专利名称：Nkg2d受体的配体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及NKG2D受体的配体及其应用，特别是涉及能与NKG2D受体特异结合的小分子多肽配体，以及这些小分子多肽的医药用途。
背景技术：
自然杀伤细胞(Natural Killer，NK细胞)是天然免疫系统的一个重要成员，通过细胞毒作用、释放细胞因子和趋化因子来实现其免疫调节作用，其活性由细胞膜上一系列的激活和抑制性受体与靶细胞上的相应配体的相互作用所产生的信号来介导。正常机体内的NK细胞由于抑制性受体所介导的负调节信号占主导地位，处于杀伤抑制状态，抑制性受体通过区分正常细胞和疾病状态细胞的MHC-I类分子的变化来行使其免疫监视功能缺失MHC-I类分子的靶细胞可以被NK细胞清除，而正常表达MHC-I类分子的靶细胞不被NK细胞杀伤。
然而，有证据表明，NK细胞的活化性受体也在NK细胞的活化和调节中扮演重要角色。NKG2D受体是NK细胞上的一个活化性受体，它和靶细胞上表达的NKG2D的配体MICA结合时，NK细胞就可以被激活，也就是说由NKG2D所介导的激活信号导致NK细胞对抑制性受体所介导的负调节信号不敏感，这是一些可以正常表达MHC-I类分子的靶细胞也可以被NK细胞清除的原因。CD8+T、γδT和巨噬细胞等都是行使人体正常免疫监视功能的重要成员，NKG2D在这些细胞上都有表达，也是这些细胞的活化性受体。但是，这些细胞(NK细胞、CD8+T、γδT和巨噬细胞等)的过度激活会使它们对正常细胞产生攻击，从而导致病理状态，产生如习惯性流产、SLE与炎症性肠病等自身免疫病、异体移植器官的排斥反应。应用免疫抑制剂是一种比较常见的治疗手段，但目前应用较多的免疫抑制剂主要具有如下缺点这些免疫抑制剂的针对性差，其抑制效应是全方位的，长期大量应用后会造成机体免疫能力的全面低下；易于发生继发性感染等。也有采用下面两种方法来进行治疗使游离的MICA分子和NKG2D结合，由于能阻断NKG2D与其配体MICA的结合位点，会降低NK细胞、CD8+T细胞的杀伤活性(Groh V，Wu J，Yee C，Spies T.Tumour-derived soluble MICligands impair expression of NKG2D and T-cell activation.Nature 2002；419734-738)；或者使用NKG2D单抗阻断NKG2D其配体MICA的结合，同样会降低NK细胞的激活(LiP，Willie ST，Bauer S，Morris DL，Spies T，Strong RK.Crystal structure of the MHCclass I homolog MIC-A，a gammadelta T cell ligand.Immunity 1999；10577-584；Bauer S，Groh V，Wu J，Steinle A，Phillips JH，Lanier LL，Spies T.Activation of NK cells and Tcells by NKG2D，a receptor for stress-inducible MICA.Science 1999；285727-729)。虽然这两种方法特异性好，均具有非常显著的特点与明显的优势，但由于MICA分子和NKG2D单抗的分子量大，氨基酸残基数量较多，通透性低，单位体积内的药物有效浓度不是很高；且长期应用后在体内易于产生抗体，降低疗效。
发明内容
本发明的目的是提供能与NKG2D受体特异结合的配体。
本发明所提供的NKG2D受体的配体，为具有下述氨基酸序列之一的多肽1)MICA-P1DGSVQ；2)MICA-P2KDLRMTLAHIK；3)MICA-P3THYHAMHADCLQ；4)MICA-P2LKTWDRETRDLTGKDLRMTLAHIKDQ；5)MICA-P3LEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKS。
上述多肽中MICA-P1、MICA-P2和MICA-P3较短，为短肽；另外两种MICA-P2L、MICA-P3L较长，为长肽。本发明多肽可以用人工合成方法直接合成，也可以将这些多肽的编码基因融合或分别插入到表达载体，然后转染宿主细胞，用基因工程方法生产。
本发明的另一个目的是提供本发明多肽的医药用途。
NK细胞和CD8+T细胞等是以细胞免疫为主的自身免疫性疾病及异体移植排斥反应的主要效应细胞，NK细胞和CD8+T细胞上表达的NKG2D和靶细胞上表达的配体分子MICA结合后造成异常激活，导致病理损伤，本发明发明人通过实验证实，本发明短肽能与NKG2D相结合，可起封闭NKG2D与MICA分子结合位点的作用，能抑制NK细胞和CD8+T细胞的异常激活，可作为NK细胞和CD8+T细胞的特异性免疫抑制剂，用于治疗自身免疫疾病和异体移植的排斥反应。
可以一种或几种本发明多肽为活性成分，制备为治疗自身免疫疾病和/或异体移植排斥的药物。
其中，所述药物的活性成分优选为所述MICA-P1、所述MICA-P2和所述MICA-P3的组合物；组合物中MICA-P1、MICA-P2和MICA-P3的重量份数比优选为为1∶2-3∶2-3。
所述药物的活性成分另一种优选方案为所述MICA-P1、所述MICA-P2L和所述MICA-P3L的组合物；组合物中所述MICA-P1、所述MICA-P2L和所述MICA-P3L的重量份数比优选为1∶6-7∶6-7。
在应用时，上述药物需要的时候还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。常用剂型有片剂、胶囊、软胶囊、滴丸、注射液、冻干粉针、口服液、分散片等，均可以按照药学领域的常规方法制备。有效使用剂量为0.05-0.5mg/Kg/日。
本发明根据MICA分子与NKG2D的相互作用区域，以MICA分子为参考模板，设计、合成一组能与NKG2D特异结合的小分子多肽，能选择性地降低由NK、CD8+T和巨噬细胞等异常激活所造成的细胞免疫反应，而非全面降低机体的免疫反应，有利于避免长期使用后所造成的易于继发性感染的倾向；所合成的多肽分子量小，极少引起机体的免疫反应，且溶解性好、通透性强，易于到达作用部位发挥作用，能实现和NKG2D单抗及可溶性的全分子MICA相同的作用，同时还避免了其副作用；本发明多肽可采用现有常规方法制备得到，技术成熟，可广泛用于治疗自身免疫疾病和异体移植的排斥反应。
图1A为MICA-NKG2D复合分子的二级结构示意图；图1B为本发明多肽的参考模板在MICA-NKG2D复合分子的位置示意图；图2A为本发明多肽对NK92细胞杀伤Hela细胞作用的抑制效应；图2B为不同浓度本发明多肽对NK92细胞杀伤Hela细胞作用的抑制效应；图2C为本发明多肽对NK92细胞杀伤K526细胞作用的抑制效应；图3A为不同短肽组合对NK92细胞杀伤Hela细胞作用的抑制效应；图3B为本发明多肽组合物对NK92细胞杀伤Hela细胞作用的抑制效应；图3C为本发明多肽两种组合(P1+P2+P3、P1+P2L+P3L)与sMICA对NK92细胞杀伤Hela细胞作用的抑制效应比较；图4为本发明多肽对小鼠肝脏淋巴细胞杀伤YAC-1细胞的抑制效应；图5为本发明多肽对小鼠肝损伤模型的治疗作用。
具体实施例方式
实施例1、NKG2D受体的多肽配体1、多肽序列的设计与合成如图1A和图1B所示，根据NCBI提供的蛋白数据库PDB文件，NKG2D-MICA复合体的相互作用与β1和β2链之间的环状连接区有关，因此MICA的β1和β2链之间的环状连接区(13-21)可以作为肽段设计的第一个参考模板；MICA的α1结构域包含和NKG2D-A相互作用的螺旋区(70-80)，可以作为肽段设计的第二个参考模板；MICA的α2结构域有一个由10个氨基酸残基(152-161)构成的螺旋区，包含和NKG2D-B相互作用的残基，可作为肽段设计的第三个参考模板。
为便于合成，本发明多肽的氨基酸序列和其参考模板之间稍有不同，而且稍长的两个肽段能模拟模板α1和α2的整个结构域，共获得5个短肽，分别命名为MICA-P1、MICA-P2、MICA-P3、MICA-P2L和MICA-P3LMICA-P1，以MICA的β1和β2链之间的环状连接区(16-20)为参考模板，由5个氨基酸残基组成，序列为DGSVQ；MICA-P2，以MICA的α1结构域和NKG2D-A相互作用的螺旋区(72-82)为参考模板，由11个氨基酸残基组成，序列为KDLRMTLAHIK；MICA-P3，以MICA的α2结构域和NKG2D-B相互作用的螺旋区(156-167)为参考模板，曲12个氨基酸残基组成，序列为THYHAMHADCLQ；MICA-P2L，以MICA的α1结构域和NKG2D-A相互作用的螺旋区(58-84)为参考模板，由25个氨基酸残基组成，序列为KTWDRETRDLTGKDLRMTLAHIKDQ；MICA-P3L，以MICA的α2结构域和NKG2D-B相互作用的螺旋区(147-173)为参考模板，由27个氨基酸残基组成，序列为EDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKS。三个短肽(MICA-P1、MICA-P2及MICA-P3)的疏水性氨基酸不超过各自氨基酸总数的50％，而且位于肽段内部；MICA-P2与MICA-P2L、MICA-P3与MICA-P3L的参考模板在MICA蛋白中的位置相同，但长短不同。
另外，设计HLA-E功能区的无关肽(Px的序列RDTAQIFRVNLRT)作为阴性对照。
这些肽段可以采用常规的固相合成方法合成，经HPLC纯化，纯度大于95％以上(王良友，陈正英，潘和平.降钙素基因相关肽的合成.中国药物化学杂志，1997，7(4)287-290)。
表1.合成短肽的序列及性质
2、多肽二维结构分析采用两种方法(ANTHEPROT 4.3-Garnier和ANTHEPROT 4.3-Gibrat)对本发明的5个肽段进行二维结构分析，结果如表2所示，分析表明所合成的短肽的二维结构以稳定的α螺旋形式存在，近似于其设计参考模板的二维结构。
表2 合成短肽的二维结构
A.通过ANTHEPROT 4.3-Garnier方法分析的短肽的二维结构；B.通过ANTHEPROT4.3-Gibrat方法分析的短肽的二维结构；H代表螺旋；E代表折叠；T代表转角；C代表无规卷曲。
实施例2、本发明多肽的抑制实验1、短肽P1、P2、P3对NK细胞系杀伤表达MICA表面分子的细胞的抑制效应(在实施例中P1即为MICA-P1，其他实施例表示与此相同)采用51Cr同位素细胞杀伤试验，观察短肽对NK细胞系杀伤表达MICA表面分子的细胞的抑制效应。
NK细胞系-NK92细胞表达NKG2D，Hela细胞表达MICA表面分子，本实验分别采用NK92细胞和Hela细胞作为效应细胞和靶细胞，加入各条肽的不同组合、不同浓度的溶液进行实验，实验用51Cr同位素释放法测定NK92细胞的杀伤效率(在实施例中每实验组平行对照不少于3个，其他实施例与此相同)。
效靶比为10∶1，在细胞培养板每孔加入105个(100μl)NK92细胞和浓度为20nM的短肽溶液(以PBS溶液作为溶剂)5μl，使其终浓度为1nM。阴性对照加入浓度为200nM的的无关肽Px溶液(以PBS溶液作为溶剂)5μl，使其终浓度为10nM。并以同体积的PBS溶液作为空白对照，37℃、5％CO2温育0.5小时，然后再加入51Cr(购自中国同位素总公司)标记的Hela细胞104个(100μl)，实验中设定最大释放组(104个靶细胞加1％TritonX-100溶液，总体积为200μl)和自然释放组(只加104个靶细胞，总体积为200μl)，完成后将培养板稍作离心，37℃、5％CO2温育4小时，取100μl上清液，r-计数，按以下公式计算杀伤率＝(试验组cpm值-自然释放组cpm值)/(最大释放组cpm值-自然释放组cpm值)×100％。
如图2A所示，肽段P1、P2和P3对NK92细胞杀伤靶细胞Hela的作用均有抑制效果；而无关肽浓度为10nM时，也未表现出抑制效果。
短肽在1-1×10-6nM的浓度范围内对NKG2D/MICA的相互作用抑制效应如图2B所示，呈剂量依赖关系。
2、短肽P1、P2、P3对NK92细胞杀伤靶细胞K526的作用以K526细胞(该细胞不表达MICA分子)作为靶细胞，采用与上述相同的方法测试短肽P1、P2、P3对NK92细胞杀伤靶细胞K526的作用，结果如图2C所示，结果表明短肽P1、P2、P3对NK92细胞杀伤靶细胞K526的作用无影响。
上述两个实验结果证实，短肽P1、P2、P3能够特异抑制NKG2D/MICA的相互作用。
3、本发明多肽的不同组合物的抑制效果以PBS配制P1、P2、P3、P2L、P3L以及P1+P2(P1∶P2的重量份数比为1∶2.6)、P1+P3(P1∶P3的重量份数比为1∶2.8)、P2+P3(P2∶P3的重量份数比为1∶1.1)、P1+P2L(P1∶P2L的重量份数比为1∶6)、P1+P3L(P1∶P3L的重量份数比为1∶6.5)、P2L+P3(P2L∶P3的重量份数比为2.1∶1)以及P1+P2+P3(P1∶P2∶P3的重量份数比为1∶2.6∶2.8)、P1+P2L+P3L(P1∶P2L∶P3L的重量份数比为1∶6∶6.5)组合物的溶液，其浓度均为20nM。
以上述溶液进行NK92细胞杀伤HeLa细胞的抑制效应实验，并与可溶性MICA分子(反应体系的终浓度为1nM)进行对比，结果分别如图3A、图3B和图3C所示。结果表明，每两个短肽的结合(P1+P2，P1+P3，P2+P3，反应体系的终浓度均为1nM)比单一短肽具有更强的抑制作用(图3A)，抑制效率从18％(P3)增长到32％(P2+P3)；当三个短肽联合作用时，抑制效率达到38％，已接近于可溶性的MICA分子(图3C)。同时，用P2L和P3L代替P2和P3时，不管单独或是联合作用时均表现出更强的抑制效应(图3B)，这说明较长的肽能封闭较多位点，具有更强的抑制效应；P1+P2L+P3L的抑制效应已达到可溶性MICA分子的同等水平(图3C)。
实施例3、本发明多肽对小鼠淋巴细胞杀伤靶细胞的抑制作用将P1+P2+P3组合物的PBS溶液(浓度为2mM，P1∶P2∶P3的重量份数比为1∶2.6∶2.8)以50μg多肽组合物/g体重的剂量注射C56BL/6小鼠(购自中国科学院上海实验动物中心)，4小时后，收获小鼠肝脏淋巴细胞，用这些细胞作效应细胞，以YAC-1细胞为靶细胞，进行细胞杀伤实验；并以同剂量的Px溶液处理的小鼠肝脏淋巴细胞为阴性对照，同体积的PBS溶液处理的小鼠肝脏淋巴细胞为空白对照，其结果如图4所示，短肽处理过的小鼠肝脏淋巴细胞对YAC-1细胞的杀伤作用比PBS组(Px组和PBS组经统计分析无差别)下降36.67％，表明小鼠肝脏淋巴细胞的杀伤作用可部分被短肽抑制。
小鼠的肝脏淋巴细胞包括NK细胞和T细胞，这些细胞均表达NKG2D分子，小鼠的NKG2D分子与人的NKG2D分子具有相似的氨基酸序列和结构；YAC-1细胞表面表达RAE-1分子，小鼠的RAE-1、H-60等分子行使与MICA分子类似的功能，即作为NKG2D的配体。本实施例的结果表明，本发明多肽也能够封闭小鼠的NKG2D分子。
实施例4、本发明短肽对NKG2D介导的自身免疫性损伤的阻断作用为了进一步证明本发明短肽对NKG2D介导的自身免疫性损伤的阻断作用，将本发明短肽应用于刀豆A(Con-A)诱导的小鼠肝炎模型，这是一种典型的T细胞介导的肝损伤模型。
将Con-A以15μg/g体重静脉注射C56BL/6小鼠后，小鼠就会发生肝损伤，6小时后血浆中谷丙转氨酶(ALT)上升到5433±692IU/ml；在注射Con-A的同时将P1+P2+P3组合物的PBS溶液(浓度为2mM，P1∶P2∶P3的重量份数比为1∶2.6∶2.8)以50μg多肽组合物/g体重的剂量注射(抑制组)，在注射Con-A的同时注射与抑制组多肽组合物溶液相同体积的PBS溶液作为空白对照组，6小时后抑制组小鼠的血浆中ALT为3195±461IU/L，抑制率为41.19％；在注射Con-A的同时注射无关肽Px 50μg/g体重，而无关肽Px则没有作用(阴性对照组)；结果如图5，表明本发明短肽能够特异性地减轻Con-A诱导的、由NKG2D介导的肝损伤。
权利要求
1.NKG2D受体的配体，为具有下述氨基酸序列之一的多肽1)MICA-P1DGSVQ；2)MICA-P2KDLRMTLAHIK；3)MICA-P3THYHAMHADCLQ；4)MICA-P2LKTWDRETRDLTGKDLRMTLAHIKDQ；5)MICA-P3LEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKS。
2.一种治疗自身免疫疾病和/或异体移植排斥的药物，其活性成分为下述多肽家族中的至少一个1)MICA-P1DGSVQ；2)MICA-P2KDLRMTLAHIK；3)MICA-P3THYHAMHADCLQ；4)MICA-P2LKTWDRETRDLTGKDLRMTLAHIKDQ；5)MICA-P3LEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKS。
3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于所述药物的活性成分为所述MICA-P1、所述MICA-P2和所述MICA-P3的组合物。
4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于所述组合物中所述MICA-P1、所述MICA-P2和所述MICA-P3的重量份数比为1∶2-3∶2-3。
5.根据权利要求2所述的药物，其特征在于所述药物的活性成分为所述MICA-P1、所述MICA-P2L和所述MICA-P3L的组合物。
6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于所述组合物中所述MICA-P1、所述MICA-P2L和所述MICA-P3L的重量份数比为1∶6-7∶6-7。
全文摘要
本发明公开了NKG2D受体的配体及其应用。本发明所提供的NKG2D受体的配体，为具有下述氨基酸序列之一的多肽1)MICA－P1DGSVQ；2)MICA－P2KDLRMTLAHIK；3)MICA－P3THYHAMHADCLQ；4)MICA－P2LKTWDRETRDLTGKDLRMTLAHIKDQ；5)MICA－P3LEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKS。本发明多肽分子量小，极少引起机体的免疫反应，且溶解性好、通透性强，易于到达作用部位发挥作用，能实现和NKG2D单抗及可溶性的全分子MICA相同的作用，同时还避免了其副作用；本发明多肽可采用现有常规方法制备得到，技术成熟，可广泛用于治疗自身免疫疾病和异体移植的排斥反应。
文档编号A61P37/02GK1634979SQ20041009605
公开日2005年7月6日 申请日期2004年11月26日 优先权日2004年11月26日
发明者田志刚, 刘文涛, 张斌, 魏海明, 郑晓东, 张建, 孙汭 申请人:中国科学技术大学