一种AAV6型腺相关病毒体外高效感染T细胞的方法与流程

本发明属于基因工程和细胞工程技术领域，具体涉及一种aav6型腺相关病毒体外高效感染t细胞的方法。

背景技术：

t细胞，是一种淋巴细胞，来源于骨髓，成熟于胸腺，成熟的t细胞经血流分布至外周免疫器官的胸腺依赖区定居，在细胞免疫及免疫调节中扮演重要角色。随着细胞免疫治疗的不断深入，t细胞的基因工程化改造显得尤为重要。

t细胞的基因工程化改造是指将具有治疗意义的基因高效导入t细胞，使t细胞进行相关的表达后发挥作用。以应用修饰后的t细胞进行肿瘤治疗为例，通过基因工程技术将肿瘤靶标蛋白单抗表达于t细胞表面，借助抗原抗体作用，引导t细胞杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤目的。如何将治疗基因有效地导入t细胞，提高t细胞转染率成为近年来的研究热点。

病毒具备高效转导宿主细胞的能力，因而利用基因工程制备的重组病毒载体在针对多种疾病的基因治疗中，成为携带外源目的基因在靶向组织中高效表达的重要手段。目前用于基因治疗的重组病毒载体主要包括腺病毒(adenovirus，ad)、反转录病毒(retrovirus，rv)、慢病毒(lentivirus，lv)、腺相关病毒(adeno-associatedvirus，aav)及单纯疱疹病毒(herpessimplex-virus，hsv)等。然而，t细胞的转染操作异常困难，dna表达质粒几乎转染不进去，即便是病毒介导的基因转染操作，也存在多重困难，具体如下：1)使用腺病毒进行转染：ad5型腺病毒以病毒颗粒表面的fiber区与细胞上的car受体结合以感染细胞，但是t细胞表面缺乏car受体，故ad5型腺病毒对t细胞几乎没有侵染能力。虽然有些研究者对ad5型腺病毒fiber区实现了嵌合改造，但是对t细胞的感染效果都没有实质性的改观。另外，腺病毒滴度不会太高，且免疫原性大，体外培养的t细胞本身十分敏感、脆弱，腺病毒感染对t细胞状态影响会非常大；加之，t细胞是悬浮细胞，进一步增加了病毒有效感染的难度。2)使用慢病毒、逆转录病毒进行转染：①非激活的t细胞无增殖能力，②t细胞表面受体不稳定，③t细胞内部存在阻碍反转录的机制，④逆转录病毒需要t细胞处于分裂状态，但会导致t细胞进入晚期分化阶段，从而影响后续细胞治疗效果。

aav因其无致病性、低免疫反应性、感染宿主谱广泛、转基因表达长效等优势，成为在基因治疗成为应用前景最好的载体之一。但aav基因组存在包装容量有限、对多数组织转导率不尽如人意等主要缺点，成为困扰aav在临床应用中的瓶颈问题。目前研究热点主要集中于应用现代分子生物学的手段对aav进行改良，如公开号为cn102618507b的中国专利申请“增加腺相关病毒靶向转导效率的重组腺相关病毒及其应用”，所述的重组腺相关病毒含有经过改造的腺相关病毒vp2蛋白以及腺相关病毒原始的vp1蛋白、vp2蛋白和vp3蛋白，与传统病毒比较具有更高的转导率和靶向性。然而，针对aav体外高效感染t细胞的研究相对较少，因此，提供一种aav体外高效感染t细胞的方法，成为现阶段迫切需要解决的问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种aav6型腺相关病毒体外高效感染t细胞的方法。

本发明的另外一个目的在于公布aav6病毒在体外实验中的一种新用途。

具体地，所述的aav6型腺相关病毒体外高效感染t细胞的方法，包括以下步骤：

(1)病毒包装：先铺好hek293t细胞，待细胞密度达80～90％时换成无血清dmem培养基，将提前按一定比例混合好的a、b溶液加入到培养基中，继续培养72h后收集病毒，将病毒液进行纯化、浓缩，并检测病毒滴度和纯度，即得病毒液；

(2)病毒感染：将t细胞铺于96孔板中，cd3/cd28进行刺激以激活t细胞，待激活后的t细胞密度达70～80％时，加入步骤(1)制得的病毒液，病毒的感染复数moi为10e6，24h后免疫荧光法结合流式细胞术检测细胞的感染效率。

其中，所述的无血清dmem培养基为：dmem培养基+1％hepes+1％p/s。

具体地，所述的1％p/s是指1％青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin)

所述步骤(1)中的a、b溶液混合液与培养基的体积比为(0.5～1.5):(8～10)。

优选地，a、b溶液混合液与培养基的体积比为1:9。

具体地，所述的a、b溶液混合液的制备包括以下步骤：

(1)取dmem5ml与助感染试剂vgf-001700μl混合，得溶液a；

(2)取dmem5ml与phelper质粒96μg、prc质粒60μg、携带gfp的aav质粒(pav-mir-gfp)53.8μg混合，得溶液b；

(3)将溶液a加到溶液b中，混匀，静置30min，即得。

本发明采用碘克沙醇密度梯度离心法对所述病毒液进行纯化，具体为：

1)按一定的比例配置不同浓度的碘克沙醇，分别为15％、25％、40％、60％。

2)取一个超离管，逐层加入不同浓度的碘克沙醇。先加入60％层4.2ml，再加入40％层5ml，其次加入25％层6ml，最后加入15％层9ml。

3)将处理好的病毒液加入到最上层。

4)超高速离心，48000rpm2小时30分钟。离心前应将对应的超离管配平，误差控制在0.1g以内。

本发明采用超滤法对纯化后的病毒液进行浓缩，具体为：

1)离心完毕后，将超滤管底用针头刺破，弃掉滴下的前2ml，收集第3～8ml。

2)将收集的6ml液体用pbs+pf68稀释至体积15ml，然后用0.2μl的滤膜过滤。

3)将过滤后的液体置于15ml的超滤管中，4000rpm离心55min。如果体积还不到理想体积，需要将离下去的液体弃掉，向超滤管中加入pbs+pf68稀释，再次离心。时间长短可以根据溶液的粘稠程度而定。

4)将超滤管中剩下的液体反复吹打后吸至病毒储存管中，分别取10μl病毒液进行滴度和纯度检测，采用q-pcr法测定病毒滴度，采用银染法检测纯度。

采用上述方法包装得到的aav6腺相关病毒质量高，具有高的病毒滴度，经q-pcr法测得的病毒滴度为10e13vg/ml，经银染法检测显示，所得的aav6腺相关病毒纯度高。

进一步地，采用上述方法包装得到的aav6腺相关病毒感染t细胞，并采用免疫荧光法结合流式细胞术检测病毒的感染效率，结果显示，本发明aav6病毒体外感染人t细胞，实现了对人t细胞的高效感染，感染效率可达80～90％，甚至更高，这是其他基因转染方法无法比拟的，取得了意料不到的技术效果。

在本发明aav6腺相关病毒包装过程中使用的助感染试剂vgf-001和phelper质粒、prc质粒、携带gfp的aav质粒(pav-mir-gfp)均为山东维真生物有限公司自主研发的产品，其中vgf-001(vigenefection，质粒转染试剂)是一种多聚阳离子聚合物，其主要成分是改良后的多聚赖氨酸，具有较高的阳离子电荷密度使得聚合物网络在任何ph下都能充当有效的“质子海绵”(protonsponge)体。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，经进一步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低。

所述的phelper质粒、prc质粒、携带gfp的aav质粒(pav-mir-gfp)图谱见图1所示。

相关数据显示，以市售的pei转染试剂(聚乙烯亚胺)替代本发明提供的vgf-001，对aav6腺相关病毒包装，并将获得的病毒经一步转染t细胞，结果显示，采用q-pcr法测得对比例1获得的腺相关病毒滴度为10e9vg/ml，远低于本发明的10e13vg/ml；疫荧光法结合流式细胞术检测细胞的感染效率为40～60％，远低于本发明的80～90％。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

本发明aav6病毒体外感染人t细胞，实现了对人t细胞的高效感染，感染效率可达80～90％，甚至更高，这是其他基因转染方法无法比拟的，为t细胞体外研究的学者们解决了一大难题，也为细胞治疗的临床研究打下坚实的基础。

附图说明

图1为phelper质粒、prc质粒、携带gfp的aav质粒的图谱。

图2为银染法检测aav6病毒纯度的效果图，lane1是蛋白marker，lane2、3是纯化后的aav6病毒样品。

图3为aav6病毒感染t细胞后24h，10倍荧光显微镜下拍摄的白光图。

图4为aav6病毒感染t细胞后24h，10倍荧光显微镜下拍摄的荧光图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。

实施例1aav6腺相关病毒包装

(1)准备hek293t细胞：

提前一天铺hek293t细胞，细胞密度达80～90％，用量：10个10cmdish的细胞量。

(2)包装病毒

①提前1～3h给细胞换液，换成无血清的dmem培养基(含1％hepes和1％p/s)；

②按照如下比例配置好溶液a和溶液b：

a液：dmem5ml、助感染试剂vgf-001700μl；

b液：dmem5ml、phelper质粒96ug、prc质粒60μg、pav-mir-gfp53.8μg；

放置5min后，将a液加到b液中，混匀，静置30min。

③将上述放置后的液体平均加到10盘hek293t细胞中。

④待细胞培养72h后收集病毒。

(3)收毒

①将细胞吹起，收到50ml管中，3500rpm离心7min。

②将培养基上清转移到新管中，用pge8000沉淀过夜，第二天离心3500g、30min，去掉上清，用2mlpbs+0.001％pf68重悬。

③将沉淀用pbs+0.001％pf684ml重悬，冻融一次后加入5mnacl1ml，超声至不粘稠，13000rpm离心10min，收集上清。

④将③中收集的上清与②的重悬液混合。

(4)碘克沙醇密度梯度离心法进行病毒纯化

①按一定的比例配置不同浓度的碘克沙醇，分别为15％、25％、40％、60％。

②取一个超离管，逐层加入不同浓度的碘克沙醇。先加入60％层4.2ml，再加入40％层5ml，其次加入25％层6ml，最后加入15％层9ml。

③将处理好的病毒液加入到最上层。

④超高速离心，48000rpm2h30min。离心前应将对应的超离管配平，误差控制在0.1g以内。

(5)病毒浓缩

①离心完毕后，将超滤管底用针头刺破，弃掉滴下的前2ml，收集第3～8ml。

②将收集的6ml液体用pbs+pf68稀释至体积15ml，然后用0.2μl的滤膜过滤。

③将过滤后的液体置于15ml的超滤管中，4000rpm离心55min。如果体积还不到理想体积，需要将离下去的液体弃掉，向超滤管中加入pbs+pf68稀释，再次离心。时间长短可以根据溶液的粘稠程度而定。

④将超滤管中剩下的液体反复吹打后吸至病毒储存管中，分别取10μl病毒液进行滴度和纯度检测。

对比例1aav6腺相关病毒包装

对比例1aav6腺相关病毒包装操作步骤与实施例1基本相同，区别在于，所述步骤2)包装病毒中的助感染试剂vgf-001替换为市售的pei转染试剂(聚乙烯亚胺)。

实施例2q-pcr法测定腺相关病毒滴度

分别采用q-pcr法测定实施例1和对比例1获得的aav6腺相关病毒的滴度。

1.原理：

以sybrgreeni为dna结合染料的荧光定量pcr法(qpcr)。该方法用腺病毒基因组特异性引物进行实时定量pcr。在定量曲线的线性范围内，ct值与已知拷贝数质粒的ct值的比值即为病毒基因组的初始拷贝数。

2.步骤：

(1)纯化腺相关病毒基因组dna：腺相关病毒颗粒基因组dna外面包被有衣壳蛋白，使用蛋白酶k消化酶解病毒衣壳，具体为：取5ulaav6病毒液加入1ul蛋白酶k(5ug/ul)、4ul超纯水，混匀，37℃孵育30min，然后加热95℃20min使酶失活，3000g离心10min，取上清冻存。

(2)qpcr

①质粒标准品的拷贝数，并将超纯水作为阴性对照。

②配制pcr反应体系，每个样品20ul体系

(3)进行pcr反应

(4)病毒颗粒数

病毒颗粒数(个/ml)＝与标准品相对值×1000。

3.结果：

采用q-pcr法测得实施例1获得的腺相关病毒滴度为10e13vg/ml。

采用q-pcr法测得对比例1获得的腺相关病毒滴度为10e9vg/ml。

实施例3银染法检测腺相关病毒纯度

1.步骤：

①固定：

电泳结束后，取凝胶放入约100ml固定液中，在摇床上室温摇动20分钟，摇动速度为60～70rpm。过夜可以进一步降低背景。

固定液的配制：依次加入50ml乙醇、10ml乙酸和40mlmilli-q级纯水或双蒸水，混匀后即成100ml固定液。

②30％乙醇洗涤：

弃固定液，加入50ml30％乙醇，在摇床上室温摇动5分钟一次，洗两次，摇动速度为60-70rpm。30％乙醇的配制：35mlmilli-q级纯水或双蒸水中加入15ml乙醇，混匀后即成50ml30％乙醇。

③水洗涤：

弃30％乙醇，加入30mlmilli-q级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动5分钟一次，洗两次，摇动速度为60-70rpm。

④增敏：

弃水，加入50ml银染增敏液(1x)，在摇床上室温摇动2分钟，摇动速度为60～70rpm。

银染增敏液(1x)的配制：49.5mlmilli-q级纯水或双蒸水中加入0.5ml银染增敏液(100x)，混匀后即为银染增敏液(1x)。银染增敏液(1x)配制后需在2小时内使用。

⑤水洗涤(共2次)：

弃原有溶液，加入30mlmilli-q级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1分钟，摇动速度为60～70rpm。弃水，再加入30mlmilli-q级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1分钟，摇动速度为60～70rpm。

⑥银染：

弃水，加入50ml银溶液(1x)，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60～70rpm。

银溶液(1x)的配制：49.5mlmilli-q级纯水或双蒸水中加入0.5ml银溶液(100x)，混匀后即为银溶液(1x)。银溶液(1x)配制后需在2小时内使用。

⑦水洗涤：

弃原有溶液，加入30mlmilli-q级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1～1.5分钟，摇动速度为60～70rpm。注意：水洗涤的时间不能超过1.5分钟。

⑧显色：

弃水，加入50ml银染显色液，在摇床上室温摇动3-10分钟，直至出现比较理想的预期蛋白条带，摇动速度为60-70rpm。银染显色液的配制：40mlmilli-q级纯水或双蒸水中加入10ml银染基本显色液(5x),再加入0.025ml银染显色加速液(2000x)，混匀后即为银染显色液。银染显色液配制后需在20分钟内使用。

⑨终止：

弃银染显色液，加入25ml银染终止液(1x)，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。终止时有气体产生属正常现象，产生的气体为二氧化碳。

银染终止液(1x)的配制：23.75mlmilli-q级纯水或双蒸水中加入1.25ml银染终止液(20x)，混匀后即为银染终止液(1x)。银染终止液(1x)配制后宜当天使用。

⑩水洗涤：

弃银染终止液，加入30mlmilli-q级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动2-5分钟，摇动速度为60-70rpm。

保存：

可在milli-q级纯水或双蒸水中保存。或采用适当的方式制备成干胶。

2.结果：

银染法检测实施例1获得的aav6腺相关病毒的纯度结果见图2。

实施例4aav6腺相关病毒感染t细胞

分别采用实施例1和对比例1获得的aav6腺相关病毒感染t细胞。

1.步骤：

①准备t细胞

将t细胞铺于96孔板中，cd3/cd28进行刺激以激活t细胞。

②aa6病毒感染激活的t细胞

待激活后的t细胞密度达70～80％时，加入10ul实施例1制得的包装aav6腺相关病毒，moi为10e6。

③观察感染效率

aav6腺相关病毒感染t细胞后24h，采用免疫荧光法结合流式细胞术检测细胞的感染效率，具体步骤如下：

1)取感染后24h后的t细胞(约2-3×106个)，3500rmp离心5min；

2)弃去上清，加入800μl含4％bsa的pbs重悬细胞，3500rmp离心5min；

3)重复步骤2两次；

4)弃去上清，加入200μl含4％bsa的pbs重悬细胞，加入1μlprotein-l(1μg/μl储存)，4℃避光孵育45min；

5)孵育结束后，3500rmp离心5min；

6)重复步骤1.23次；

7)弃去上清，加入200μl含4％bsa的pbs重悬细胞，加入0.5μlfitc(终比例1：400)室温避光孵育1h；

8)孵育结束后，3500rmp离心5min；

9)重复步骤1.22次；

10)加入600μlpbs重悬细胞，于显微镜观察并行流式检测。

2.结果：

实施例1获得的aav6腺相关病毒感染t细胞24h后，10倍荧光显微镜下拍摄的白光图见图3，荧光图见图4，流式细胞检测结果显示，aav6病毒体外感染人t细胞的感染效率可达80～90％。

采用对比例1获得的aav6病毒感染t细胞后24h，流式细胞检测结果显示，aav6病毒体外感染人t细胞的感染效率为40～60％。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。