控制与慢性炎性失调相关的组织破坏的潜在治疗益处是显而易见的。本申请提供的移植数据表明，α1β1中和对单核细胞迁移到入肾间质具有重要的，尽管是微弱的作用。显然存在驱动单核细胞渗入这种慢性炎性模型中的其他机制。目的在于限制淋巴细胞/单核细胞迁移的定向治疗方案在延缓慢性炎性疾病的发展方面是有效的，这些疾病为诸如人类的牛皮癣、炎性肠病和多发性硬化(Harlan等，Crit.Care Med.，30，S214-9(2002))。某些业已充分表征的方法通常涉及到利用中和性单克隆抗体阻断所述受体以及它的配体。业已将这种方法成功地应用在LFA-1/ICAM-1相互作用(抑制白细胞流入炎性组织)和VLA-4/VCAM-1相互作用(抑制淋巴细胞和单核细胞流入炎性组织)(Yusuf-Makagiansar等，Med.Res.Rev.，22，146-67(2002))。最近，发现在内皮细胞上表达的一种新的粘着分子-血管粘着蛋白(VAP-1)在与慢性肝炎相关的淋巴细胞的粘附和迁移方面发挥关键作用(Lalor等，J.Immunol.，169，983-92(2002))。综上所述，这一类研究强调了影响炎性细胞结合、激活、和流入慢性发炎组织的位点中机制的多样性。
根据本文所提供的证据，显而易见的是，整联蛋白α1β1/胶原XIII相互作用在介导单核细胞流入慢性发炎肾脏方面起着重要作用。采用α1β1整联蛋白-特异的中和抗体和/或整联蛋白α1-缺陷型小鼠进行的研究表明，该机制与类风湿关节炎、新月体性肾小球肾炎、和实验性结肠炎相关。这种治疗方法有可能提供对任何与α1β1整联蛋白-阳性淋巴细胞/单核细胞相关的慢性炎性疾病的治疗益处。
本文所引用的所有专利、专利申请、出版物的完整的公开，以及包括例如GenBank登录号和EMBL登录号在内的核酸和蛋白数据库条目被收作本文参考，就如同被单独收作本文参考一样。在不背离本发明范围和精神的前提下，对本发明进行的多种修改和改变对本领域技术人员来说是显而易见的，并且应当理解的是，本发明并不过分局限于本文所提供的说明性实施方案。
无序列文本SEQ ID NO1肽SEQ ID NO2肽SEQ ID NO3引物SEQ ID NO4引物SEQ ID NO5引物SEQ ID NO6引物SEQ ID NO7引物SEQ ID NO8引物SEQ ID NO9引物SEQ ID NO10引物序列表<110>Boys Town National Research HospitalCosgrove，Dominic<120>α1β1整联蛋白的可诱导的配体和用途<130>249.0007 0101<140>10/698,121<141>2003-10-31<150>60/423,297<151>2002 11-01<160>10<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>人工合成的肽<400>2Gly Glu Lys Gly Ala Glu Gly Ser Pro Gly Leu Leu
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<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>10tgggggcctg cttgtcctgt ct 2权利要求
1.一种用于治疗患有慢性炎性疾病的患者的方法，该方法包括对所述患者施用阻断剂，以便中和胶原XIII与α1β1整联蛋白结合的能力。
2.权利要求1的方法，其中所述慢性炎性疾病以由浸润性单核细胞、淋巴细胞或这两者导致的渐进性病理为特征。
3.权利要求1的方法，其中所述慢性炎性疾病是肾脏纤维化、肺纤维化、肝纤维化、类风湿关节炎、牛皮癣、实验性结肠炎、或新月体性肾小球肾炎。
4.权利要求1的方法，其中所述阻断剂是肽。
5.权利要求1的方法，其中所述阻断剂是中和抗体。
6.权利要求1的方法，其中所述阻断剂能阻断外周血单核细胞和/或淋巴细胞上的α1β1整联蛋白与慢性发炎组织的血管内皮上的胶原XIII的相互作用。
7.一种用于治疗患有炎性疾病或其他状况的受试者的方法，在该疾病或状况中，观察到整联蛋白α1β1-阳性间质单核细胞和/或淋巴细胞的积累，该方法包括给所述受试者施用能破坏胶原XIII和α1β1整联蛋白之间的相互作用的活性剂。
8.权利要求7的方法，其中，所述活性剂阻断胶原XIII和α1β1整联蛋白的结合。
9.权利要求8的方法，其中，所述阻断剂是肽。
10.权利要求8的方法，其中，所述阻断剂是抗体。
11.权利要求7的方法，其中，所述炎性疾病或其他状况是肾脏纤维化、肺纤维化、肝纤维化、类风湿关节炎、牛皮癣、实验性结肠炎，或新月体性肾小球肾炎。
12.权利要求7的方法，其中，所述活性剂能阻断外周血单核细胞和/或淋巴细胞上的α1β1整联蛋白与慢性发炎组织血管内皮上的胶原XIII的相互作用。
13.一种减弱整联蛋白α1β1-阳性单核细胞选择性流入慢性发炎组织的间质的方法，该方法包括将外周血单核细胞和/或淋巴细胞上的α1β1整联蛋白与干扰胶原XIII和α1β1整联蛋白之间的相互作用的活性剂接触。
14.权利要求13的方法，其中，减弱整联蛋白α1β1-阳性单核细胞选择性流入慢性发炎组织的间质包括让α1β1整联蛋白与能特异结合α1β1整联蛋白的具有胶原XIII的至少一部分氨基酸序列的肽接触。
15.权利要求13的方法，其中，减弱整联蛋白α1β1-阳性单核细胞选择性流入慢性发炎组织的间质包括在能有效封闭胶原XIII的结合位点的条件下与抗体接触，该抗体结合发炎组织血管/毛细血管内皮细胞的细胞表面上胶原XIII配体的抗体。
16.权利要求13的方法，其中，减弱整联蛋白α1β1-阳性单核细胞选择性流入慢性发炎组织的间质包括在能有效防止胶原XIII蛋白在细胞表面上表达的条件下，让所述血管内皮与小的抑制性RNAs接触。
17.一种降低单核细胞和/或淋巴细胞流入慢性发炎组织的间质间隙的速度的方法，该方法包括阻断胶原XIII与α1β1整联蛋白的结合。
18.权利要求17的方法，其中，所述阻断包括阻断所述胶原XIII配体。
19.权利要求17的方法，其中，所述阻断包括阻断α1β1整联蛋白。
20.权利要求17的方法，其中，阻断包括让所述整联蛋白与包含α1β1整联蛋白的结合位点的胶原XIII的肽片段接触。
21.权利要求17的方法，其中，阻断包括让所述胶原XIII配体与单特异性抗体接触。
22.一种降低单核细胞和/或淋巴细胞流入慢性发炎组织的间质间隙的速度的方法，该方法包括阻断胶原XIII与α1β1整联蛋白的结合。
23.一种阻断外周血单核细胞和/或淋巴细胞上的α1β1整联蛋白与慢性发炎组织血管内皮上的胶原XIII相互作用的方法，该方法包括让单核细胞和/或淋巴细胞、血管内皮、或这两者与能占据α1β1整联蛋白上的胶原XIII结合位点或封闭胶原XIII上的α1β1结合位点的试剂接触。
24.权利要求23的方法，其中，占据α1β1整联蛋白上的胶原XIII结合位点的试剂是肽抑制剂。
25.权利要求23的方法，其中，封闭胶原XIII上的α1β1结合位点的试剂是中和性单克隆抗体。
26.一种鉴定能抑制单核细胞流入模型的间质间隙的试剂的方法，在该模型中，涉及到间质单核细胞或淋巴细胞，该方法包括鉴定能破坏胶原XIII和α1β1整联蛋白之间的相互作用的试剂。
27.权利要求26的方法，其中，所述试剂能抑制Alexa-缀合的纯化α1β1整联蛋白与MCP-1处理的原代内皮细胞的结合。
28.权利要求26的方法，其中，所述试剂是抗体，该抗体能阻断Alexa-缀合的纯化α1β1整联蛋白与培养的MCP-1处理的血管内皮细胞之间的相互作用。
29.一种分离的肽，具有序列GAEGSPGL(SEQ ID NO.1)，其中，所述肽能破坏胶原XIII和α1β1整联蛋白之间的相互作用。
30.权利要求29的分离的肽，其具有序列GEKGAEGSPGLL(SEQ IDNO2)。
31.权利要求29的分离的肽，其具有8-16个氨基酸。
32.权利要求31的分离的肽，其具有12-16个氨基酸。
33.一种分离的肽，其由GAEGSPGL(SEQ ID NO.1)组成。
34.一种分离的肽，其由GEKGAEGSPGLL(SEQ ID NO2)组成。
35.一种分离的肽，其具有与GAEGSPGL(SEQ ID NO.1)具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，其中，所述肽破坏胶原XIII和α1β1整联蛋白之间的相互作用。
36.一种分离的肽，其具有与GEKGAEGSPGLL(SEQ ID NO.2)具有至少70％的序列同一性的氨基酸序列，其中，所述肽破坏胶原XIII和α1β1整联蛋白之间的相互作用。
37.权利要求29的肽的抗体。
38.权利要求30的肽的抗体。
39.权利要求33的肽的抗体。
40.权利要求34的肽的抗体。
41.权利要求35的肽的抗体。
42.权利要求36的肽的抗体。
全文摘要
本发明涉及能破坏胶原XIII和α1β1整联蛋白之间的相互作用的试剂，特别是肽和单克隆抗体的鉴定和用途。
文档编号C07K16/28GK1826137SQ200380108181
公开日2006年8月30日 申请日期2003年10月31日 优先权日2002年11月1日
发明者D·科斯格罗夫 申请人:博伊斯镇国家研究医院