具有改善的免疫调节功能的经修饰的CpG寡聚脱氧核苷酸的制作方法

专利名称：具有改善的免疫调节功能的经修饰的CpG寡聚脱氧核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有改善的免疫调节功能的经修饰的CpG寡聚脱氧核苷酸(ODN)。特别地，本发明涉及修饰的CpG ODN，它是由连续的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷(dT)序列偶联到具有免疫调节功能的CpG ODN的3′-末端而制备出来的，它能导致脾细胞、巨噬细胞和外周单核细胞改善的免疫活性，因此，能被有效地用作预防和治疗乙型肝炎疫苗的佐剂，或用作抗癌剂。
背景技术：
脊椎动物能够抑制其基因组DNA序列中CpG二核苷酸的表达，或使表达的CpG二核苷酸的胞嘧啶残基甲基化(Krieg，Ann.Rev.Immunol.，2002，20，709；McClelland&Ivarie，Nucleic Acids Res.1982，23，78)。与此同时，微生物的CpG二核苷酸能以正常的速率被表达并且不被甲基化，因此利用脊椎动物和微生物之间表达CpG二核苷酸水平的差异就能检测脊椎动物中的微生物感染。
通过Toll样受体9(TLR9)，一种模式识别受体，微生物基因组DNA可以被树突细胞或表达TLR9的B细胞所识别，并且最终激活宿主细胞的先天免疫系统。先天免疫系统被赋予了去除癌细胞的机制，以及抗微生物或寄生虫感染的自我防御机制，因此通过适当修饰CpG ODN，有望开发出能诱免疫系统抗癌活性的抑癌免疫佐剂。
利用CpG ODN活化免疫系统的研究在过去几十年中已经取得了积极的进展。参照CpG二核苷酸为中心，CpG ODN在5′和3′末端都含有至少四个碱基，CpG ODN的免疫活性由其碱基序列表征。CpG ODN可被划分为2个组，K型和D型。K型CpG ODN刺激脊髓系细胞和B细胞从而导致它们增殖或分泌免疫球蛋白M或IL-6(Klinman等，Microbes Infect.，2002，897-901)。另一方面，D型CpG ODN活化单核细胞使之分化成树突细胞或者刺激天然杀伤细胞分泌IL-6(Klinman等，Eur.J.Immunol.，2002，32，2617-22；Gursel等，J.Leukoc.Biol.，71，813-20，2002)。另外，D型CpG ODN活化B220+树突细胞以产生IFN-α，而TLR9+B220+树突细胞释放IL-12以应答D型CpG ODN。这些结果表明有几个途径可以通过刺激特定免疫细胞增强CpG ODN的免疫活性(Hemmi等，J Immunol.，2003，170，3059-3064；Kerkman等，J.Immunol.，2003，170，4465-4474)。
已经有各种类型的CpG ODN被设计出来以改变病理状态，如感染，自身免疫疾病和癌症。其中，开发抗癌免疫治疗性CpG ODN的策略可以依赖于主要由CpGODN刺激的效应细胞。为了利用CpG ODN增加细胞介导的免疫性，以下两个方法被普遍使用。
第一个方法是通过活化天然或专门的树突细胞从而增加局部或系统免疫性。癌细胞下调其抗原递呈能力以逃避宿主细胞的免疫监视系统，而使宿主的细胞毒性T细胞不能识别它们从而能够在宿主细胞中存活下来。为解决该问题，已经开发出了一种方法，即用癌抗原中的强免疫原性肽和CpG ODN免疫佐剂一起免疫宿主。通过该方法，有着高抗原递呈活性的树突细胞能够吸收癌抗原肽，并且在被CpG ODN活化时导致活化细胞毒性T细胞。然后活化的细胞毒性T细胞能够有效地消灭癌细胞。有报道说，该方法能够杀死来自小鼠的RMA(Stern等，J.Immunol.，2002，168，6099-6105)。IFN-γ在这些免疫应答中起着重要的作用。尽管这不是通过树突细胞活化实现的，但其仍能够以与树突细胞通过呈递CpGODN 2006直接作用于B细胞同样的机理，激活抗癌免疫性并且增加能诱导B和T细胞相互作用的共刺激因子的表达(Jahrsdorfer等，J.Leukoc.Biol.，2001，69，81-88)。
另一个方法是通过活化天然杀伤细胞来增加先天免疫性。通过从外界引入癌抗原活化树突细胞可能会激活细胞毒性T细胞，但必须是在MHC I类分子表面存在癌抗原，从而在细胞毒性T细胞中产生细胞毒性。可是，在许多情况下，在癌细胞表面存在的癌抗原太少以至于不能从细胞毒性T细胞中产生细胞毒性，因此通过活化树突细胞来消除癌细胞的方法经常无效。为了克服这种局限，有人建议激活无论在癌细胞表面是否有癌抗原都能表现细胞毒性的天然杀伤细胞。另外，活化的天然杀伤细胞激活单核细胞或巨噬细胞，导致不依赖抗原的抗癌免疫系统的活化。据报道，在使用以上方法的小鼠肿瘤模型中，CpG ODN 1584给药可体内阻止NK敏感性B16.F1黑素瘤的转移，而注射CpG ODN 1826可在体内有效防止NK抗性的EL4淋巴瘤(Ballas等，J.Immunol.，2001，167，4878-4886)。另外，诱导出BALB/C小鼠中的C26结肠癌肿块后，直接把ODN 1826注射进发生肿瘤的损伤处，可显著缩减肿瘤的大小。该数据显示近肿瘤的CpG ODN单独治疗可产生强烈的CD8 T细胞应答和先天效应机制，似乎共同作用可以克服免疫系统对生长中的肿瘤的非应答性。(Heckelsmiller等，J.Immunol.，2002，169，3892-3899)。相反的，用CpG ODN单独治疗的方法难以在体内消除鼠38C13 B细胞淋巴瘤。可是，假如用CpG ODN处理38C13淋巴瘤抗原特异性单克隆抗体，活化的天然杀伤细胞能够通过运用抗体依赖的细胞毒性来高效地清除38C13淋巴瘤(Woodridge等，Blood，1997，89，2994-2998)。
与此同时，抗原或其等价物和CpG ODN作为免疫刺激剂一起使用能够诱导出抗癌的体液免疫。Tras tuzumab和rituximab是已知商品化的对HER-2蛋白特异性的单克隆抗体，HER-2蛋白分别过量表达于癌细胞和非Hodgkins B细胞淋巴瘤。最近，用CpG ODN加肿瘤抗原特异性抗体的联合治疗在临床前期证实了有效的肿瘤抗性，而且现在正进入临床试验期。(Jahrsdorfer等，Sem.Oncol.，2003，30.476-482)。
由于核苷酸序列在5’和3’末端处含CpG二核苷酸，CpG ODN具有强先天免疫活性。但由于CpG ODN本身是野生型的结构，与体内DNA分子的结构没有区别，它并不显示出任何细胞毒性。然而，CpG ODN中有一个缺陷，即由于其野生型结构，它在体内易于降解，从而导致免疫活性的半衰期降低。尽管增加每天CpGODN的剂量有可能克服这一缺陷，但是并不经济。据报道，在合成CpG ODN时，将作为DNA分子骨架的磷酸二酯键改变为硫代磷酸酯键，CpG ODN的免疫活性增大10至100倍(Sester等，J.Immnol.，2000，165，4165-4173)。可是，该方法带来的问题是由于骨架的改变导致对免疫细胞细胞毒性效果的改变以及CpG免疫活性的改变。因此，对于CpG ODN结构修饰来说，还不清楚该方法是否是最优化的。
CpG ODN显示出物种特异性，且相比于实验动物，还没有报道CpG ODN在人类中显示出更高的免疫活性。另外，由于CpG ODN的作用机制仍未知，因此很难针对人免疫细胞开发出有效的免疫治疗性CpG ODN。结果，罕有CpG ODN用于临床试验。这些局限使相对于现有CpG ODN有更高免疫刺激活性或更低副作用的CpGODN的开发成为必需。
本发明人设计了简单的方法来解决上述问题。即，通过将连续的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷(dT)序列偶联到CpG ODN的3′-末端来制备修饰的CpG ODN，从而改善脾细胞、巨噬细胞和外周单核细胞的免疫活性，因此，它能有效地用作预防和治疗乙型肝炎的疫苗佐剂，或用作抗癌剂。
发明概述因此，本发明的一个目的是提供一种具有改善的免疫调节功能的经修饰的CpG ODN。
本发明的另一个目的是提供包含经修饰的CpG ODN作为有效成分的疫苗佐剂或抗癌剂。
附图简述从本发明的以下说明并结合附图将使本发明的上述和其他目的及特征变得清楚，其中

图1显示本发明的CpG ODN在体外是否诱导BALB/C小鼠巨噬细胞(A)和脾细胞(B)增殖的检测结果；图2a显示本发明的CpG ODN在体外是否诱导Balb/c小鼠腹膜巨噬细胞的Th1型细胞因子mRNA表达的检测结果；图2b显示本发明的CpG ODN在体内是否诱导BALB/C腹膜巨噬细胞的Th1型细胞因子mRNA表达的检测结果；M标记物； 1未处理；20.6μg/ml KSK-1；30.6μg/ml KSK-2；40.6μg/ml KSK-7；50.6μg/ml KSK-12；60.6μg/ml KSK-13； 70.1μg/ml LPS图3a显示本发明的CpG ODN在体外是否诱导BALB/C小鼠脾细胞的Th1型细胞因子mRNA表达的检测结果；图3b显示本发明的CpG ODN在体内是否诱导BALB/C小鼠脾细胞的Th1型细胞因子mRNA表达的检测结果；M标记物； 10.6μg/ml CpG ODN；20.6μg/ml KSK-1；30.6μg/ml KSK-2；40.6μg/ml KSK-7；50.6μg/ml KSK-12；60.6μg/ml KSK-13； 70.1μg/ml LPS图4a显示本发明的CpG ODN是否诱导小鼠腹膜巨噬细胞的B7.2共刺激分子表达的检测结果；图4b显示本发明的CpG ODN是否诱导小鼠腹膜巨噬细胞中的MHC I类分子表达的检测结果；图5a显示本发明的CpG ODN是否诱导小鼠脾细胞中的B7.2共刺激分子表达的检测结果；图5b显示本发明的CpG ODN是否诱导小鼠脾细胞中的MHC I类分子表达的检测结果；图6a显示当用本发明的CpG ODN处理脾细胞而增加脾细胞中所含的天然杀伤细胞的细胞毒性时，易感于天然杀伤细胞的YAC-1细胞的溶胞水平；图6b显示当用本发明的CpG ODN处理人外周血单核细胞而增加人外周血单核细胞中所含的天然杀伤细胞的细胞毒性时，易感于天然杀伤细胞的K562细胞的溶胞水平；图7显示本发明的CpG ODN对长有B16黑素瘤的小鼠的肺转移抑制效果；图8显示各种CpG ODN在EL4转移化-C57BL/6小鼠上的相对存活延长效果的结果；以及图9显示由本发明的CpG ODN活化的天然杀伤细胞的细胞毒性的结果。
发明详述本发明提供一种显示免疫活性并含有CpG基序的修饰的CpG ODN，其中连续的dT序列偶联到ODN的3′-末端。
另外，本发明提供经修饰的CpG ODN作为免疫佐剂或抗癌剂的应用。
在下文中将详述本发明。
本发明涉及经修饰的CpG ODN，它由将连续的dT序列偶联到具有免疫调节功能的CpG ODN的3′一末端制备出来，其导致增强脾细胞、巨噬细胞和外周单核细胞的免疫活性，因此，它能有效地用作预防和治疗乙型肝炎的疫苗佐剂，或用作抗癌剂。
在下文中，术语“ODN”是指具有11至26个核苷酸长度的、能够激活免疫应答的寡聚脱氧核苷酸。特别的，术语“CpG ODN”是指具有CpG基序(5’-嘌呤嘌呤CpG嘧啶嘧啶-3’)的、显示出免疫调节功能的寡聚脱氧核苷酸。术语“连续的dT序列”是指通过磷酸二酯键连续偶联至少4个胸腺嘧啶脱氧核糖核酸到CpG ODN上的形式。
本发明中使用的CpG ODN是由MetaBion(德国)人工合成的，其中所有的磷酸二酯键由硫代磷酸酯键代替。合成的CpG ODN经过HPLC(高压液相层析)和NAP纯化过程以保持高纯度，然后以冷冻干燥状态供给。本发明中使用的CpG ODN核苷酸序列如表1所示。
表1
当由天然磷酸二酯键形成ODN骨架时，其在体内核酸酶的攻击下易于降解。为了使有抗癌免疫活性的CpG ODN能展现适当的免疫效果，必须是增加其剂量或改变其结构以避免被上述核酸酶攻击。本发明的CpG ODN具有由硫代磷酸酯键形成的骨架结构，因此能避免核酸酶的攻击，而延长其体内半衰期。可是，当进行CpG ODN体内给药时，可能在由硫代磷酸酯键本身造成的非特异免疫应答中产生安全性问题。因此本发明检验了硫代磷酸酯键的安全性，通过用氢氧化铝及其他诸如衍生于小鼠CHO细胞的gDE2t等抗原一起预处理，然后施用50μg具有硫代磷酸酯键的CpG ODN。结果显示在小鼠注射位置没有发现诸如肉芽肿和坏死等的异常，因此证明了具有硫代磷酸酯键的CpG ODN的安全性。
本发明的CpG ODN使骨髓系细胞活化而分泌炎症前的和Th1型的细胞因子，并且最终增加抗癌免疫性。通过使用诸如U-937，RAW264.7和THP-1等骨髓细胞系初步筛选出CpG ODN候选物。由于上述细胞系可以由本发明的CpG ODN靶向的原始细胞系产生不同的免疫应答，本发明的发明人检测了本发明的CpG ODN对新鲜鼠脾细胞和腹膜巨噬细胞产生的影响。结果显示CpG ODN显著增加了TNF-α，IL-6，IL-12和IFN-γmRNA的表达水平并且上调了巨噬细胞表面的MHC II类和B7.2蛋白的表达。这些结果显示，与在小鼠脾细胞和人外周血单核细胞中的天然杀伤细胞的对照活性相比，本发明的CpG ODN有更好的抗癌免疫活性。
因此，本发明的CpG ODN能被有效地用作疫苗佐剂，特别用于预防和治疗乙型肝炎。在此，优选分别以50至5000μg/kg体重范围内的剂量，以2至4周的间隔，用诱导免疫应答的抗原和CpG ODN给药两次或三次。另外，CpG ODN与抗原的比例优选在5∶1至4∶1的范围内。抗原可以单独免疫或者与作为药学可接受疫苗佐剂的氢氧化铝一起免疫，并且可以通过肌内注射或皮下注射给药。
以下实施例的给出仅为示例的目的，它们不应该解释为限制本发明的范围实施例实施例1制备3′-末端具有连续dT序列的CpG ODN本发明所用的CpG ODN是由MetaBion(德国)人工合成的，其中所有磷酸二酯键都由硫代磷酸酯键代替。供给我们的合成的CpG ODN处于冷冻干燥状态，它们经过HPLC(高压液相层析)和NAP纯化过程以保持高纯度。本发明中使用的CpG ODN核苷酸序列如表1所示。
实施例2CpG ODN对于小鼠脾细胞和巨噬细胞增殖的作用研究实施例1中合成的预计具有抗癌免疫活性的CpG ODN，和已经确认具有抗癌免疫活性的CpG ODN，按照如下实验，研究当它们分别应用于小鼠脾细胞和腹膜巨噬细胞时是否能够诱导细胞增殖。
把1.5ml的3％巯基乙酸盐注射进BALB/C小鼠的腹腔中。注射3天后，用添加了2％胎牛血清的磷酸缓冲液冲洗小鼠的腹腔，然后收集。进一步用Hanks氏缓冲盐溶液(HBSS)缓冲液冲洗两次后，在添加了10％胎牛血清的Dulbecco氏改进型Eagle氏培养基(DMEM)中制备小鼠腹腔巨噬细胞。
从BALB/C小鼠中分离脾脏，匀浆化成单细胞的个体，以2000rpm离心5分钟，弃上清液。细胞沉淀与0.84％氯化铵混合从而使红细胞溶胞，并用RPMI 1640洗涤两次以获得小鼠脾细胞。
如上制备的5×104个脾细胞和巨噬细胞分别用0.6μg/ml的KSK-1，KSK-2，KSK-7，KSK-12和KSK-13中的一种，和0.1μg/ml LPS处理24，48和72小时，用添加了[3H]胸腺嘧啶脱氧核苷的RPMI 1640培养6小时。在其增殖期间，活化的脾细胞可以从培养基中吸收[3H]胸腺嘧啶脱氧核苷。清除培养基后，用不含[3H]胸腺嘧啶脱氧核苷的相同的培养基洗涤脾细胞，利用放射性探测器测量被脾细胞吸收的[3H]胸腺嘧啶脱氧核苷的量。
图1的(A)中，为了诱导巨噬细胞增殖而处理CpG ODN 72小时。其中KSK-13显示出较其他CpG ODN，包括已知能诱导最高免疫活性的KSK-2更高的增殖力，并且与对照(未处理)或KSK-1、非CpG ODN相比较，KSK-13还显示出统计学上显著的诱导增殖的效果。
另外，如图1的(B)所示，本发明的CpG ODN诱导小鼠脾细胞增殖的效果显著大于其他CpG ODN对小鼠巨噬细胞的效果。为了诱导脾细胞的增殖，用CpG ODN处理脾细胞48小时。当CpG ODN处理72小时的时候，脾细胞的增殖水平降低。KSK-13诱导脾细胞增殖的效果显示为稍稍低于KSK-2诱导的平均值，KSK-13诱导在小鼠中已知是有效的，但是这种差异在统计学上不显著。
实施例3CpG ODN对于小鼠腹膜巨噬细胞的Th1型细胞因子mRNA表达的作用基于如实施例2所示的KSK-13能诱导小鼠腹膜巨噬细胞增殖的情况，本发明人研究了由KSK-13诱导的炎症前期或Th1型细胞因子释放的mRNA的表达。这些细胞因子可以有助于抗癌免疫防御。详细实验方法如下。
用实施例2中相同的方法制备小鼠腹膜巨噬细胞。用0.6μg/ml CpG ODN处理1×106个巨噬细胞12小时。用TRIzol试剂(生命技术)从处理过的细胞中分离总RNA，用吸光度确定其浓度。用MMLV反转录酶(Promega)以1μg总RNA为模板进行RT-PCR以合成cDNA。然后根据表2的反应条件，用合成的cDNA作为模板进行PCR，分别扩增TNF-α，IL-6，IL-12和IFN-γ。
在1％琼脂糖凝胶中分析PCR产物从而在每种反应条件下比较每种细胞因子mRNA的表达水平。
另外，β-肌动蛋白，一种组成型表达的蛋白质，用作对照以确认在上述PCR反应条件中是否获得恒定水平的PCR产物，且结果显示在每种反应条件中获得了相同水平的PCR产物，因此显示凝胶上所见的PCR产物的浓度差异不是由于cDNA制备中的流程错误所造成的。
如图2a所示，与高度活化小鼠免疫细胞的KSK-2相似，KSK-13增加了TNF-α，IL-6和IL-12的mRNA体外表达水平。体内差异更大，因此暗示KSK-13在体内条件中发挥了抗癌免疫活性(图2b)。
实施例4CpG ODN对于小鼠脾细胞的Th1型细胞因子mRNA表达的作用实施例2中发现KSK-13能够诱导小鼠脾细胞增殖。因此，本发明人研究了KSK-13诱导的细胞因子分泌的量，如下所示KSK-13在这些细胞中涉及抗癌免疫用实施例2中相同的方法制备小鼠脾细胞。用0.6μg/ml CpG ODN处理1×106个脾细胞12小时。用TRIzol试剂(生命技术)从处理过的细胞中分离总RNA，且以测量其吸光度来确定其浓度。用MMLV反转录酶(Promega)以1μg总RNA为模板进行RT-PCR以合成cDNA。然后根据表2的反应条件，用合成的cDNA作为模板进行PCR，分别扩增TNFα，IL-6，IL-12和IFN-γ。
在1％琼脂糖凝胶中分析PCR产物从而比较在每种反应条件下每种细胞因子mRNA的表达水平。
另外，β-肌动蛋白，一种组成型表达的蛋白质，用作对照以确认在上述PCR反应条件中是否获得恒定水平的PCR产物，而结果显示在每种反应条件中获得了相同水平的PCR产物，因此显示凝胶上所见的PCR产物的浓度差异不是由于cDNA制备中的流程错误所造成的。
如图3a所示，与高度活化小鼠免疫细胞的KSK-2相似，KSK-13增加了TNF-α，IL-6和IL-12 mRNA在脾细胞中的体外表达水平。体内差异更大，因此暗示KSK-13在体内条件中发挥了抗癌免疫活性(图3b)。
实施例5CpG ODN对于小鼠腹膜巨噬细胞的信号传递分子表达的作用为研究能在体外活化小鼠腹膜巨噬细胞的KSK-13是否也能在体内活化它们，进行以下实验。
将CpG ODN和3％巯基乙酸盐注射入BALB/C小鼠的腹腔。注射48小时后，用实施例2中相同的方法制备小鼠腹膜巨噬细胞。用FITC缀合的抗B7.2单克隆抗体或抗MHC II类单克隆抗体标记细胞，并用流式细胞仪分析。图4中，对照指的是未经处理的组；KSK-1，KSK-2，KSK-7，KSK-12和KSK-13分别以0.6μg/ml的浓度处理；而LPS以0.1μg/ml的浓度处理。
B7.2是辅助刺激分子，在巨噬细胞活化时其表达水平被提高。在非处理组中，腹膜巨噬细胞中B7.2分子的表达水平在标准差范围内是2.9％，而本发明KSK-13的是14.2％。这是一个与典型小鼠CpG ODN，KSK-2(即，16.3％)或人CpGODN，KSK-12(即，17.3％)的表达水平相似的活化率，并且与非CpG ODN，KSK-1(即，5.1％)有显著差异(图4a)。
MHC II类分子在巨噬细胞抗原递呈中起着关键的作用，其表达水平在巨噬细胞活化时与B7.2分子一起增加。在非处理组中，腹膜巨噬细胞的MHC II类分子表达水平在标准差范围内是26.5％，而本发明KSK-13的是33.7％。这是一个与典型小鼠CpG ODN，KSK-2(即，35.8％)或人CpG ODN，KSK-12(即，30.2％)的表达水平相似的活化率，并且与非CpG ODN，KSK-1(即，25.0％)有显著差异(图4b)。
根据这些结果，发现本发明的KSK-13能够在体内活化小鼠腹膜巨噬细胞。MHC II类和B7.2分子表达水平的增加显示腹膜巨噬细胞的抗原递呈能力被激活，其证明了KSK-13作为免疫增强剂的作用。
实施例6CpG ODN对于小鼠脾细胞的信号传递分子表达的作用为研究能在体外活化小鼠脾细胞的KSK-13是否也能在体内活化它们，进行以下实验。
将CpG ODN和3％巯基乙酸盐注射入BALB/C小鼠的腹腔。注射48小时后，用实施例2中相同的方法制备小鼠脾细胞。用FITC缀合的抗B7.2单克隆抗体或抗MHCII类单克隆抗体标记细胞，并用流式细胞仪分析。
在非处理组中，脾细胞中B7.2分子的表达水平在标准差范围内是2.8％，而本发明KSK-13的是8.6％。这低于典型小鼠CpG ODN，KSK-2(即，12.13％)的表达水平，但是高于人CpG ODN，KSK-12(即，6.85％)的表达水平。另外，它与非CpG ODN，KSK-1(即，3.31％)的表达水平有显著差异(图5a)。
另外在非处理组中，脾细胞的MHC II类分子表达水平在标准差范围内是15.5％，而本发明KSK-13的是22.8％。这与典型小鼠CpG ODN，KSK-2(即，23.6％)的表达水平相似，高于人CpG ODN，KSK-12(即，18.6％)的表达水平，并且与非CpG ODN，KSK-1(即，17.5％)有显著差异(图5b)。
这些结果暗示，本发明的KSK-13能够在体内活化小鼠脾细胞。MHC II类和B7.2分子表达水平的增加显示脾细胞中的B细胞抗原递呈能力被激活，因而显示了KSK-13作为有效的免疫刺激剂的作用。
实施例7CpG ODN对于带有乙型肝炎表面抗原的小鼠的免疫的作用为研究小鼠用乙型肝炎表面抗原免疫时，能活化小鼠脾细胞和腹膜巨噬细胞的KSK-13是否也能用作疫苗佐剂，进行了以下实验。
构建十三个实验组，每个组分配7个BALB/C小鼠。每个小鼠在腹部皮下注射2.5μg乙型肝炎表面抗原和如表3所述的疫苗佐剂。根据上述相同的方法，以1周的间隔重复免疫两次后，收集血液。将该血液用间接酶联免疫吸附法确定抗乙型肝炎表面抗原抗体的效价，结果如表3所示。
表3
在单独免疫乙型肝炎表面抗原的情况下效价为800，而当KSK-1，KSK-12和KSK-13分别和重组HBs抗原联合施用时，其增加16倍以上(12,800)。当与临床实验中广泛使用的明矾一起注射时，用作疫苗佐剂的KSK-13的效果高于KSK-12的4倍，并且高于KSK-2的64倍。另外，KSK-13的效果等于CFA(完全弗氏佐剂)的效果。这些结果暗示KSK-13能够有效地用作肽抗原的疫苗佐剂。
实施例8CpG ODN对于小鼠脾细胞的抗癌活性的影响为研究能活化小鼠脾细胞和腹膜巨噬细胞的KSK-13是否也能激活脾细胞中天然杀伤细胞清除癌细胞的能力，进行了以下实验。
将磷酸缓冲液(对照)，或10μg KSK-2，KSK-12或KSK-13注射入BALB/C小鼠的腹腔。注射18小时后，切下小鼠脾脏并由此制备脾细胞。在培养皿中培养脾细胞2小时以贴壁，游离细胞(非粘附细胞)转移入新的培养皿中。用1.0μg/ml同种CpG ODN处理细胞2小时，然后以图6所示的比例，将其与5×103个51Cr标记的YAC-1细胞共培养。取培养溶液的上清液，并用伽马射线计数器测量进入溶液中的51Cr的量。
图6a显示了在用KSK-13处理脾细胞而增加脾细胞中天然杀伤细胞的细胞毒性的时候，易感于天然杀伤细胞的YAC-1细胞的溶胞水平。分别以100∶1，50∶1，25∶1和12∶1的比例混合非粘附脾细胞(效应细胞，E)和YAC-1细胞(靶细胞，T)。在对照中，尽管效应细胞数量增加到高于靶细胞的12倍至100倍的范围，但是靶细胞的溶胞水平却不显著。相反，在KSK-13中，靶细胞的溶胞水平增加到效应细胞增加数量的3.5％左右。其低于典型小鼠CpG ODN，KSK-2的溶胞水平，但是高于人CpG ODN，KSK-12的溶胞水平。
图6b显示了易感于天然杀伤细胞的K562细胞的溶胞水平。具体而言，用本发明的CpG ODN处理人外周血单核细胞能显著增加人PBMC中天然杀伤细胞的细胞毒性。如下制备人PBMC。将血液从健康志愿者身上收集到涂有肝素的试管中，以1,200g离心10分钟。由此收获分界层，并转入新试管，然后用等体积的分离缓冲液(含0.5％胎牛血清和1mM EDTA的磷酸缓冲液)稀释。向新试管注入等体积的Histopaque-1077(Sigma)，之后在其上缓缓加入稀释剂。试管以1,200g离心30分钟。将分界层上的外周单核细胞收集入新试管，并重悬浮于分离缓冲液。悬浮液以210g离心5分钟，弃上清。重复该过程三次。
分别以50∶1，25∶1和12∶1的比例混合制备好的外周单核细胞(效应细胞，E)和K562细胞(靶细胞，T)并进行培养。在对照和KSK-13中，当它们以25∶1的比例混合培养的时候，用KSK-13处理过的外周血单核细胞中天然杀伤细胞的细胞毒性已经达到了65％，但是对照的仅有9％左右。50∶1和25∶1混合比例之间的细胞毒性几乎没有区别的原因是以25∶1的混合比例足以诱导细胞毒性。另外，图6a和图6b的结果暗示KSK-13在人体中可能比在小鼠中更有效。
实施例9抗癌活性1)抑制B16黑素瘤肺转移的效果在添加了10％高温灭活的FBS的RPMI 1640中培养所有的B16黑素瘤细胞。将2×105个B16黑素瘤细胞(0.2mL PBS)静脉注射入小鼠(7-8周龄的特定无病雌性C57BL/6)尾部外侧血管I.V.。为治疗B16转移的小鼠，向I.P.中施用各种CpG(10μg/小鼠)(治疗日第一，第三，第五，第七和第九日)(图7)。
2)通过抑制局部癌细胞转移而延长存活率的效果将EL4细胞(T细胞淋巴瘤，2×104)静脉注射入每组6个C57BL/6小鼠中以接种癌细胞。在注射后第1，3，5，7和9天，将KSK-13(10μg/小鼠)注射入BALB/C小鼠的腹腔，评估每个小鼠的存活率。KSK-13延长了所有6个小鼠的存活率，特别的，其中2个存活过60天。
另外，用增加数目的小鼠仅使用KSK-13 CpG ODN的实验中重复证明了KSK-13延长存活率的效果。(图8)3)CpG ODN活化的天然杀伤细胞的细胞毒性通过阴性选择从人外周血单核细胞中去除单核细胞，在以下实验中仅仅使用B、T和天然杀伤细胞。从小鼠脾细胞中分离除了巨噬细胞之外的非粘附细胞，并用作效应细胞。K562细胞系作为专一作用于天然杀伤细胞的靶细胞，用于测量人NK(天然杀伤)细胞的细胞毒性，而YAC-1细胞系用于测量鼠NK细胞的细胞毒性。利用以上效应和靶细胞，天然杀伤细胞的细胞毒性用51Cr释放法进行测量(图9)。
实施例10毒性测试用0.5mg KSK-13肌肉注射6个ICR小鼠的臀肌或三角肌。以2周的间隔用KSK-13注射两个小鼠两次。初步注射一个月后，其中之一有KSK-13以2周的间隔进一步再注射三次。
注射之后，观察小鼠6个月，观察其临床征候，进行诸如体重和体温的体检，验血和验尿。结果显示所有实验动物都存活下来了，且没有显著的异常临床征兆、体重改变或其他毒性效应。
制备实施例1疫苗的制备将1mg乙型肝炎表面抗原，10mg本发明dT标记的寡聚脱氧核苷酸，1mg氢氧化铝，0.01w/v％硫柳汞，用作缓冲剂的适当剂量的磷酸二氢钾和磷酸氢钠以及适当剂量的氯化钠混合于蒸馏水中，用盐酸调节混合物的pH值，从而制成疫苗。
经过描述说明本发明的具体实例，在不背离本发明精神的情况下其中显然可进行各种改变和修改，而不仅仅局限于附加的权利要求中。
序列表<110>Yonsei University<120>具有改善的免疫调节功能的经修饰的CpG寡聚脱氧核苷酸<160>5<170>Kopatent In 1.71<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的无免疫刺激作用的非CpG寡核苷酸<400>1tccaggactt ctctcaggtt20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>对小鼠尤其有效的合成的具有硫代磷酸酯骨架的CpG寡核苷酸<400>2tccatgacgt tcctgacgtt 20<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>在KSK-12的3’末端有6个鸟嘌呤且具有硫代磷酸酯骨架的合成的CpG寡核苷酸<400>3tcgtcgtttt gtcgttttgt cgttgggggg30<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>对小鼠尤其有效的合成的具有硫代磷酸酯骨架的CpG寡核苷酸
<400>4tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的具有硫代磷酸酯骨架的CpG寡核苷酸<400>5tcgtcgtttt cgtcgtcgtt tt2权利要求
1.一种显示出免疫活性并具有CpG基序的硫代磷酸酯或磷酸二酯或结构修饰的寡聚脱氧核苷酸(ODN)，其特征在于在ODN的3′-末端偶联连续的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷(dT)序列。
2.权利要求1的寡聚(脱氧)核苷酸，其中连续的dT序列具有4至15个核苷酸的长度。
3.权利要求1的寡聚(脱氧)核苷酸，其中ODN改善脾细胞、巨噬细胞或外周血单核细胞的免疫活性。
4.权利要求1至3之任一项的寡聚(脱氧)核苷酸，其中ODN具有SEQ ID No5的核苷酸序列。
5.一种疫苗佐剂，包含权利要求1的寡聚(脱氧)核苷酸作为有效成份。
6.权利要求5的疫苗佐剂，其进一步包含其他抗原。
7.权利要求5或6的疫苗佐剂，其用于预防或治疗乙型肝炎。
8.一种抗癌剂，包含权利要求1的寡聚(脱氧)核苷酸作为有效成份。
全文摘要
本发明涉及一种修饰的CpG寡聚脱氧核苷酸(ODN)，其由连续的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷(dT)序列偶联到具有免疫调节功能的CpG ODN的3′－末端而制备出来，用以增强脾细胞、巨噬细胞和外周单核细胞的免疫活性，因此，能有效地用作预防和治疗乙型肝炎的疫苗佐剂，或用作抗癌剂。由于在其3′－末端具有连续dT序列的硫代磷酸酯CpG ODN显示出诱导Th－1免疫应答的高度活性并且不产生体内毒性，从而保证了它的安全性，能够有效地用作疫苗佐剂。
文档编号A61P1/00GK1637013SQ20041009591
公开日2005年7月13日 申请日期2004年8月13日 优先权日2004年1月8日
发明者金寿起, 朴升圭, 朴守贞, 曹铉哲 申请人:延世大学校