腺相关病毒载体的高效生产的制作方法

腺相关病毒载体的高效生产的制作方法
【专利摘要】本发明涉及腺相关病毒(AVV)载体，用于生产AAV载体的生产细胞系以及生产该载体的方法。具体地，本发明涉及适合于提高所述载体效价的生产细胞系和使用所述生产细胞系生产AAV载体的方法。
【专利说明】
腺相关病毒载体的高效生产
技术领域
[0001] 本发明涉及腺相关病毒(AVV)载体，用于生产AAV载体的生产细胞系，以及生产该 载体的方法。具体地，本发明涉及适合于提高该载体效价的生产细胞系和使用该生产细胞 系生产AAV载体的方法。
【背景技术】
[0002] 由于野生型AAV从未与任何人类疾病相关，因此腺相关病毒(AAV)载体具有极好的 安全性。因此，AAV是常用的、成功的用于基因治疗的载体。AAV载体已经在临床试验中被广 泛研究用于不同的-病症，包括血友病B，心脏病和先天性失明。另外，欧盟许可的第一种基 因治疗药物，阿利泼金(Glybera)，其用于家族性脂蛋白脂肪酶缺陷(LPLD)的治疗，是基于 AAV载体，这例证了 AAV载体在基因治疗中的潜能。
[0003] 尽管AAV载体设计已取得了许多进展，但是例如已有的免疫反应等障碍使得高效 价AAV的给药成为了必要，以及在很多情况下，与免疫抑制剂联合给药以达到临床治疗效 果。这对于AAV生产提出了重大挑战，并且在AAV载体临床使用中具有相当大的安全性隐患。
[0004] 生产AAV载体最常用的方法是通过AAV质粒和来自于另一病毒例如腺病毒的辅助 质粒的瞬时共转染。为支持临床开发，最近在AAV大规模生产和粗提纯中取得了重要的进 步。然而，生产高效价AAV仍然是巨大的挑战，为达到期望的剂量，需要病人接受载体的重复 给药。例如，对于阿利泼金，需要通过40或60次的重复注射来达到的3x10 12vg/kg剂量的载体 给药。
[0005] 此外，作为现有纯化方法的结果，AAV产物通常包含高水平的蛋白质聚集体或者不 完全包装的缺失载体DNA的空衣壳。终产物中的空衣壳经常可高达完整颗粒水平的40倍。这 些杂质可在病人体内引发有害的免疫反应。例如，最近的研究表明小鼠和人类的细胞免疫 反应被指向AAV2衣壳上的抗原表位，并且在大剂量的载体给药之后，空衣壳的存在抑制了 体内肝细胞转导。空衣壳触发有害免疫原性的潜在不良效果影响了产物的安全性和有效 性。
[0006] 通过已知方法来去除没有治疗功能的空衣壳是困难的，由于其与包含载体DNA的 完整颗粒在颗粒大小、亲和力和蛋白组成上先天相似。已经有持续不断的努力从包含基因 组的完整颗粒中分离空AAV衣壳。通过不同浓度CHC1 3分离已经获取了不含空颗粒的AAV2。 然而，在大规模生产和药品生产质量管理中使用这种方法可能有问题。已经有报道离子交 换色谱法用于AAV2、4、5和8中空衣壳的分离。然而，残留在终产物中的空衣壳含量从20%波 动上至30倍。
[0007] 因此，需要发展新的AAV载体生产方法，该方法降低或消除终产物中空衣壳的出 现。这样将提高AAV产物的安全性和有效性。减少空颗粒也将克服高效价生产中的障碍。
[0008] 发明概述
[0009] 在AAV载体生产中，促进两种类型颗粒形成的细胞和病毒因子大部分仍然是未知 的。通常，病毒可以通过以下方式来将其基因组装配到蛋白衣壳内：结构蛋白与病毒基因组 结合或者将病毒基因组插入到预装配的衣壳内。。已知的是AAV将其基因组插入到预装配的 衣壳内。已被报道的是，特定的氨基酸相互作用对于病毒DNA有效插入是必需的，并且氨基 酸单点突变和AAV衣壳蛋白的总构象变化已被表明导致了 AAV基因组装配失败。对于细胞蛋 白参与AAV装配的研究也非常有限，表明总生产细胞蛋白和DNA解旋酶在AAV装配中是必需 的。然而，AAV DNA插入衣壳内的实际机制是未知的。
[0010]为了更好的理解细胞蛋白在AAV装配中的作用，并最终提高AAV产物的安全性和质 量，本发明人分析了AAV载体中共生产和共纯化的宿主细胞蛋白。特别是，本发明人对3种 AAV血清型AAV2、AAV5和AAV8的空衣壳和完整载体之间的蛋白组成进行了首次系统的分析 和比较。尽管不同的血清型之间具有一些显著的差异，本发明人已经论证了三种AAV血清型 之间的固有相似性。重要的是，本发明人首次论证了空衣壳和完整载体之间具有显著的差 异。最终，本发明人已经确定了若干与AAV产物具有内在关联性的宿主细胞蛋白。特别是，本 发明人论证了在AAV产物中发现有宿主细胞蛋白YB1、NPM1和NCL，并且调节这些宿主细胞蛋 白的表达可影响AAV载体颗粒的生产。
[0011] 因此，本发明提供了一种转基因生产细胞系，其中与对照生产细胞系相比较，YB1、 NPM1和NCL中的至少一种的表达被调节。通常，与对照生产细胞系相比较，在本发明的生产 细胞系中（i)NPM1 和NCL; (i i) YB1 和NPM1; (i i i)YB1 和NCL;或（iv) YB1、NPM1 和NCL;的表达被 调节。
[0012] 在优选实施方案中，与对照生产细胞系相比较，YB1、NPM1和NCL中的至少一种表达 下调，其中可以使用CRISPR基因组编辑、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA (shRNA)、微RNA或反义RNA来减少YB1、NPM1和/或NCL的表达。通常，使用shRNA来减少YB1、 NPM1和/或NCL的表达，并且优选地：使用包含核苷酸序列SEQ ID N0s:14至18(Y1至Y5)的 shRNA来减少ΥΒ1的表达；使用包含核苷酸序列SEQ ID N0s:4至8(ΝΡΜ-Ν6至ΝΡΜ-Ν10)的 shRNA来减少ΝΡΜ1的表达；使用包含核苷酸序列SEQ ID N0s:9至13(NCL-N1至NCL-N5)的 shRNA来减少NCL的表达。可以使用CRISPR基因组编辑来减少YB1、NPM1和/或NCL的表达。在 一个实施方案中，使用选自SEQ ID N0s:33和34;SEQ ID N0s:35和36;SEQ ID N0s:37和38; 和/或SEQ ID N0s:39和40的gRNA对来减少YB1的表达。
[0013] 与对照生产细胞系相比较，在本发明的生产细胞系中，此处表2所列的一种或多种 附加基因和/或蛋白的表达也可以被调节。
[0014] 在优选实施方案中，本发明的转基因生产细胞系为人胚胎肾293T细胞系。
[0015] 本发明还提供了生产腺相关病毒(AAV)载体的方法，包括在生产细胞系中培养腺 相关病毒，其中YB1、NPM1和NCL中的至少一种的表达被调节。
[0016] 通常，根据本发明的方法，在所述生产细胞系中（i )NPM1和NCL; (ii)YB1和NPM1; (i i i) YB 1和NCL;或（i v) YB 1、NPM1和NCL;的表达被调节。优选地，调节YB 1、NPM 1和/或NCL的 表达是减少YB1、NPM1和/或NCL的表达，其中使用CRISPR基因组编辑、双链RNA(dsRNA)、小干 扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA或反义RNA来减少YB1、NPM1和/或NCL的表达。通 常，使用shRNA来减少YB1、NPM1和/或NCL的表达，并且优选地:使用包含核苷酸序列SEQ ID N0s:14至18(Y1至Y5)的shRNA来减少YB1的表达；使用包含核苷酸序列SEQ ID N0s:4至8 (NPM-N6至NPM-N10)的shRNA来减少NPM1的表达;和/或使用包含核苷酸序列SEQ ID N0s:9 至13(NCL-N1至NCL-N5)的shRNA来减少NCL的表达。可使用CRISPR基因组编辑来减少YB1、 NPM1和/或NCL的表达。在一个实施方案中，使用选自SEQ ID N0s:33和34;SEQ ID N0s:35和 36;SEQ ID N0s:37和38;和/或SEQ ID N0s:39和40的gRNA对来降低YB1 的表达。
[0017] 在本发明的方法使用的生产细胞系中，表2所列的一种或多种附加基因和/或蛋白 的表达也可被调节。
[0018] 与对照方法生产的AAV载体效价相比较，本发明的方法可将AAV载体效价提高至少 2倍，和/或与对照方法生产的完整：空AAV载体的比率相比较，本发明的方法可将完整：空 AAV载体的比率提高至少20%。
[0019] 在优选实施方案中，本发明方法使用的转基因生产细胞系为人胚胎肾293T细胞 系。
[0020] 优选地，本发明的方法生产AAV2、AAV5和/或AAV8血清型AAV载体。
[0021] 本发明进一步提供了由本发明的生产细胞系和/或本发明的方法得到的腺相关病 毒(AAV)载体的种群。优选地，与对照方法生产的种群内的完整:空AAV载体的比率相比较， 本发明种群内的完整:空AAV载体的比率提高了至少20%。优选地，本发明的AAV载体种群包 括AAV2、AAV5和/或AAV8血清型载体。
[0022]附图的简要说明
[0023]图1为三种血清型AAV载体在AVB琼脂糖凝胶亲和层析之前和之后的蛋白图谱。（a) 标准的层析图谱，显示了AAV从未结合的细胞蛋白中分离；（b)银染SDS-PAGE蛋白图谱，显示 AAs载体在层析之前(粗制的）和之后(纯化的）纯度。E为空衣壳，G为携带报告基因 GFP和AAV 衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的完整载体。
[0024]图2为细胞蛋白的免疫印迹分析，显示了在亲和层析之前（粗制的）和之后（纯化 的）以下蛋白与AAV载体的关联：（a)膜联蛋白（Annexin)A5,（b)CypA和RuvB2; (dYBUE为空 衣壳，G为携带GFP和对照293T细胞裂解产物的完整AAV; (d) YB1与AAV载体的关联，使用蛋白 酶K去除保留在纯化载体内且未被载体衣壳保护的痕量的未结合细胞蛋白。
[0025]图3为生产细胞内蛋白表达的时序分析。（a)AAV蛋白（VP1、VP2和VP3)在转染24小 时之后可被检测到，在转染后24小时至72小时略有提高；（b)Rep蛋白在转染24小时之后可 检测到；（c)YBl和CypA的表达贯穿整个生产周期保持不变；（d)在所有三种血清型AAV中，可 观察到膜联蛋白A5表达的不断提高。对照：不转染任何质粒的空白293T细胞裂解产物 (293T)，转染pcDNA3质粒的293T细胞(Mock)，和管家基因 GAPDH作为内参照。
[0026] 图4为靶向膜联蛋白A5和YB1的shRNA序列免疫印迹分析。在携带shRNA A2或A5以 及shRNA Y3、Y4或Y5序列并分别靶向（a)膜联蛋白A5和(b)YBl的生产细胞内，观察到显著的 基因敲减。具有靶向非哺乳动物基因的shRNA序列的293T细胞（Scramble)和不具有任何 shRNA序列的293T细胞(293T)被用作对照。管家基因 GAPDH进一步被用作内参照。
[0027] 图5为以对照shRNA Scramble为标准，YB1基因敲减细胞内生产的AAV的载体基因 组效价，显示了从7个批次培养80天的基因敲减生产细胞中，（a)AAV2提高多达50倍和(b) AAV8提高了 10倍。
[0028]图6为冷冻保存并培养长达80天之后的6个批次的基因敲减细胞内YB1的持续下 调。具有靶向非哺乳动物基因的shRNA序列的293T细胞(Scramble)和不具有任何shRNA序列 的293T细胞(293T)被用作对照。管家基因 GAPDH进一步被用作内参照。
[0029]图7为YB1下调和AAV产量与所用YBl_shRNA病毒的量的相互关系，显示了（a)当提 高shRNA病毒时，YB1下调程度略有提高和(b)相对于对照scramble和天然293T细胞，AAV2的 相对基因组效价，以及用50ml YBl-shRNA病毒处理对生产细胞内载体基因组效价达到最大 影响。对照样品包括具有靶向非哺乳动物基因的shRNA序列的293T细胞(Scramble)，具有LV 空颗粒但不具有shRNA序列的293T细胞(Mock)，不具有LV和shRNA序列的天然293T细胞 (293T)。管家基因 GAPDH进一步被用作内参照。
[0030] 图8为靶向NPM1的shRNA序列的免疫印迹分析。（A)在携带shRNA N6和N9的生产细 胞内观察到显著的基因敲减，（B)NPM1下调持续超过80天和(C)在冷冻保存复苏之后。具有 靶向非哺乳动物基因的shRNA序列的293T细胞(Scramble)和不具有任何shRNA序列的293T 细胞(293T)被用作对照。管家基因 GAPDH进一步被用作内参照。
[0031] 图9为靶向NCL的shRNA序列的免疫印迹分析。(A)在携带shRNA N4的生产细胞内观 察到显著的基因敲减，（B)在培养后，NCL下调持续80天。具有靶向非哺乳动物基因的shRNA 序列的293T细胞（Scramble)和不具有任何shRNA序列的293T细胞(293T)被用作对照。管家 基因 GAPDH进一步被用作内参照。
[0032] 图10为相对于对照shRNA scramble，NPM1基因敲减细胞内生产的AAV的载体基因 组效价，显示了（a)AAV2提高了多达35倍和(b)AAV8提高了 30倍。
[0033] 图11为相对于对照shRNA scramb 1 e，NCL基因敲减细胞内生产的AAV的载体基因组 效价，显示了巨大的差异，AAV2基因组效价提高了2-40倍(A)，AAV5(B)和AAV8基因组效价 (C)的上调效果较小(提高多达10倍）。
[0034] 图12为使用CRISPR gRNA序列的YB1基因敲除的免疫印迹分析。对于4个CRISPR gRNA序列A、B、C或D的每一序列，均生产2个批次(Bland B2)的CRISPR gRNA敲除细胞。从亲 代B1和B2gRNA生产细胞进一步衍生单细胞克隆。在总共10个单细胞克隆中观察到YB1基因 敲除。不具有任何gRNA序列的亲代293T细胞(293T)被用作对照;管家基因 GAPDH进一步被用 作内参照。
[0035] 图13为YB1敲减细胞表达rep和cap蛋白以及生产载体DNA的分子分析：（A)免疫印 迹，显示了瞬时转染24小时和72小时之后，YB1敲减细胞内AAV2-Rep表达分别提高了 12和4 倍；（B)ELISA，显示了与scramble细胞相比，在YB1敲减细胞裂解产物中cap表达降低了7倍， 以及从YB1和scramb 1 e细胞获得的载体内检测到的Cap蛋白量相当；和(C)实时定量聚合酶 链式反应(qPCR)，显示了与scramble细胞中的相比，YB1敲减细胞内总载体DNA提高了13倍， 未包装载体DNA提高了 8倍，包装载体DNA提高了4倍。Y: S为YB1和scramble之间的比率，在免 疫印迹中，用管家基因 GAPDH校正后相比，在qPCR分析中，用管家基因肌动蛋白校正后由细 胞数目标准化后相比。+PK为加蛋白酶K处理;-PK为不加蛋白酶K处理;+DnaseI为加 DNAse I 处理;S为对照scramble ;Y为YB1敲减细胞。
[0036] 图14为智人Y盒结合蛋白l(YBl/YBXl)mRNA(SEQIDN0:3)和氨基酸（SEQIDN0: 29)序列。
[0037] 图15为智人核仁磷酸蛋白（核仁磷酸蛋白1323，11111]1&1：1'；[11，即]\11)(〇0嫩（31〇116]\^〇: 22724頂AGE:4081364),完整的编码序列，mRNA(SEQ ID Ν0:1)和氨基酸（SEQ ID Ν0:27)序 列。
[0038] 图16为人类核仁蛋白基因，完整的编码序列mRNA(SEQIDN0:2)和氨基酸(SEQID NO: 28)序列。
[0039] 发明的详细描述
[0040] 腺相关病毒载体
[0041] 腺相关病毒(AAV)为感染人类和一些其他灵长类动物物种的小病毒家族。AAV属于 微小病毒(Parvoviridae)科，依赖病毒(Dependovirus)属。AAV为小的（约20nm)、无包膜的、 复制缺陷的病毒。AAV具有长度约4.7千碱基(kb)的可为正义或反义的单链线性DNA基因组。 [0042] AAV基因组包括在DNA链两端的反向末端重复（ITRs)和两个开放阅读框(ORFs): rep和cap。前者由4个编码AAV生命周期所需的R印蛋白的重叠基因组成，后者包括编码衣壳 蛋白VP1、VP2和VP3的重叠核苷酸序列，其一起相互作用以形成二十面体对称的衣壳。
[0043] VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的基因通常由单一启动子控制，特指p40，并且这3种衣壳 蛋白均由单一 mRNA翻译。通常VP1、VP2和VP3的分子量分别约为87、72和62千道尔顿(kDa)。 AAV衣壳蛋白通常在AAV DNA基因组上编码。
[0044] 尽管在人类中AAV血清阳性很高（约80%的人是AAV2血清阳性），然而该病毒并不 与任一人类疾病相关联。AAV载体可感染分裂细胞和静止期细胞。该病毒可以不整合到宿主 细胞的基因组中而以染色体外的状态存在。可选的，该病毒可在人19号染色体(AAVS1)特定 位点稳定整合到宿主细胞基因组中。与腺病毒相反，AAV通常不触发对被其感染的细胞的免 疫反应，因此可将基因传递至目的位点，包括在对肌肉和眼睛疾病进行基因治疗的情况下 的大脑。这些特点使得AAV成为非常吸引人的用于制作基因治疗病毒载体和开发疾病模型 的候选物。
[0045] 在AAV装配和生产的过程中，AAV载体固有地需要各种各样的细胞蛋白，然而这些 蛋白的身份目前很少被描述。本发明人首次鉴定并表征了与AAV载体内在相关的宿主蛋白， 其目的是提高用于基因治疗的AAV载体的产量。特别是，本发明人已经研究了重组AAV的三 种血清型，即AAV2、AAV5和AAV8,并且论证了 NPMUNCL和YB1在AAV载体生产中的重要作用。 使用液体色谱-质谱(LC/MS/MS)，本发明人已经鉴定了66种AAV相关的人类细胞蛋白，包括 NPM1、NCL和YB1。引入NPM1、NCL和/或YB1的shRNA序列可靶向并下调相应的基因并提高AAV 效价。
[0046]如此处所描述，本发明提供了新的AAV载体生产的生产系统，其提高了所生产的病 毒效价。本发明的生产系统还可提高所生产的完整:空病毒载体颗粒的比率。本发明的生产 系统包括适于AAV载体生产的生产细胞系，以及使用该生产细胞系生产AAV载体的方法。
[0047] 本发明还提供了由所述生产系统、生产细胞系和方法生产的AAV载体。通常，本发 明的AAV载体与本领域已知的标准方法生产的AAV载体不同，由于本发明的AAV载体具有较 高的效价，改进的完整:空AAV载体比率和/或细胞蛋白，特别是来自于生产细胞系的蛋白， 在AAV载体中的受调控水平。
[0048] 根据本发明，完整的病毒载体颗粒是含有传递到个体负载的病毒载体颗粒。通常， 此处所指的负载为核苷酸序列。根据本发明，空的病毒载体颗粒为缺少该负载的病毒载体 颗粒。通常，本发明的空病毒载体颗粒为空的AAV衣壳或蛋白外壳。
[0049] 本发明的AAV载体可在许多学科中用于基因治疗和基因操作和修饰的方法。载体 可包括一种或多种治疗性核苷酸序列，其可为任何适当的形式，包括单链DNA(ssDNA)或自 身互补DNA。例如，本发明的AAV载体可包括用于治疗或预防疾病或失调紊乱的治疗性DNA序 列。本发明的AAV载体也可在其他方面有用，例如用于药物开发和研究。该非治疗性应用包 括基因操作和传递，例如传递shRNA、致癌基因等，以产生诱导性多功能干细胞(IPS)。
[0050] AAV载体可以是任一 AAV血清型。例如，本发明的AVV载体可以是AAV1、AAV2、AAV3、 AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10 或 AAV11 的任一。在优选实施方案中，AAV 载体选自 AAV2、AAV5或AAV8。本发明还提供了两种或多种AAV血清型的组合。AAV血清型的组合可包括 AAV2和AAV5;AAV5和AAV8;AAV2和AAV8;或AAV2、AAV5和AAV8。
[0051] 本发明还提供了本发明的腺相关病毒(AAV)载体的种群。特别地，本发明提供了由 此处所公开的本发明方法所得到的AAV载体种群。根据本发明，AAV载体种群可被定义为本 发明AAV的多拷贝。例如，本发明的AAV载体种群可包括至少10 9vg/ml、至少109vg/ml、至少 209vg/ml、至少 309vg/ml、至少409vg/ml、至少509vg/ml、至少 101Qvg/ml 或更多的 AAV 载体颗 粒。本发明的AAV种群可包括本发明的单一类型的AAV载体。例如，本发明的AAV种群可包括 单一血清型AAV载体，可包括单一负载(例如一种药物KAAV种群可由一个或多个批次或者 一个或多个生产周期生产。
[0052]本发明的AAV载体衣壳可包括此处表2所列蛋白的任何组合。通常，本发明的AAV载 体衣壳包括此处公开的YB1、NPM1和NCL的任何组合。该衣壳还可包括表2所列的一种或多种 基因和/或蛋白，其由所研究的四种或多种AAV血清型共享。一种或多种基因和/或蛋白在 AAV内具有功能可以是已经为人所知的，或一种或多种基因和/或蛋白与AAV相关联是此处 首次提出。通常，除YB1、NPM1和NCL的至少一种之外，被调节的一种或多种基因和/蛋白选自 核内不均一核糖核蛋白K (hnRNPK)，单链DNA结合蛋白1，新生多肽相关复合体α亚单位 (CypA)，肽脯氨酰顺反异构酶，α-烯醇化酶，膜联蛋白A5，RuVB likel和RuVB like 2。
[0053]本发明在此任何涉及AAV载体的公开内容也可用于本发明的AAV载体种群。例如， 在本发明的一个实施方案中，调节生产细胞系的一种或多种基因和/或蛋白可将AAV载体种 群内完整:空AAV载体的比率提高至少20%、至少30 %、至少40%、至少50 %、至少60%、至少 70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少150%、至少200%或更多。优选地，调节生产细 胞系的一种或多种基因和/或蛋白将本发明AAV载体种群内完整:空AAV载体颗粒的比率提 尚至少50%。由调节一种或多种基因和/或蛋白所引起的病毒效价的提尚可与由在此描述 的对照方法得到的病毒效价相比较。对照方法可以是本领域已知的生产AAV载体的任何标 准方法。例如，对照方法可使用未经本发明改良的生产细胞系。由所述对照/标准方法生产 的AAV载体和AAV载体种群可用作在此描述的对照载体和种群。
[0054]本领域已知的标准方法可生产AAV载体种群，其中所生产的AAV载体高达100 %为 空的，或空AAV载体是完整AAV载体的100倍。即使通过进一步加工，标准方法生产AAV载体种 群中，其中至少20 %AAV载体为空的。本发明的方法可生产AAV载体种群，其中至少50%、至 少60 %、至少70 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少 98 %、至少99%，直至100 %AAV载体为完整的（即少于50 %，少于40 %，少于30%，少于20 %、 少于15%、少于10%、少于5%、少于4%、少于3%、少于2%、少于1 %直至没有所生产的AAV 载体是空的）。本发明的方法可生产AAV载体种群，其中与完整AAV载体数目相比，空AAV载体 数目少于50倍，少于40倍，少于30倍，少于20倍，少于10倍或更少。
[0055] 在本发明AAV载体种群中至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至 少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、直至并包括所有的 AAV载体颗粒可具有包括至少一种表2所列蛋白的衣壳。通常，在本发明AAV载体种群中，至 少50 % AAV载体颗粒具有包括至少一种表2所列蛋白的衣壳。优选地，至少一种蛋白为在此 描述的YB1、NPM1和/或NCL的一种或多种蛋白，更优选地，至少50%AAV载体颗粒具有包括 YB1的衣壳，再优选地，至少50 % AAV载体颗粒具有包括YB1、NPM1和NCL的衣壳。
[0056] 相比于在对照AAV载体衣壳内或在对照AAV载体种群中的AAV载体衣壳内的至少一 种蛋白的数量，在本发明的AAV载体或AAV载体种群中的AAV载体衣壳内的至少一种表2所列 蛋白的数量可被调节。例如，相比于对照AAV载体衣壳内或对照AAV载体种群中AAV载体衣壳 内的至少一种蛋白的数量，所述至少一种蛋白的数目可相差至少10%、至少20%、至少 30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少100 %、至少 150%、至少200%或更多。这种改变可以是提高或降低所述的至少一种蛋白。当相对于对照 改变多种蛋白时，其相对于对照可以是所有的下降，可以是一些下降其他提高，或者可以是 所有的提尚。
[0057] 可使用任何标准技术，对在本发明AAV载体种群中的AAV载体衣壳内的表2所列任 何蛋白的存在和/或数量进行确定和/或定量。由根据本发明生产细胞系内一种或多种基因 和/或蛋白的调节而导致的表2所列任何蛋白的存在和/或数量的任何提高，均可与由在此 描述的对照方法得到的AAV载体种群中的AAV载体衣壳内的表2所列的任何蛋白的存在和/ 或数量相比较。
[0058] 相比于对照AAV载体或AAV载体种群，本发明的AAV载体或AAV载体种群的效价提高 了至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍，至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少 70倍或更多。优选地，所述AAV载体或AAV载体种群的效价提高了至少2倍、至少5倍或至少10 倍。所述AAV载体或AAV载体种群效价可与对照AAV载体或AAV载体种群的效价相比较，或者 与由在此描述的对照方法得到的病毒效价相比较。
[0059] 生产腺相关病毒载体的方法
[0060]本发明人已经首次示出了，调节用于生产AAV载体的生产细胞系内的某些基因和/ 或蛋白的表达，可对由所述生产细胞系生产的病毒载体的效价产生影响。调节用于生产AAV 载体的生产细胞系内的某些基因和/或蛋白的表达，还可提高由所述生产细胞系生产的完 整:空病毒载体颗粒的比率。调节用于生产AAV载体的生产细胞系内的某些基因和/或蛋白 的表达，还可改变AAV载体衣壳内蛋白的存在和/或数量，特别是来自生产细胞系的蛋白。
[0061] 一种或多种基因和/或蛋白调节
[0062] 如在此所描述的，本发明提供了用于生产AAV载体的新的生产系统，其提高了所生 产的病毒效价。本发明的生产系统还可提高所生产的完整:空病毒载体颗粒的比率。本发明 的生产系统还可改变AAV载体衣壳内蛋白的存在和/或数量，特别是来自生产细胞系的蛋 白。本发明的生产系统包括生产适于AAV载体生产的生产细胞系，以及使用该生产细胞系生 产AAV载体的方法。本发明还提供了由该生产系统、生产细胞系和方法生产的AAV载体。
[0063] 因此，本发明提供了生产AAV载体的方法，包括调节生产细胞系内一种或多种基因 和/或蛋白的表达。
[0064] 调节可以是提高或减少(降低)一种或多种基因和/或蛋白的表达。在多种基因和/ 或蛋白被调节的情况下，可以是所有的基因/蛋白提高，或者可以是所有的基因/蛋白降低， 或者可以是一种或多种基因/蛋白提高而其他的基因/蛋白降低。在优选实施方案中，该调 节为降低一种或多种基因和/或蛋白的表达。
[0065] 不管是提高或者是减少生产细胞系内一种或多种基因和/或蛋白的表达，调节可 以以对照为标准进行测量。因此，本发明生产细胞系内一种或多种基因和/或蛋白的表达可 与对照中所述一种或多种基因和/或蛋白的表达进行比较。一种或多种基因和/或蛋白的实 际数量，例如本发明和对照的生产细胞系内的一种或多种基因和/或蛋白的质量、克分子 量、浓度或摩尔浓度，可以被评估并与来自对照的对应值相比较。可选的，本发明的生产细 胞系内的一种或多种基因和/或蛋白的表达可以与对照的表达相比较，而不对一种或多种 基因和/或蛋白的质量、克分子量、浓度或摩尔浓度进行量化。
[0066] 通常，对照是其中一种或多种基因和/或蛋白未进行调节的等同生产细胞系。例 如，在本发明的生产细胞系为YB1表达减少的转基因细胞系的情况下，合适的对照应当为 YB1表达没有改变的相同的细胞系。该对照细胞系可以是野生型细胞系。根据本发明的对照 方法通常使用在此所描述的对照生产细胞系。根据本发明，可考虑将生产AVV的常规方法 (包括已知方法)作为对照方法。
[0067] 相比于对照，本发明生产细胞系内一种或多种基因和/或蛋白的表达可以相差至 少10 %、至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少 90%、至少100%、至少150%、至少200%或更多。
[0068] 例如，假如本发明生产细胞系内一种或多种基因和/或蛋白的表达相比于对照减 少了，所述表达可以是相比于对照部分减少或全部减少。通常，所述表达减少至少10%、至 少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少 95%、至少99%，直至该一种或多种基因和/或蛋白的表达全部消除(敲除）。
[0069] 假如本发明生产细胞系内一种或多种基因和/或蛋白的表达相比于对照提高了， 该表达可以是相比于对照提高了至少10 %、至少20 %、至少30%、至少40 %、至少50%、至少 60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少150%、至少200%。
[0070] 本发明的生产细胞系内一种或多种基因和/或蛋白的表达可由定量和/或定性分 析来确定。通常，基因表达可通过mRNA的水平来表示。
[0071] 本发明生产细胞系内一种/或多种基因和/或蛋白的表达水平涵盖了一种/或多种 基因和/或蛋白的质量、一种/或多种基因和/或蛋白的摩尔量、一种/或多种基因和/或蛋白 的浓度和一种/或多种基因和/或蛋白的摩尔浓度。表达水平可以任何适当的单位给出。例 如，一种或多种基因和/或蛋白的浓度可以以pg/ml，ng/ml或μg/ml给出。
[0072] 本发明生产细胞系内一种/或多种基因和/或蛋白的表达水平可以直接或间接测 量。
[0073] 以对照为标准，本发明生产细胞系内一种或多种被调节的基因和/或蛋白的相对 表达可使用任何适当的技术来确定。合适的标准技术是本领域已知的，例如Wes tern blotting和酶联免疫吸附测定(ELISAs)。
[0074]相比于对照，将被调节的一种或多种基因和/或蛋白的表达水平可持续改变至少 12小时、至少24小时、至少30小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时、至少120小时、至 少144小时、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至 少9周、至少10周、至少11周、至少12周、至少13周、至少14周、至少15周或更多。
[0075]相比于对照，将被调节的一种或多种基因和/或蛋白的表达水平可被改变至少1 代、至少2代、至少3代、至少4代、至少5代、至少10代、至少20代、至少30代、至少40代或更多 代培养的生产细胞系。一种或多种基因和/或蛋白的表达水平可以被无限改变。
[0076] 调节的基因和/或蛋白
[0077]本发明人已经实施了包含在AAV衣壳内的非病毒蛋白的首次系统分析，并且已经 鉴定了在衣壳或一种或多种AAV血清型2、5和8内发现的66种蛋白。这些蛋白在表2内列出。 通常，这些非病毒蛋白来自制作AAV载体颗粒的生产细胞系。
[0078]调节生产细胞系内这些66种蛋白的一种或多种的表达对于提高产自该生产细胞 系的AAV载体的效价是有用的。因此，本发明提供了用于生产AAV载体的方法，包括调节表2 所列的至少一种蛋白的表达。
[0079] 本发明的方法可包括调节表2所列DNA结合蛋白中至少一种蛋白的表达。可选择地 或者另外，本发明的方法可包括调节表2所列非DNA结合蛋白中至少一种蛋白的表达。
[0080] 本发明的方法可包括调节表2所列的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少10 种、至少20种、至少30种、至少40种、至少50种、至少60种，直至所有的基因和/或蛋白的表 达。
[0081 ]表2所列蛋白中，已知有若干种与DNA结合。例如，NPM1 (又称为核磷蛋白、核仁磷酸 蛋白B23和numatrin)、NCL和YB1均与DNA和/或RNA结合。
[0082] NPM1与核仁核糖核蛋白（nucleolar ribonucleoprotein)结构有关，且与单链和 双链DNA均结合。人类NPM1基因的基因组DNA序列见SEQ ID N0:l(Genbank登记号 N〇.BC016768,version BC016768.1GI :16876991) JPM1 通常位于核仁内，但是在一些环境 下可转运至核原生质内。
[0083] NCL基因编码核仁磷蛋白核仁素。核仁素为DNA结合蛋白，参与核糖体的合成和成 熟。在此任何对NCL蛋白的称谓均可被理解为对核仁素的称谓。人类NCL基因的基因组DNA序 列见SEQ ID N0:2(Genbank登记号Ν〇·Μ60858,version M60858.1GI:189305)〇
[0084] YB1基因编码Y盒结合蛋白1(也被称为Y盒转录因子和核酸酶敏感元件结合蛋白 1)。人类ΥΒ1基因的基因组DNA序列见SEQ ID N0:3(Genbank登记号Ν〇.ΝΜ_004559.3, version ΝΜ_004559.3GI: 109134359)。在此任何对ΥΒ1蛋白的称谓均可被理解为对Υ盒结合 蛋白1的称谓。ΥΒ1是DNA和RNA结合蛋白，参与到很多DNA和mRNA依赖的过程。ΥΒ1包装mRNA并 使其稳定，且在不同水平参与到基因调节中。
[0085]已知腺蛋白E1B与YB1相互作用，且导致YB1在细胞核内聚集和腺病毒基因 E2A的激 活。YB1的过表达以E1-独立的方式调节腺病毒E2启动子，且已经显示在E1-删除的腺病毒载 体中，YB1的过表达提高了腺病毒的DNA复制和感染性病毒颗粒的产量。因此YB1过表达已经 被应用到基于腺病毒的载体开发和病毒治疗中。
[0086]然而，如此处实施例所论证的，本发明人发现了YB1的敲减导致了AAV载体效价的 提高。进一步，本发明人论证了生产细胞内YB1表达的下调可导致AAV rep表达的提高、AAV 载体DNA产量的提高和AAV cap表达的降低。不被理论约束，据相信来自生产细胞系的DNA结 合蛋白，例如YB1、NPM1和NCL，与腺病毒组分竞争结合DNA，特别是单链DNA( ssDNA)。所述腺 病毒组分包括腺蛋白E2a和E4,其为病毒复制所需的早期功能蛋白，以及VA，其为编码未被 翻译的小RNA分子的腺病毒基因组的区域，该区域调节结合DNA的病毒mRNA的翻译。E4区的 开放阅读框6对于将单链AAV基因组转换成双链形式是重要的，该双链形式是随后DNA复制 步骤的基础。通过与AAV病毒DNA结合、启动DNA延伸以及将延伸的链从其模板上取代下来， 蛋白E2A在病毒DNA复制中起重要作用。
[0087] 腺病毒组分例如E2a、E4和VA，对于AAV载体颗粒生产是必须的，通过与这些腺病毒 组分竞争结合DNA，生产细胞系DNA结合蛋白可降低AAV载体颗粒产量。因此，不被理论约束， 降低生产细胞系DNA结合蛋白，例如NPM1、NCL和YB1的表达可减少这些生产细胞系DNA结合 蛋白与E2A竞争结合到AAV DNA，从而导致了E2A-AAV DNA交互作用和AAV DNA复制效能的提 升，并最终提高AAV载体基因组效价。
[0088] YB1结合到启动子的ssDNA区已经被证实导致了 ssDNA的稳定，也抑制了基因转录 和翻译。因此，下述是可能的：下调YB1 (或另一生产细胞DNA结合蛋白例如NPM1或NCL)可促 进E2A结合到AAV2p5启动子，协同促进AAV2和AAV8效价提高(如本发明人所观察到的）。 [0089]因此，本发明的方法通常包括调节NPM1、NCL和YB1中的至少一种的表达。本发明的 方法通常包括调节YB1的表达。还涵盖了调节NPM1、NCL和YB1的组合的方法。例如，本发明的 方法可包括调节（i) NPM1 和NCL; (i i) NPM1 和YB 1; (i i i) NCL和YB 1;或（i v) NPM1、NCL和YB 1 的 表达。在优选实施方案中，本发明的方法包括调节NPM1、NCL和YB1的表达。
[0090] 在优选实施方案中，本发明的方法包括减少NPM1、NCL和YB1中至少一种的表达。通 常本发明的方法包括减少YB 1的表达。还涵盖了减少NPM1、NCL和YB 1的结合的方法。例如，本 发明的方法可包括减少（i)NPM1 和NCL; (i i) NPM1 和YB 1; (i i i) NCL和YB 1;或（i v)NPM1、NCL和 YB1的表达。在优选实施方案中，本发明的方法包括降低NPM1、NCL和YB1的表达。
[0091] 本发明的方法进一步包括调节生产细胞系内一种或多种附加基因和/或蛋白的表 达。例如，本发明进一步包括调节生产细胞系内表2所列的一种或多种附加蛋白的表达。根 据本发明，被调节的附加蛋白可以是DNA结合蛋白。根据本发明，被调节的附加蛋白具有除 了 DNA结合外的其它功能。因此，本发明的方法包括调节在生产细胞系内具有不同功能的两 种或多种基因和/或蛋白，其中至少一个可以是DNA结合蛋白。本发明的方法包括调节NPM1、 NCL和YB1中至少一种的表达，和调节生产细胞系内一种或多种附加基因和/或蛋白，其中一 种或多种附加基因和/或蛋白在表2列出。
[0092]本发明的方法可包括调节在此所公开的NPMUNCL和YB1的任意组合的表达，以及 调节表2所列的一种或多种基因和/或蛋白的表达。在优选实施方案中，表2内的一种或多种 基因和/或蛋白被所研究的4个或更多AAV血清型所分享。一种或多种基因和/或蛋白或已知 在AAV中具有功能，或在此首次提出可能与AAV相关联。通常，被调节的除NPM1、NCL和YB1中 至少一种之外的一种或多种基因和/或蛋白，选自核内不均一核糖核蛋白K(hnRNPK)，单链 DNA结合蛋白1，新生多肽相关复合体α亚单位(CypA)，肽脯氨酰顺反异构酶，α-烯醇化酶，膜 联蛋白A5，RuVB like 1 和RuVB like 2。
[0093] 根据本发明，可通过任何适当的方式来调节将要被调节的一种或多种基因和/或 蛋白。合适的标准技术是本领域已知的。调节可通过任何合适的机制发生，例如根据所使用 调节剂的性质（见下方），如在任何直接或间接交互作用中进行立体干扰，或者调节一种或 多种基因和/或蛋白。
[0094] 本发明的调节剂对于被调节的基因或蛋白为特异的。所谓特异的，可以理解为调 节剂结合到被调节的基因或蛋白，例如NPM1、NCL和YB1基因，而与任何其他分子，特别是任 何其他蛋白没有显著的交叉反应。例如，对于NPM1特异的调节剂，与人中性粒细胞弹性蛋白 酶没有表现出显著的交叉反应。交叉反应可通过任何合适的方法来评估。对于将被调节的 基因或蛋白的调节剂，假如调节剂结合到其他分子的强度是结合到被调苄基因或蛋白分子 的强度的至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90或100%，则可被认为是与该基因或蛋白之外的分子产生的交叉 反应是显著的。对于被调苄基因或蛋白特异的调节剂，可以低于结合到被调苄基因或蛋白 分子的强度的 90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、 25%或20%的强度结合到另外分子比如人中性粒细胞弹性蛋白酶。优选地，调节剂结合到 其他分子的强度低于结合到被调苄基因或蛋白分子的强度的20%、15%、10%或5%、2%或 1%〇
[0095] 根据本发明，可使用任何合适的调节剂，例如多肽和模拟肽、抗体、小分子抑制剂、 双链RNA、反义(单链)RNA、核酸适配体和核酶。可使用转录和转录后基因沉默技术来调节本 发明的一种或多种基因。转录后基因沉默也被称为RNA干扰(RNAi)。在优选实施方案中，调 节是由Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)基因组 编辑实施的，其通常用于降低本发明一种或多种基因的表达。优选的拮抗剂包括双链RNA和 嵌合向导RNA转录本（gRNA) wRNA结合细菌CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA (tracrRNA)，在CRISPR基因组编辑期间，它们与核酸内切酶(通常为CRISPR相关的核酸酶 (Cas)，例如Cas9)被共同招募到目的基因处。可使用同类调节剂或者不同的调节剂来调节 本发明的一种或多种基因。作为非限制性的实施例，可全部使用CRISPR基因组编辑调节 YB1、NPM1和/或NCL;或者使用CRISPR基因组编辑来调节YB1，使用shRNA来调节NPM1和/或 NCL〇
[0096] 双链 RNA
[0097] 双链RNA(dsRNA)分子可用于调节生产细胞系内一个或多个基因的表达。通常， dsRNA用于减少在此描述的一种或多种基因的表达。dsRNA分子可用于RNAi以调节本发明的 一种或多种基因。
[0098] 使用已知的技术和基于被调节的一种或多种基因的序列信息，通过基于序列同源 地靶向相应的RNA序列，可将dsRNA设计为拮抗一种或多种基因。该dsRNA-般为小干扰RNAs (811?祖8)、小发夹1?祖8(8111?祖8)或微1?嫩(11^祖8)。该(181?祖的序列包括与编码被调节的一 种或多种基因的mRNA的一部分相对应的部分。该部分通常与由一种或多种基因转录的mRNA 内的靶向部分100 %互补，但是较低的互补水平(如90 %或更多，或者95 %或更多）也可被使 用。通常，互补性的百分比，是在相邻的核苷酸残基的长度上确定的。本发明的dsRNA分子， 例如，与由一种或多种基因转录的mRNA内的靶向部分，在至少10个、至少20个、至少30个、至 少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、或者更多个核苷酸残基上，具 有至少80%互补性，直至dsRNA分子在整个dsRNA分子长度上与由本发明一种或多种转录的 mRNA具有至少80 %互补性。
[0099] 在优选实施方案中，dsRNA为shRNA^hRNA可通过任何适当的方法传递到生产细胞 系。合适的技术是本领域已知的，包括使用质粒、病毒和细菌载体以将shRNA传递到生产细 胞系。通常，shRNA是使用病毒载体传递系统进行传递的。在优选实施方案中，病毒载体为慢 病毒载体。
[0100]通常，一旦shRNA被传递到生产细胞，随后在细胞核内转录并加工。得到的shRNA前 体(pre-shRNA)由细胞核输出，然后被dicer加工并装入到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。 正义(过客)链被降解。反义（引导)链指导RISC到具有互补序列的mRNA。在完美互补的情况 下，RISC切割mRNA。在不完美互补的情况下，RISC抑制mRNA的翻译。在这两种情况下，shRNA 均会导致靶向基因沉默。
[0101] shRNA用于调节表2所列的一种或多种基因的表达。多个shRNA可被用于调节表2所 列任一基因的表达。通常，shRNA可被用于调节YB1、NPM1和/或NCL和/或YB1中至少一种的表 达。多个shRNA可被用于调节YB1、NPM1和/或NCL的表达。
[0102] 用于调节YB1表达的shRNA可包括选自SEQ ID N0s:14至18((YB1-Y1至YB1-Y5)或 其变体的核苷酸序列。选自SEQ ID N0s:14to 18或其变体的多个shRNA可被用于调节YB1表 达。在优选实施方案中，用于调节YB1表达的shRNA为SEQ ID勵：17和/或18以81-￥4和￥5)， 或其变体。
[0103] 用于调节NPM1表达的shRNA可包括选自SEQ ID N0s:4至8(NPM-N6至NPM-N10)或其 变体的核苷酸序列。选自SEQ ID N0s:4至8或其变体的多个shRNA可用于调节NPM1表达。在 优选实施方案中，用于调节NPM1表达的shRNA为SEQ ID N0:4和/或7(NPM-N6和N9)，或其变 体。
[0104] 用于调节NCL表达的shRNA可包括选自SEQ ID N0s:9至13(NCL-N1至NCL-N5)或其 变体的核苷酸序列。选自SEQ ID N0s:9至13或其变体的多种shRNA可被用于调节NCL表达。 在优选实施方案中，用于调节NCL表达的shRNA为SEQ ID N0:9和/或12(NCL-N1和N4)，或其 变体。
[0105] NPM-N6至N10、NCL-N1 至N5和YB1-Y1 至Y5(SEQ ID N0s:4至 18)的序列如下表 1 所 不。
[0106] 可使用SEQ ID N0s:14至 18(YB1-Y1 至YB1-Y5)，SEQ ID N0s:4to 8(NPM-N6至NPM-N10)和SEQ ID N0s:9至13(NCL-N1至NCL-N5)或其变体的shRNA的任意组合。变异体序列可 在任何适当的序列长度上与本发明的序列具有至少80%序列同源性。通常，序列同源性的 百分比是在一段相邻的核苷酸或氨基酸残基长度上进行确定的。例如，本发明的变异序列 可在至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、 至少90个，或者更多核苷酸或氨基酸残基上具有与本发明序列至少80%序列同源性。
[0107] 例如，本发明的变异shRNA分子可在至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至 少50个、至少60个或更多的核苷酸残基上与本发明的shRNA分子具有至少80 %序列同源性， 直至变异shRNA分子在整个的变异shRNA分子长度上与本发明shRNA分子具有至少80 %序列 同源性。通常，本发明的变异shRNA分子是SEQ ID N0s:4至18中一个或多个shRNA分子的一 个变异体。
[0108] CRISPR基因组编辑
[0109] 用于基因组编辑的规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR)系统通常包括两个独 特组分：（1)向导RNA和(2)核酸内切酶，特别是CRISPR相关(Cas)核酸酶，例如Cas9。向导RNA 形成单一嵌合向导RNA(gRNA)转录本的细菌内源性crRNA和tracrRNA的组合。当gRNA和Cas 在细胞内表达时，靶向的基因组序列可被修改或永久性破坏。
[0110] 通过gRNA序列与在基因组DNA中本发明的一种或多种基因的互补靶向序列发生碱 基配对，gRNA/Cas复合物被招募到到靶向序列。为了成功结合Cas，基因组靶向序列必须还 包括紧跟靶向序列的正确的前间区序列邻近基序(PAM)序列。在本发明的一种或多种基因 中，gRNA/Cas复合物的结合将Cas定位到基因组革El向序列，以便野生型Cas能够切割DNA的两 条链，使得双链断裂。这可通过一个或两个普通修复途径进行修复：（1)非同源末端连接DNA 修复途径或者(2)同源定向修复途径。非同源修复途径通常会导致双链断裂处插入/缺失， 其可引起移码或提前出现终止子，有效地扰乱本发明的一个或多个基因的开放
[0111] 阅读框架。同源定向修复途径需要存在修复模板，其用于修理双链断裂。
[0112] 表1本发明的示例shRNA分子的序列
[0113]
[0114] 根据本发明，任何适当的gRNA对，倘若其调节在此描述的本发明一种或多种基因， 均可用于CRISPR基因组编辑。通常，gRNA对用于减少在此描述的本发明的一种或多种基因 的表达。优选的，任何适当的gRNA对均可用于调节（一般为减少，优选删除/敲除)YB1、NPM1 和/或NCL的表达，优选YB1的表达。
[0115] 可使用已知的技术且以被调节的一种或多种基因的序列知识为基础，通常使用适 当的计算机程序，比如CRISPR/Cas9程序(https : //chopchop · rc · fas · harvard · edu/)对 gRNA对进行设计。例如，可使用CRISPR/Cas9程序（https:// chopchop .rc. fas. harvard. edu/)且革巴向包含YB1基因序列的人类1号染色体全部序列（登 录号NC_000001.11)来设计用于调节YB1的gRNA。可使用任何适当的技术，通过本领域已知 的标准技术和商业可得的适当的工具来生成敲除生产细胞。
[0116] 可通过任何适当的方式将gRNA对传递到本发明的生产细胞系。适当的技术是本领 域已知的，包括使用质粒、病毒和细菌载体来将gRNA对传递到生产细胞系。通常，使用质粒 DNA来传递gRNA对。
[0117] gRNA对可用于调节表2所列的一种或多种基因的表达。多gRNA对可用于调节表2所 列的任一种基因的表达。通常，gRNA对可用于调节YB1、NPM1和/或NCL和/或YB1中至少一种 的表达。多gRNA对可用于调节YB1、NPM1和/或NCL的表达。
[0118] 用于调节YB1表达的gRNA对可包括选自SEQ ID N0s:33和34;SEQ ID N0s:35和36; SEQ ID N0s:37和38;和/或SEQ ID N0s:39和40或其变体的核苷酸序列对。选自SEQ ID NOs :33和34; SEQ ID NOs :35和36; SEQ ID NOs :37和38;和SEQ ID NOs :39和40或其变体的 多gRNA对可被用于调节YB1表达。
[0119] 变异体序列可在任何适当的序列长度上与本发明序列具有至少80%序列同源性。 通常，序列同源性的百分数是在相邻的核苷酸或氨基酸残基长度上确定的。例如，本发明的 变异gRNA序列可在至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16 个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个，或 更多的核苷酸残基上与本发明的序列具有至少80%序列同源性，直至变异gRNA分子在全部 的变异gRNA分子长度上与本发明的shRNA分子具有至少80%的序列同源性。通常，本发明的 变异gRNA分子是SEQ ID NOs:33至40的一种或多种gRNA的变异体。本发明的gRNA对可以包 括这里公开的一种或两种gRNA序列的变异体。例如，SEQ ID NOs:33至40的gRNA的变异可包 括SEQ ID N0:33的变异、SEQ ID N0:34的变异或者SEQ ID N0:33和34的变异。该原则适用 于在此公开的所有的gRNA对。
[0120] 反义 RNA
[0121] 单链DNA( ssDNA)分子，也被称为反义RNA，可用于调节生产细胞系内一种或多种基 因的表达。通常，反义RNA用于减少此处描述的一种或多种基因的表达。
[0122] 使用已知技术和以被调节的一种或多种基因序列知识为基础，可通过相应RNA的 基于序列同源的靶向来设计反义RNA以拮抗一种或多种基因。这种反义的序列将包括与该 一种或多种基因转录的mRNA的一部分相对应的的部分。该部分通常与转录mRNA中靶向部分 100%互补，但是也可使用较低水平的互补(如90%或更多，或者95%或更多）。
[0123] 核酸适配体
[0124] 核酸适配体通常为结合特定靶分子的核苷酸分子。核酸适配体可完全在体外设 计，由化学合成轻松获得，拥有期望的存储性能和在治疗应用中引起很小的或不引起免疫 原性。这些特性使得核酸适配体在制药和临床治疗中特别有用。
[0125] 如此处所使用的，核酸适配体通常指单链或双链的寡核苷酸或该寡核苷酸的混合 物，其中所述寡核苷酸或混合物能够特异地结合到靶点。寡核苷酸核酸适配体将在此处进 行讨论，但是熟悉本领域的读者理解也可使用其他的具有等同结合特性的核酸适配体，例 如多肽核酸适配体。
[0126] 通常，核酸适配体包括其长度为至少5个、至少10个或至少15个核苷酸的寡核苷 酸。核酸适配体可包括其长度为多达40个、多达60个或多达100个或更多核苷酸序列。例如， 核酸适配体长度可以是自5至100个核苷酸，自10至40个核苷酸，或者自15至40个核苷酸。在 可能的情况下，较短长度的核酸适配体是优选的，由于他们通常会较少被其他分子或材料 干扰。
[0127] 核酸适配体可使用常规方法生成，例如指数富集的配基系统进化技术（SELEX)程 序。SELEX为与靶分子高特异结合的核酸分子的体外进化方法。例如，在US 5,654，151，US5， 503,978, US 5,567,588和W0 96/38579 中对其进行了 描述。
[0128] SELEX方法包括从一批寡核苷酸中选择核酸适配体，并特别是能够结合到期望靶 点的单链核酸。一批单链核酸(例如DNA，RNA或其变异体)在有助于结合的环境下与靶点接 触，在混合物中将与靶点结合的核酸从未结合的核酸中分离出来，核酸-靶点复合物被解 离，已结合到靶点的那些核酸被扩增以产生富集有具有期望结合活性的核酸的集合或库， 随后必要时重复该系列步骤，以生产对相关靶点具有特定结合亲和性的核酸(适配体）的 库。
[0129] 变异体核酸序列
[0130] 至少80 %的序列同源性包括至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、 至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94%、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少 99%、至少100%的序列同源性(对此处提出的每一和各个核酸序列和/或对此处提出的每 一和各个SEQ ID N0)。
[0131] 各种序列比对方法中的任何方法可用于确定同源性百分比，包括但不限于，全局 法、局部法或混合法，例如分割算法。确定同源性百分比的方法是本领域技术人员范围内的 常规程序。全局法是分子从头到尾比对序列，并通过个体残基配对加分和空位罚分来确定 最好的比对。非限制性的方法包括，例如CLUSTAL W，如参见Julie D.Thompson et al.， CLUSTAL ff: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting,Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice，22(22)Nucleic Acids Research 4673-4680(1994);和迭代优化， 如参见 Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein.Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments，264(4)J.MoI .Biol .823-838(1996)。局部法通过鉴定所有输 入序列共有的一个或多个保守序列来进行比对序列。非限制性方法包括，例如Match-box， 如参见Eric Depiereux and Ernest Feytmans ,Match-Box : A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences,8(5) CABI0S 501-509(1992);吉布斯取样，如参见 C.E.Lawrence et al.，Detecting Subtle Sequence Signals:A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment,262(5131) Science 208-214(1993);Align_M，如参见Ivo Van Walle et al.，Align-M_A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences,20(9) Bioinformatics :1428-1435(2004)。因此，序列同源性百分比是由常规方法确定的。例如参 见Altschul et al.，Bull.Math.Bio.48:603_16，1986and Henikoff and Henikoff， Proc·Natl.AcacL Sci·USA 89:10915-19，1992。
[0132] 通过列举变异体序列和以上提供的特定参考序列之间存在差异的核苷酸的数目， 可替代性地定义以上提供的特定序列的变异体。因此，在一个实施方案中，序列可包括(或 由组成）与以上提供的特定序列相差不多于5个、不多于4个、不多于3个、不多于2个核苷酸 位点的核苷酸序列，例如不多于1个。优选保守取代。
[0133]本发明的变异核酸分子，例如本发明的变异shRNA分子和/或变异gRNA分子和/或 变异gRNA对通常仍保留本发明相应分子的活性。因此，例如本发明的变异shRNA分子保留了 相应shRNA分子调节本发明一种或多种基因表达的能力。变异shRNA分子可保留本发明 shRNA分子的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%直至和包括100%的调节 活性。这同样适用于本发明的gRNA分子和/或gRNA对。
[0134] 本发明的核苷酸分子，例如本发明的shRNA分子、gRNA分子和/或gRNA对，可被标记 (或标签），以促使去除缺失shRNA分子、gRNA分子和/或gRNA对的生产细胞。嘌呤霉素是合适 标签的实例。本发明的装配成gRNA对的两个gRNA分子可用相同的标签来标记。可选择地，本 发明装配gRNA对的两个gRNA分子可用不同的标签来标记，以使得两个gRNA分子可被区分。
[0135] 调节的效果
[0136] 本发明的调节剂可提高或减少生产细胞系一种或多种基因和/或蛋白的表达。通 常该一种或多种基因和/或蛋白在此处公开的表2中列出。根据本发明，生产细胞系的一种 或多种基因和/或蛋白的调节通常将引起生广细胞系AAV载体生广效价的提尚。
[0137] 生产细胞系的一种或多种基因和/或蛋白的调节可将AAV载体生产效价提高至少2 倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、 至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少55倍、至少 60倍、至少65倍、至少70倍或更多。优选地，生产细胞系一种或多种基因和/或蛋白的调节将 AAV载体生产效价提高至少2倍、至少5倍或至少10倍。由一种或多种基因和/或蛋白调节引 起的病毒效价的任何提高，均可与由此处描述的对照方法得到的病毒效价相比较。
[0138] 调节生产细胞系一种或多种基因和/或蛋白可提高AAV载体生产效价，持续至少5 天、至少10天、至少20天、至少30天、至少40天、至少50天、至少60天、至少70天、至少80天、至 少90天、至少100天或更多。优选的，调节生产细胞系一种或多种基因和/或蛋白提高AAV载 体生产效价，持续至少40天。再一次，提高的病毒效价的持续时间可与在此描述的对照相比 较。
[0139] 调节生产细胞系一种或多种基因和/或蛋白可提高AAV载体生产的效价，至少1代、 至少2代、至少3代、至少4代、至少5代、至少10代、至少20代、至少30代、至少40代或更多代培 养的生产细胞系。
[0140] 调节生产细胞系一种或多种基因和/或蛋白可无限地提高AAV载体生产的效价。
[0141] -种或多种基因和/或蛋白对病毒效价的调节可能依赖于时间和剂量。一般地，即 使在低剂量和早期时间点，可能会实现AAV载体效价提高显著倍数，至少2倍、至少5倍或至 少10倍(例如参见图6B)。
[0142] AAV载体效价的提高可使用任何适当的技术来测量。用于测量病毒效价的标准技 术是本领域已知的，例如，使用基于细胞的测定如空斑检测和/或定量PCR(qPCR)。
[0143] 根据本发明，调节生产细胞系一种或多种基因和/或蛋白可提高生产细胞所生产 的完整:空AAV载体的比率。AAV载体效价的提高和/或完整:空AAV载体比率的提高可与此处 所描述的对照相比较。
[0144] 调节生产细胞系一种或多种基因和/或蛋白可使得完整：空AAV载体的比率提高至 少10 %、至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少 90%、至少100%、至少150%、至少200%或更多。优选地，调节生产细胞系一种或多种基因 和/或蛋白将生产细胞系所生产的完整:空AAV载体的比率提高了至少50%。
[0145] 调节生产细胞系一种或多种基因和/或蛋白可提高生产细胞系所生产的完整：空 AAV载体的比率，因此与完整AAV载体数目相比，AAV载体种群包括了少于50倍、少于40倍、少 于30倍、少于20倍、少于10倍或更少的空AAV载体。
[0146] 由调节一种或多种基因和/或蛋白引起的病毒效价的任何提高均可与由此处描述 的对照方法得到的病毒效价相比较。
[0147] 调节生产细胞系一种或多种基因和/或蛋白可提高生产细胞系生产的完整:空AAV 载体的比率，持续至少5天、至少10天、至少20天、至少30天、至少40天、至少50天、至少60天、 至少70天、至少80天、至少90天、至少100天或更多。优选地，调节生产细胞系一种或多种基 因和/或蛋白可持续至少40天提尚生广细胞系生广的完整:空AAV载体的比率。再一次，提尚 病毒效价的持续时间可与在此描述的对照相比较。
[0148] 调节生产细胞系一种或多种基因和/或蛋白可提高生产细胞系生产的完整:空AAV 载体的比率，至少1代、至少2代、至少3代、至少4代、至少5代、至少10代、至少20代、至少30 代、至少40代或更多代培养的生产细胞系。
[0149] 调节生产细胞系一种或多种基因和/或蛋白可无限地提高生产细胞系生产的完 整:空AAV载体的比率。
[0150] 生产细胞系生产的完整:空AAV载体的比率可使用任何适当的技术来测量。用于测 量病毒效价的标准技术是本领域已知的，例如，可将qPCR和ELISA结合使用以量化完整:空 AAV载体的比率。
[0151]调节生广细胞系一种或多种基因和/或蛋白可独立地提尚AAV rep表达、提尚AAV 载体DNA产量和/或降低AAV cap表达。通常，与此处定义的对照细胞系或方法相比，AAV rep 表达的改变、AAV载体DNA产量的提高和/或AAV cap表达的降低为至少2倍、至少3倍、至少4 倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13 倍、至少14倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至 少50倍、至少55倍、至少60倍、至少65倍、至少70倍或更多。
[0152]调节生广细胞系一种或多种基因和/或蛋白可独立地提尚AAV rep表达、提尚AAV 载体DNA产量和/或降低AAV cap表达，持续至少5天、至少10天、至少20天、至少30天、至少40 天、至少50天、至少60天、至少70天、至少80天、至少90天、至少100天或更多。优选地，调节生 产细胞系一种或多种基因和/或蛋白持续至少40天独立地提高AAV rep表达、提高AAV载体 DNA产量和/或降低AAV cap表达。再一次，效果的持续时间可与在此描述的对照相比较。 [0153]调节生广细胞系一种或多种基因和/或蛋白可独立地提尚AAV rep表达、提尚AAV 载体DNA产量和/或降低AAV cap表达，至少1代、至少2代、至少3代、至少4代、至少5代、至少 10代、至少20代、至少30代、至少40代或更多代培养的生产细胞系。
[0154] 调节生产细胞系一种或多种基因和/或蛋白可无限地独立地提高AAV rep表达、提 高AAV载体DNA产量和/或降低AAV cap表达。
[0155] 一种或多种基因和/或蛋白对AAV rep表达、AAV载体DNA产量和/或AAV cap表达的 调节可能依赖于时间和剂量。通常，即使在低剂量和早期时间点，也会可能实现AAV rep表 达、AAV载体DNA产量和/或AAV cap表达的显著倍数的效果。
[0156] 可使用任何适当的技术来测量AAV rep表达的提高、AAV载体DNA产量的提高和/或 AAV cap表达的降低。用于测量病毒效价的标准技术是本领域已知的。
[0157]调节生广细胞系一种或多种基因和/或蛋白可独立地提尚AAV rep表达、提尚AAV 载体DNA产量和/或降低AAV cap表达，至少10%、至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、 至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少150%、至少200%或更多。优选 地，调节生产细胞系一种或多种基因和/或蛋白独立地提高AAV rep表达、提高AAV载体DNA 产量和/或降低AAV cap表达至少50%。
[0158] AAV载体生产
[0159] 如此处描述的，本发明提供了生产细胞系，其中与对照相比，表2所列的一种或多 种基因和/或蛋白的表达被调节。
[0160] 在优选实施方案中，对一种或多种基因和/或蛋白的调节是通过shRNA或CRISPR基 因组编辑实现的。假如使用shRNA，shRNA-般被标签化以促进将缺失shRNA的生产细胞去 除。假如使用CRISPR基因组编辑，与非分裂/非gRNA编辑的对照细胞内的单PCR产物/条带相 比较，PCR引物可被设计为能在阳性敲除细胞通过gDNA切割而生成两个产物(条带）。再一 次，这促进了将其中本发明一种或多种基因未被调节的生产细胞去除。
[0161] -旦本发明的该生产细胞系被建立，根据本发明其可用于生产AAV载体。根据本发 明，任何适当的技术均可用于生成AAV载体。标准技术在本领域是已知的。
[0162] 本发明的AAV载体可被工程改造为将用于传递和表达的任何治疗性多核苷酸运送 到一个或多个革E细胞。使用本领域技术人员已知的技术（Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，F.et al.，eds.，Wiley and Sons,New York, 1995)，治疗性 多核苷酸可被引入到AAV载体内的多个位点，包括但不限于，El区、E2区、E3区和E4区。克隆 到AAV载体内的治疗性多核苷酸可被设计作为完整的转录单元，包括适当的启动子和多聚 腺苷酸加尾(polyadylation)信号。
[0163] 因此，本发明的AAV载体可包括处在源于AAV的末端重复对之间的治性疗多核苷酸 基因和启动子。启动子和治疗性多核苷酸的组合在此也被称为盒(cassette)。
[0164] 启动子序列以影响基因表达的方式可操作地连接到治疗多核苷酸。因此，启动子 序列可在治疗性多核苷酸的任何一端或两端。进一步地，一个AAV载体内可存在多于一个启 动子和治疗性核苷酸，即在末端重复之间可有两个或多个盒。相应地，多于一个外源基因可 被一个载体表达。
[0165] 假如当启动子和多核苷酸可操作连接时，启动子能够驱动治疗多核苷酸的表达， 任何启动子可被用在本发明的AAV载体。该启动子为本领域已知的，包括AAV E1启动子或E4 启动子，例如，以及其他的包括但不限于CMV启动子和PGK启动子。启动子可以有组织或细胞 偏好性或特异性，意味着其可在特定类型的组织或细胞中驱动治疗性多核苷酸的表达。再 一次，该启动子是本领域已知的。
[0166] 位于治疗性多核苷酸3'端的合适的多腺苷酸化信号，包括但不限于AAV多腺苷酸 化信号。AAV基因组的E3区可被删除以便提高载体的克隆容量或者其可被保留在载体构建 中。
[0167] 本发明的AAV载体通常包括：1)末端重复介导稳定的、特异性位点的整合进入被处 理个体的细胞基因组;和2)启动子介导治疗性多核苷酸的表达，或者启动子介导编码目的 多肽的反义RNA或正义RNA的转录。
[0168] 本发明的AAV载体可由各种本领域已知的标准方法来构建，元件t的连接顺序可以 是变化的。启动子和治疗性核苷酸可连接到一起，以提供可插入到两个AAV末端反向重复 (ITRs)之间的盒。本发明AAV载体构建的标准技术是本领域已知的，且可在参考中得到，如 Sambrook et al.(1989:Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor，N.Y.)，或任何被广泛应用的大量的重组DNA技术的实验规程。对于连接DNA片段各 种策略都是适用的，其策略的选择取决于DNA片段末端的性质并且容易被确定。
[0169] 例如，根据本发明生产AAV载体的标准技术包括将DNA质粒转染到生产细胞内以表 达AAV衣壳和Rep蛋白；DNA质粒的共转染，以表达以单链DNA或自我互补DNA形式存在的AAV 载体基因组DNA，以及包括两个源于任何AAV血清型且在两侧有治疗性和/或报告基因的AAV 末端反向重复（ITR)，以便在受体细胞或病人内发挥生物学或治疗性功能;通过质粒DNA共 转染或病毒感染，引入或不引入（即在无辅助系统内）来自AAV辅助病毒如腺病毒和单纯疱 疹病毒的AAV辅助元件。
[0170] 促进DNA整合到染色体、DNA表达和载体克隆的其他的多核苷酸序列要素均可包括 在本发明的AAV载体中。例如，启动子上游的增强子或治疗性多核苷酸下游的终止子的存在 可促进表达。
[0171] 如此处所公开的，本发明的AAV载体还包括AAV衣壳蛋白。通常，AAV衣壳蛋白指定 为VP1、VP2和VP3。这些AAV衣壳蛋白通常在AAV DNA基因组上编码，使得能够生产被装配的 AAV病毒颗粒。
[0172] 生产细胞系
[0173] 根据本发明，生产细胞系可被定义为能够复制和包装AAV载体的细胞系。根据本发 明，任何适当的生产细胞系可被修饰或使用。本发明的生产细胞系为真核细胞系，通常为哺 乳动物细胞系。本发明生产的AAV载体通常用于人体治疗。因此，本发明的优选生产细胞系 为人细胞系。本发明的生产细胞系可选自见!13了3、!11'1080^549、海拉细胞和册1( 2931'细胞 系。本发明的生产细胞系可为贴壁或悬浮形式。
[0174] 在优选实施方案中，生产细胞系为人胚胎肾(HEK)293T细胞系。HEK 293T细胞系在 Rous肉瘤病毒长末端重复序列的启动子的转录控制下表达SV40早期区域。
[0175] 如此处所引用的，对照生产细胞系为根据本发明未被修饰或适应的生产细胞系。
[0176] 治疗应用
[0177] 本发明的AAV载体可被用作基因治疗载体。基因治疗包括将新的遗传信息转移并 插入到细胞内。遗传信息可瞬时或稳定地插入到细胞内。本发明的AAV载体对于基因治疗是 安全的。因此，本发明的AAV载体能够特异性位点地整合到哺乳动物染色体内，且基本上不 带有细胞毒性，从而指导宿主细胞特异性表达治疗性多核苷酸。优选的，本发明的AAV载体 用在哺乳动物的基因治疗，更优选人类。
[0178] 本发明的AAV载体可包括任何能够用于治疗或预防疾病或病症的多核苷酸。治疗 性多核苷酸可以是DNA或RNA。通常，治疗性多核苷酸为DNA。治疗性多核苷酸优选为生物学 功能基因，其靶向（替代)被治疗个体的非功能基因和/或突变基因。在优选实施方案中，当 被-治疗个体为人时，治疗性多核苷酸也是人的。
[0179] 治疗性多核苷酸可编码生物功能蛋白，即多肽或蛋白，其影响表达生物功能蛋白 的细胞的细胞机制。例如，生物功能蛋白可以是细胞正常生长或保持个体健康所必不可少 的蛋白。通过提供缺失蛋白，通过提高个体内生产不足的蛋白的数量，或通过提供抑制或阻 碍存在于个体内的不期望分子的蛋白，生物功能蛋白还可以是提升个体健康的蛋白。生物 学功能蛋白还可以是对于开发新的基因治疗或研究细胞机制的调查研究有用的蛋白。
[0180]生物学功能蛋白可以是对于身体正常生长或修复必不可少的蛋白。生物学功能蛋 白还可以是在与对抗疾病诸如癌症中有用的蛋白。生物学功能蛋白还可以是表达抗生素抗 性的筛选标记，如用于真核细胞中新霉素抗性的筛选标记。其他类型的筛选标记也可以被 使用。编码这些蛋白的治疗性多核苷酸可通过多种方法获得，如常规克隆程序（Sambrook et al.)，从包含目的基因的载体中切下，或基于已发表的序列信息化学合成或酶合成。在 许多情况下，编码目的蛋白的DNA是商业可得到的。
[0181 ]生物学功能蛋白可通过向细胞提供新的或改变的功能而影响细胞机制。例如，治 疗性多核苷酸可以是编码P-糖蛋白的多药抗性基因(mdr)。？-糖蛋白是影响细胞内药物累 积且引起多药抗性现象的细胞膜糖蛋白。
[0182] 治疗性多核苷酸可编码非生物学功能蛋白。例如，包括多种结构域和功能的杂交 基因，其可通过重组技术或酶或化学合成设计和生产。
[0183] 治疗性多核苷酸能够被转录到RNA分子，其与目的mRNA或DNA充分互补杂交，例如 正义或反义RNA。该RNA分子用于预防或限制过度生产的、有缺陷的或其他不期望的分子的 表达。本发明的AAV载体可包括编码反义RNA的序列作为治疗性多核苷酸，其与靶序列充分 互补以便结合到靶序列。例如，祀序列可以是能够结合到编码自身多肽的mRNA并阻遏其翻 译的编码多肽的mRNA的部分。靶序列可以是转录必需基因的片段，这样反义RNA结合该片段 (如启动子或编码区）并阻遏或限制转录。因此，反义RNA必须有足够的长度和互补性，以阻 遏其祀mRNA的翻译或其靶DNA的转录。反义RNA对靶序列具有充分的互补性，这样反义RNA能 够结合到靶点，从而使用标准技术可确定抑制翻译或转录的程度。治疗性多核苷酸可被提 供，例如，由化学或酶合成，或来自商业途径。
[0184] 可通过检测转导细胞内治疗性多核苷酸的表达来评估本发明的AAV载体的功能， 即介导治疗性多核苷酸的转移和表达的能力。例如，可用本发明的AAV载体或包含该AAV载 体的不同浓度的病毒粒子转染细胞，然后评估治疗性多核苷酸的表达。
[0185] 表达的测定取决于治疗性多核苷酸的性质。可通过各种方法监测表达，包括免疫 学的、组织化学的或活性测定。例如，可使用适当的DNA或RNA探针进行Nor thern分析来评估 转录。假如治疗性多核苷酸编码的多肽的抗体是可得的，Western blot分析、免疫组织化学 或其他的免疫技术可被用于评估多肽的产量。如果治疗性多核苷酸是酶，则还可使用适当 的生物化学测定。例如，假如治疗性多核苷酸编码抗生素抗性，则确定被感染细胞对抗生素 的抗性可用来评价抗生素抗性基因的表达。
[0186] 除了评估外源基因在适当的细胞内表达之外，AAV载体正确的启动子特异性可通 过检测治疗性多核苷酸的表达，或者在启动子没有活性的细胞内表达的缺失来评价。
[0187] 本发明的治疗性多核苷酸可以是选自用于CF的CFTR、用于肺气肿的α?-抗胰蛋白 酶、用于AIDS的可溶CD4、用于腺苷脱氨酶缺陷的ADA和被认为对基因治疗有潜在用处的任 何其他基因。
[0188] 本发明的AAV载体可适应于离体和体外基因治疗应用。
[0189] 本发明的AAV载体还可用于传递其他治疗剂。例如，本发明的AAV载体可用于传递 小分子、肽和/或蛋白治疗剂。
[0190]本发明的AAV载体可用于与其他的治疗剂和/或治疗方法相结合。特别是，在治疗 疾病包括但不限于癌症中，本发明的AAV载体可用于与标准治疗剂和/或方法相结合。AAV诱 导免疫可提高抗体功能。因此，根据本发明治疗应用的一个例子是使用本发明的AAV载体传 递治疗性抗体，或使用本发明的AAV载体与治疗性抗体相结合。
[0191]因此，本发明提供了用于治疗方法的此处所描述的AAV载体。本发明还提供了此处 所描述的AAV载体在生产基因治疗的药剂中的用途。
[0192] 下述实施例将举例说明本发明 实施例
[0193] 实施例1载体生产
[0194] 两种形式的载体颗粒，即来自三种AAV血清型即AAV2、AAV5和AAV8的完整的和空的 (不具有任何转基因序列)颗粒被生产和研究。完整的载体颗粒包括编码GFP的载体序列，空 载体颗粒是不具有载体序列的衣壳。
[0195] 完整的六六￥颗粒由以下三种质粒表达：口!16]^61'(31:抑七386116，1]34)、编码44￥1^卩- 质粒pAAV2/2Rep-Cap购自 Stratagene(USA)，质粒pAAV-2/5-RC and AAV-2/8-RC由 Professor James Wilson(NIDCR/Pennsylvania,USA)友情提供。
[0196] 所有的载体由人胚胎肾293T细胞(Stratagene，USA)瞬时转染生产，使用磷酸钙-BBS方法(Chen et al.^WSS^iotechniques 6:632-638)。收集载体生产细胞，经过5次冻 融循环以释放载体颗粒，通过离心分离(2000g)去除细胞碎片。
[0197] 随后将包含载体颗粒的上清液通过0.45μηι过滤器(11;[11丨?(^6，1]1〇进行过滤，在层 析之前使用20mM Bis-Tris Propane buffer进行稀释。使用吉尔森HPLC系统(Anachem，UK) 进行层析，其装备有UV-检测器(Gil son, 119)、栗（Gilson 306)、自动进样器（Gil son 231XL)和组分收集器(Gilson FC203B)，二者均装有与冷冻再循环水浴(Grant，SLS)相连接 的温度控制板，该冷冻再循环水浴还对水套柱进行冷却。使用Gilson Unipoint软件控制该 系统。将XK 16/26柱（AmerSham，UK)装载5ml柱床体积的AVB琼脂糖高性能媒介（GE Healthcare，Sweden，并根据厂商的方案进行操作。
[0198] 本研究中使用的AVB琼脂糖亲和层析被设计用来纯化腺相关病毒。图1A示出了典 型的蛋白分离，使用内含耦联了AAV抗体的AVB琼脂糖的5ml分离柱，多数蛋白没有结合到 AAV抗体，因此在使用洗脱缓冲液(50mM Glycine，pH2.7)之前流过柱子（图1A)。空衣壳和完 整的载体都以25-35分钟迀移时间被洗脱（图1A)。通过使用SDS-PAGE和银染（图1B)，洗脱样 品的蛋白图谱可见，显示了AAV样品在层析之后纯度很大。如所期望的，三个主要的AAV衣壳 蛋白VP1 (8lkDa)，VP2(72kDa)和VP3(62kDa)是明显的。未提纯的粗制AAV样品显示出了很多 蛋白带。
[0199] 实施例2使用LC-MS/MS鉴定AAV载体的蛋白
[0200] 来自实施例1的纯化的载体颗粒被汇集起来，在10K MWC0 Slide-A-Lyzer透析盒 (Thermo scientific,USA)PBS溶液中平衡透析，并在载体定量之前使用Ultra 5K MWC0离 心过滤装置(Mi 11 ipore，UK)将初始体积浓缩至1 /20。
[0201]使用SYBR green染料实时qPCR来确定纯化载体的载体定量基因组效价，利用 AAV2ITI^|*GGAACCCCTAGTGATGGAGTT(SEQIDN0:24WPCGGCCTCAGTGAGCGA(SEQIDN0: 25)，以及探针CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG(SEQ ID NO: 26)，探针在其5 '端标记有6-羧基荧光 素(6-FAM)，在其3 '端标记有四甲基罗丹明（TAMRA)。使用质粒pAAV2-hr-GFP生成标准曲线。 使用Pierce BCA蛋白定量分析试剂盒(Thermo scientific,USA)并遵从厂商方案来测量总 蛋白。根据厂商的方案使用SilverXpress染色试剂盒（Invitrogen，USA)对衣壳蛋白的身份 和预期数量进行可视化。
[0202]纯化浓缩的载体样品被胰蛋白酶酶切，酶切条件为1 % Rap igest和50mM碳酸氢铵 (ABC)中，pH 8.5,37°C持续3小时。在样品进入MS分析之前，加入HCL终止酶切。
[0203]使用质谱分析系统(Thermo Fisher，UK)来实施LC-MS/MS，该质谱分析系统装有纳 米电喷射离子源和两个质谱检测器，即线性阱(LTQ)和轨道阱，加上终极3000nan〇-LC系统， 其包括溶剂脱气装置、装载栗、纳米栗和恒温自动进样器。在自动进样之后，从每个酶切所 萃取的肽在一个俘获盒中脱盐(PepMap反相C18,5yml〇〇 /i,300yid X 5mm长）（Thermo)并在 C18反相纳米柱中洗脱（3μηι,人,5cm长）（Thermo)，以及随后采用梯度洗脱，流动相为5-70%乙腈和0.1 %甲酸的线性梯度，0.3yL/min的柱流速进行60分钟的分离，。线性阱内第一 次测量MS扫描(from m/z 400- 2000)之后，5个信号最强离子依次分离并以30，OOOppm分辨 率传递到轨道阱，以便用于精确质量测量。然后这些在线性离子阱中以35%的碰撞诱导能 量碎片化。总循环时间大约为30毫秒。以将动态排除设置为2的数据依赖性MS/MS模式收集 数据。
[0204] 通过使用带有built-in Sequest的Thermo Proteome Discoverer 1.2.来实现包 括质谱处理和数据库搜索的数据分析。被MS用于蛋白鉴定的初始质量偏差率被设置为百万 分之10(ppm)。多达两种胰蛋白酶裂解方式被考虑和蛋氨酸氧化被设定为动态修饰。仅考虑 电荷为1、2和3，Xcorrelation得分分别大于1.5、2或2.2时MS/MS鉴定到的肽段序列。当至少 两个肽段与数据库蛋白匹配时，可考虑明确鉴定了某个蛋白。蛋白FASTA数据库由 www.uniprot.orgT载，发布于2012_03，包括从人类(类群标识符9606)牛(9913 )，绿色焚光 蛋白（P42212)与AAV2(648242)，AAV5(82300)和AAV8(202813)的完整的条目。
[0205] 对来自六种不同类型的纯化AAV载体样品，即AAV2-GFP，AAV2-空，AAV5-GFP，AAV5-空，AAV8-GFP和AAV8-空，的总蛋白等量进行LC-MS/MS分析。为了最大限度减少数据偏差，对 于载体的每一类型都制备了三个批次的样品，每个批次由40个组织培养皿(直径150mm)汇 集起来。对每一批次的样本完成三个MS运行。结果表明有66种蛋白在三批次样本的至少2/3 运行检测到，并因而被认为是显著的和有待进一步研究。这些蛋白列于表2。
[0206] 在显著的蛋白中间：
[0207] ?四种蛋白，即GAPDH、热休克70kDa蛋白 lA/lB、Histotone H2Atype 1H和组蛋白 H2B是AAV载体所有6种类型所共同的，无论血清型和颗粒形式的；
[0208] · 6种蛋白为载体5种类型所共享的；
[0209] ?在4种类型样品所共享的10种蛋白中，有6种蛋白被AAV2和AAV5的空形式和完整 形式所共享，表明了 AAV2和AAV5载体之间的相对相似；
[0210] · 20种蛋白对于载体两种类型载体是共同的，其大多数是对相同血清型的空形式 和完整形式是共同的；和
[0211] · 21种蛋白对于个别类型的载体是独特的。
[0212] 表2MS/MS研究中所鉴定的蛋白列表
[0213]





[0220] 实施例3MS数据验证
[0221]为验证实施例2中得到的质谱数据，选择用MS所鉴定的两类蛋白用作免疫印迹： (i)蛋白NPM1、NCL1和ATP5A，其在AAV生命周期中有记载发挥作用;和（i i)膜联蛋白V、RuvB、 CypA、hnRNPK和YB1，其与AAV没有报道具有关联，但在MS分析中具有相对高的得分和可信 度。
[0222]使用10%SDS聚丙烯酰胺凝胶来离析蛋白样品，然后进行免疫印迹。用于免疫印迹 的样品被电泳，电转染至Hybond ECL膜(Amersham，UK)。使用以下一抗:小鼠抗AAV2、小鼠抗 膜联蛋白 V(Abeam，UK)、抗核仁素(Abeam，UK)、抗核磷蛋白（Abeam，UK)、抗EF102(Abeam, UK)、抗CypA(Abnova，UK)、抗RuBV2(Abcam，UK)、抗hnRNP K((Abcam，UK)、抗ATP5A(Abcam， UK)和抗YB1 (Abeam，UK)。用山羊抗鼠、抗兔或兔抗山羊辣根过氧化物酶偶联物(Sigma，UK) 进一步孵育免疫印迹。用ECL化学发光试剂(Amersham，UK)检测免疫反应蛋白质。
[0223]来自用于MS/MS的相同样品的每一份样品都取1 Oyg总蛋白，使用SDS/PAGE离析，然 后用于免疫印迹分析。使用SDS/PAGE和银染（图1B)对总蛋白可视化鉴定，确证样品纯度和 可比含量的AAV衣壳蛋白VP 1、VP2和VP3。
[0224] 免疫印迹分析表明RuvB2、CypA和膜联蛋白A5在所有测试样品中均可检测到（图2A 和BhYBl在除了 AAV8空衣壳之外的所有样品中可检测到（图2C)，无论它们是粗制的或者纯 化的。为区分在AAV载体中结合与共纯化但不结合的细胞蛋白，使用蛋白酶K(PK)去除保留 在纯化载体中且没有被载体衣壳保护的痕量未结合细胞蛋白。图2D示出了在ΡΚ处理之前和 之后，可比地检测到纯化AAV载体内ΥΒ1蛋白，表明ΥΒ1结合在AAV载体内。进一步的，在与AAV 载体平行处理和HPLC纯化的纯化对照293Τ细胞中未检测到ΥΒ1蛋白（泳道未纯化，图2D)，突 显了用于AAV载体纯化所采用的AVB柱的特异性，进一步阐明了 ΥΒ1蛋白在AAV载体中结合。 在任何所测试的样品中均未检测到hnRNPK(数据未显示）。
[0225] 在表3中对来自免疫印迹分析和MS研究的结果进行了进一步总结和比较，表明了 在这两种不同方法之间的蛋白检测中的22.9% (11/48所测试的样品，用圆圈突出显示）的 差异和77.1 % -致性。
[0226] 实施例4生产细胞内AAV产量对蛋白表达的影响
[0227] 为研究AAV产量对生产细胞内病毒和细胞蛋白表达的潜在影响，分析了在AAV生产 的一个完整周期内AAV衣壳蛋白、膜联蛋白A5、CypA和YB1表达的变化，即在AAV和辅助质粒 转染之前0小时，至转染之后4、6、24、30、48和72小时，当载体生产过程被终止和AAV载体收 获时。AAV衣壳蛋白（VP1、VP2和VP3)和R印蛋白可在AAV2生产细胞内转染之后24小时检测到 (图3A和3B)。转染后24至72小时之间，可观察到在生产细胞的衣壳蛋白略有增加。在整个 AAV生产的一个完整的周期，YB1和CypA的表达没有观察到显著的变化（图3C);在所有三种 血清型中观察到膜联蛋白A5表达的持续增加（图3D)。
[0228] 表3免疫印迹法和质谱结果比较
[0229]
[0230] 实施例5NPM1，NCL和YB1的shRNA基因敲减
[0231 ]功能性shRNA特异性识别靶基因导致该基因表达的下调。由于建立培养的细胞以 过表达NCL和NPM1(数据未显示)是不可能的，因而这种策略被选择作为替代来研究AAV装配 中细胞蛋白的作用。
[0232] 假设在生产细胞内NPM1、NCL、膜联蛋白V和/或YB1的shRNA敲减会损害(MS/MS和免 疫印迹鉴定)NPM1、NCL、膜联蛋白V和/或YB1与AAV病毒的关联，和随后可能会影响基因敲减 细胞内AAV生产，慢病毒载体传送系统用来筛选shRNA序列。
[0233] 功能性shRNA特异性识别靶基因导致该靶基因表达的下调。为鉴定YB1和Annexin A5在AAV生产中的作用和重要性，设计实验使用shRNA敲减生产细胞内YB1或Annexin A5，假 设是，该敲减会损害YB1或Annexin A5与AAV病毒的关联（如MS/MS和免疫印迹研究所鉴定 的），并随后影响基因敲除细胞内AAV的装配。
[0234] 慢病毒载体传送系统用于筛选10个shRNA序列(A1至A5，SEQ ID N0s:19至23,和Y1 至Y5，SEQ ID N0s:14至18)，分别革巴向Annexin A5和YB1，由于它们具有下调（deregulate) Annexin Α?5和YB1 的能力。
[0235] 更详细地，使用慢病毒表达系统质粒pLK0.1-puro(Sigma，USA)表达shRNA，。使用 CaCl2转染方法，shRNA和慢病毒载体包装质粒被转染到293T细胞。对照细胞被不具有shRNA 序列的空衣壳(mock)或以非哺乳动物基因序列为靶向的无序shRNA序列（scramble)转染。 293T细胞被LV-shRNA载体转导，转导48小时之后用嘌呤霉素进行筛选。
[0236] AAV载体基因组效价通过q-PCR确定，利用靶向CMV启动子或AAV2ITR序列的引物和 探针。CMV引物：TTCCTACTTGGCAGTACATCTACG(SEQIDN0:30)和GTCAATGGGGTG GAG ACT TGG(SEQ ID N0:31);和CMV探针：TGA GTC AAA CCG CTA TCC ACG CCC A (SEQ ID 勵：32)。八￥21丁1?引物GGAACCCCTAGTGATGGAGTT(SEQ ID N0:24)和CGGCCTCAGTGAGCGA (SEQ ID N0:25)和探针CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG(SEQ ID N0:26)。再一次，5'端使用6-FAM和3'端 使用TAMRA作为标签。使用质粒DNA pAAV-hrGFP(Stratagene，USA)作为参考标准，从102至 1〇8拷贝范围内采用10倍倍比稀释法。使用LightCycler480(Roche，USA)进行qPCR，条件为 在95 °C -个10分钟循环，随后在95 °C 15秒，60 °C 30秒，72 °C 5秒进行45个循环。使用如前所描 述的免疫印迹方法，对来自shRNA病毒转导细胞的10ug总蛋白进行评价基因敲减的水平。
[0237] 由于在LV shRNA系统内没有报告基因来实施常规方法以检测shRNA病毒效价，必 需使用直接比较来控制和验证基因敲减研究，通过在相同的条件下同时生成所有的样品和 对照shRNA病毒，并随后使用同体积shRNA病毒来处理相同数目的细胞。图4表明了shRNA序 列A2和A5显著下调Annexin A5表达（图4A)。同样，与具有革E1向非哺乳动物基因（scramble) 的序列或不具有shRNA序列（293T)的对照相比，将Y3，Y4或Y5引入到细胞内，导致YB1的显著 下调（图4Β)。因此，这4个shRNA序列，即Α2，Α5，Υ4和Υ5，被用于随后的研究。
[0238] 通过在含有嘌呤霉素的培养基中培养至少10天，以去除不带有嘌呤霉素标签 shRNA的细胞，携带有shRNA序列，即42 45，￥4，￥5或8(^&1111316的用于44￥生产的生产细胞被 建立。对于每一条shRNA序列，生成多达7个独立的敲减细胞系，其用于生产AAV载体。为尽量 减少偏差，AAV载体从含有超过5000万个细胞的直径15cm平皿且同时地来自在相同条件下 培养的敲减和对照细胞系中生产，和随后使用实时PCR定量AAV载体的AAV基因组效价。
[0239] 如图5所示，相对于对照shRNA scramble，将shRNA序列YB1_Y4引入到生产细胞系 导致AAV2载体基因组效价高达50倍的提高（图5A)和AAV8载体基因组效价高达10倍的提高 (图5B)，而相同的Y4shRNA序列对AAV5生产无显著影响(数据未显示）。这表明AAV的三种血 清型之间的内在差异。尽管敲减细胞内YB1表达减少持续了 80天，Y4的最大效果仅仅在已经 培养了20-40天的生产细胞内得到（图5A)。在AAV8生产细胞内也观察到了类似的时间依赖 性模式（图5B)。
[0240]图6显示了在已经从冷冻储存复苏且已经培养了 20-80天的7个批次敲减细胞中 YB1显著下调，表明了批次间的相似性和YB1敲减细胞的持续性。
[0241] 图7显示了当将shRNA病毒用量从5ml/105cells提高到100ml/10 5cells时，YB1下调 程度(deregulation)略有增加（图7A)，当使用50ml含有shRNA的病毒时，可观察到载体基因 组效价达到最大（图7B)，表明了当提高含有shRNA的病毒的量时，对载体生产的饱和和潜在 的毒性效果。
[0242] 慢病毒传送系统也被用于筛选10个shRNA序列，即分别靶向NCL和NPM1基因的N1至 N5和N6至N10,因为它们对NCL和NPM1表达的效果。
[0243] 图8A显示了，当与两个或含革E1向非哺乳动物基因的scramble shRNA(scramble)或 不含任何shRNA序列（293T)的对照细胞相比时，将shRNA序列NPM-N6至NPM-N10(SEQ ID N0s:4至8)导入到细胞实现了NPM1表达显著下调。在所测试的5个序列之间，shRNA NPM-N6 和NPM-N9(图8A，圈出的）显示了最明显的基因敲减，从而将其选出用于随后的研究。在嘌呤 霉素筛选培养基中（图8B)以及在冷冻储存复苏的敲减细胞中（图8C)培养后，NPM1-N9和 NPM1-N6敲减细胞中NPM1表达的减少维持超过80天。
[0244] 靶向NCL基因，NCL-N1 至NCL-N4(SEQ ID N0s:9to 12)的4个shRNA序列显示出NCL 表达部分减少，其中NCL-N1和NCL-N4具有更好的效果（图9A，圈出的）从而被选出用于随后 的研究。在嘌呤霉素筛选培养基中培养之后（图9B)和在冷冻储存(数据未示出）之后，NCL-N1和NCL-N4对NCL表达的敲除效果也维持超过80天。
[0245] 图10显示了具有shRNA NPM1-N9的NPM1的下调导致了AAV2/GFP载体基因组效价提 高了多达35倍（图10A)，AAV8/GFP提高了多达30倍（图10B)，表明了NPM1蛋白在AAV生产中的 重要作用。NPM1对AAV2/GFP (图10A)和AAV8/GFP (图10B)载体基因组效价的上调作用显示出 时序变化，在培养约40天时在敲减生产细胞内观察到提高多达30倍的最大的效果，并在生 产细胞内基因敲减之后持续多达90天。
[0246] NCL的下调显示了对AAV2载体生产的相似的上调效果，将AAV2基因组效价提高了 多达40倍。然而，在不同批次生产细胞之间存在着从2-40倍的显著的差异（图11A)。与AAV2 相比，NCL基因敲除对AAV5和AAV8基因组效价具有较小的上调效果(最多10倍提高）（分别图 11B和11C)。从NCL敲除生产细胞中没有观察到显著的时序性变化(数据未示出）。
[0247] 实施例6YB1的CRISPR敲除
[0248] CRISPR基因组编辑可作为shRNA的替代并用于敲除或敲减YB1的表达。本研究使用 的gRNA序列使用CRISPR/Cas9程序(https: //chopchop .re · fas .harvard, edu/)设计，革巴向 包含YB1基因序列的整个智人1号染色体序列(基因登录号从：_000001.11)。4对gRNA序列(A、 B、C和D)(表4)被选择，并使用GeneArt CRISPR核酸酶载体试剂盒(Life technology，cat number A21174)生成YBlgRNA敲除生产细胞。
[0249] 对于4个CRISPR gRNA序列A、B、C或D的每一个，均生产两个批次(B1和B2)的CRISPR gRNA敲除细胞。单细胞克隆(Cl至C5)进一步来自每个gRNA对的亲代B1和B2gRNA生产细胞。 无任何gRNA序列的亲代293T细胞(293T)被用作对照；管家基因 GAPDH进一步用于样品标准 化内参。
[0250] 表4YB1CRISPR gRNA对
[0251]
[0252] 在总共10个单细胞克隆中观察到YB1基因敲除。图12显示了使用这3个gRNA对对 YB1表达的影响。标记293的条带指的是293亲代细胞系。B1和B2是在单细胞克隆之前生成的 批次敲除细胞。C1至C5为由批次敲除细胞生成的单一性克隆。
[0253] 如图12清楚所示，gRNA对A显著抑制YB1在单克隆细胞系C1中的表达;gRNA对B显著 抑制YB1在批次敲除细胞B2中和单克隆细胞系C1至C4中的表达，并且明显抑制YB1在批次敲 除细胞B1中的表达;gRNA对C显著抑制YB1在批次敲除细胞B2和单克隆细胞系C2至C4中的表 达，以及明显抑制YB1在单克隆细胞系C1和C5中的表达。
[0254] 实施例7YB1敲减生产细胞的分子分析
[0255] 为了了解YB1影响AAV生产的分子机制，YB1敲减细胞中AAV2蛋白（Rep and Cap)表 达和载体DNA产量被系统性分析。图13A示出了在瞬时转染24和72小时之后，在YB1敲减细胞 中rep基因表达相比于scramble细胞的分别提高了 12倍和4倍，表明天然YB1对rep基因表达 的负面影响。相反，在YB1敲减细胞内总AAV2衣壳蛋白的产量（1.29 ±0.2x 1014capsids/ 108cells)，相比于scramble细胞内的（8·87±0· lx 1014capsids/108cells)降低了7倍（图 13B)，表明了天然YB1的存在对于cap基因表达是有利的。进一步的，在收获的载体样品中衣 壳蛋白的量在丫81敲减细胞(6.27±0.3义10 13〇&口81(18/108〇6118)和8(^&1111316细胞(6.77± 0.2x 1013capsids/108cells)之间是可比的（图13B)，表明了载体衣壳颗粒形成可能是独立 于细胞内所生产的衣壳蛋白的量，而且对细胞内将要形成的颗粒数目存在有限制。
[0256] 使用实时qPCR对DNA整合进行系统性分析，靶向U6序列用于YBlshRNA的整合，以及 分别靶向rep和CMV启动子序列用于AAV2包装质粒pRep/Cap和phrGFP的整合。在YB1敲减细 胞内检测到1.3±0.17x 108拷贝/108cellS的YBlshRNA序列，相当于在YB1敲减细胞集群中， 平均每个细胞含有一拷贝的YBlshRNAaAAV包装质粒pRep/Cap和phrGFP的整合在scramble 和YB1敲减细胞之间是可比的，每108个细胞~2x 107拷贝Rep/Cap和~3x 107拷贝phrGFP。
[0257] 为分析YB1基因敲减对AAV2载体DNA生产的影响，（1)包括包装和未包装载体DNA的 总载体DNA，（2)未包装的载体DNA，和(3)包装载体DNA，在AAV包装质粒瞬时转染72小时之后 YB1敲减细胞内，使用靶向载体特异性的CMV序列的qPCR系统性地定量上述3种拷贝数。通过 用benzenase去除质粒DNA，在样品冻融之后去除细胞膜和细胞核，用蛋白酶K分解AAV衣壳 以便从衣壳内释放包装的载体DNA，制备总载体DNA。非整合的载体质粒DNA也可增加细胞质 内总载体DNA拷贝数;然而，考虑到转染和生产过程是平行进行的，且对于YB1和scramble细 胞是相同的，细胞质内质粒DNA的量同样也应是可比的且不会显著改变相对总载体DNA产量 的计算。图13(：示出了￥81敲减生产细胞内（1.93±0.08110 13(3(^丨68/108〇6118)总载体0嫩 (+PK)的拷贝比scramble细胞内（1 ·46±0 · 5x 1012copies/108cells)的高约13倍，表明了 YB 1基因敲减促进了载体DNA生产。
[0258] 除了没有蛋白酶K处理(-PK)以便从AAV衣壳释放包装的载体DNA之外，用与制备总 DNA样品相似的方法来制备未包装的AAV2载体DNAJB1敲减细胞内（2.02±0.5x 1012copies/108cells)未包装的载体DNA拷贝比scramble细胞内（2·61 ±0 ·8x 10ncopies/ 108ce 11 s)(未包装DNA，图13C)的高约8倍。代表实际载体基因组效价的包装AAV2载体DNA被 制备，添加了DNAse I处理(+DNAse I)以便去除细胞质内未包装的载体DNA，随后蛋白酶K处 理(+PK)以从衣壳中释放包装的载体DNA。在YB 1敲减细胞内包装的载体DNA(+DNAse I/+PK， 图13〇的拷贝（7.97±0.5叉101()(3〇口168/108。6118)比8(^&1111316细胞内的（2.16±0.3叉 10 1()C〇pieS/108CellS)高4倍（图13C)。应当注意的是，在这系列特定的分子研究中，我们观 察到与scramb 1 e细胞内相比在YB1敲减细胞内的AAV2载体基因组效价提高了 4倍(显著的）。
[0259] 综上所述，在总载体DNA(13倍提高）、未包装载体DNA(8倍提高）和包装的载体DNA (4倍提高）中倍数变化的显著差异预示了YB1生产系统内AAV载体DNA包装的改进潜能。此 外，考虑到与scramb 1 e细胞相比，YB1敲减细胞的同一批次的收获载体样品的衣壳蛋白的量 是可比的（图13B)，但是包装DNA的拷贝（图13C)提高了4倍，这结果显示了YB1基因敲减在减 少AAV产物内空颗粒数目中具有相当大的优势。
[0260]
[0261] 本发明人已经首次论证了 YB1在AAV载体生产中的重要作用。shRNA序列Y4可靶向 并下调YB1基因，将其引入到AAV生产细胞会导致AAV2和AAV8载体基因组效价分别提高多达 50倍和10倍。YB1敲减细胞的分子鉴定表明了与scramble细胞相比，YB1敲减细胞内rep表达 增加了~12倍，载体DNA生产增加了~13倍，和cap表达降低了~7倍，揭示了 YB1基因在AAV 生物学中的显著作用。
[0262] YB1是参与几乎所有的DNA和mRNA依赖性过程的DNA和RNA结合蛋白。YB1包装并稳 定mRNA，以在不同水平介导基因调控。YB 1结合双链DNA(dsDNA)和单链DNA(ssDNA)，但其对 ssDNA具有极高的结合亲和力。已经被提出，YB1通过在启动子区域稳定ssDNA或提高序列特 异性方式来防止激活蛋白的结合。特别是，YB1对ss-DNA基序(motif)GGGG(TT)具有最强的 结合亲和力。AAV2ssDNA基因组的分析显示，该单链GGGG(TT)基序存在于AAV2基因组(NCBI sequence NC_001401.2)中AAV2ITR区域内的137到142位核苷酸，表明了对YB1蛋白的潜在 的AAV DNA结合位点。ITR缺失突变表明，20个核苷酸的D序列（从核苷酸126-146位），其覆盖 了单链GGGG(TT)基序并紧跟在125个核苷酸长发夹之后，是AAV DNA基因组的衣壳化所必需 的，并因而被提出是AAV的包装信号;特别是，AAV衣壳蛋白的N末端区域结合到D序列导致了 AAV ssDNA进入到预装配的AAV衣壳内衣壳化。因此，YB1和AAV衣壳均有结合到ITR D序列区 域的能力可致使YB1与AAV衣壳之间产生竞争，从而不利于AAV基因组的衣壳化。
[0263] 本发明人对AAV血清型2(AAV2)的基因组分析已经显示了，GGGG(TT)基序存在于末 端反向重复（ITR)区域内，从 AAV2 基因组（NCBI sequence NC_001401, version NC_ 001401.2GI: 110645916)的137位到142位。这表明了YB1结合到AAV2基因组的潜在结合位 点。本发明人已经生成了 AAV5和AAV8血清型的嵌合形式，其包括AAV2ITR(但分别具有AAV5 和AAV8衣壳蛋白）。因此，假如GGGG(TT)基序是YB 1唯一的结合位点，可以预料的是YB 1将对 AAV2以及AAV5与AAV8的嵌合形式的病毒颗粒生产具有相似的效果。然而，本发明人已经论 证了相比于scramble对照，在YB1敲减细胞内生产的AAV2、AAV5和AAV8载体之间的AAV载体 效价存在着显著差异。特别是，本发明人已经发现在YB1敲减的生产细胞内，相比于AAV8效 价提高了 1 〇倍以及AAV5效价没有显著提高，AAV2载体效价提高了 50倍。这暗示了 YB 1敲减对 AAV载体产量的效果除了受DNA序列特异性的影响外，可能还受某种AAV衣壳蛋白特异性要 素影响。
[0264]有3个YB1结构域，即A/P，CSD和CTD，它们参与了蛋白-蛋白相互作用。特别是，已知 YB1蛋白与重要的调控蛋白如p53、Akt kinase、hnRNP K和TATA-结合蛋白相互作用。还已知 YB1通过结合到病毒蛋白如HIV TAT、多瘤病毒的大T抗原、丙型肝炎病毒(HCV)蛋白NS3/4A 和流行性感冒核糖核蛋白（RNP)而在许多病毒的复制中起重要作用。事实上，YB1的shRNA敲 减已经显示了导致HCV效价减少高达80%。在这个研究中，发现YB1的敲减不影响病毒蛋白 的表达，也没有影响病毒RNA的生产和稳定，这表明YB1敲减扰乱了 YBl-NS3/4AvRNA相互作 用复合物的形成，其是病毒装配中招募核心蛋白所必须的。
[0265] YB1在腺病毒复制中的作用与理解本发明人的发现-特别相关，YB1下调显著提高 了 AAV产量，多达50倍。在腺病毒感染细胞中腺病毒蛋白E1B与YB1的相互作用已经显示导致 了细胞核内YB1累积、E 2A基因被YB1激活以及随后腺病毒DNA复制的启动。YB1的过表达，以 E1独立的形式调整腺病毒E2启动子，不仅仅会引起腺病毒DNA复制还会引起来自E1缺失腺 病毒载体的感染颗粒的产量提高2-3-log。其结果是，YB1的过表达已被进一步利用在基于 腺病毒载体开发和病毒疗法中。
[0266] 迄今为止，没有报道指出YB1和AAV病毒直接关联;然而，AAV生命周期中腺病毒的 作用已被很好记录，这便于理解YB1敲减对AAV载体产量提高背后的机制。本发明实施例使 用的AAV生产系统提供了4个腺病毒元件，即E1、E2A、E4和VA基因，其或在生产细胞内稳定表 达，或从具有AAV辅助功能的质粒瞬时表达。E4区的开放阅读框6对于将单链AAV基因组转换 到双链形式是重要的，该双链形式是DNA复制随后步骤的基础。蛋白E2A在病毒DNA复制中起 关键作用，其通过结合到AAV病毒DNA，启动DNA延伸和从模板中替换延伸链。YB1和E2A均为 DNA结合蛋白（DBP)，但是彼此区别在于其来源，分别是细胞和病毒来源。YB1和E2A对单链 DNA结合的偏好性相当。可能的是，腺病毒E2A在AAV生命周期内对细胞DBP具有主要调节特 性；因此，下调YB1可以减少其竞争性结合到AAV DNA上，导致了E2A-AAV DNA相互作用和AAV DNA复制效率的提尚，并最终提尚了AAV载体基因组效价。该推测可得到观察结果的支持，缺 失AAV辅助组件包括E2A的细胞仍可生产少量AAV颗粒，表明了来自充足但低效的细胞DBP的 较低水平的细胞辅助功能，如YB1在AAV生命周期内。
[0267] 另一方面，腺病毒蛋白E1A-E1B and E2A在激活AAV2p5启动子中起了重要作用，导 致了 AAV2rep基因的转录和表达。之前已被论证，YB1结合到血管内皮生长因子启动子阻遏 了其他转录因子的结合，并导致了转录和翻译的抑制。还被显示，YB1结合到启动子的ssDNA 区域导致了 ssDNA的稳定，从而抑制基因转录和翻译。因此，可能是YB1下调促进了 E2A结合 到AAV2p5启动子，协同促进了在此处所报道的实验中所观察到的AAV Rep基因表达和载体 效价的显著提高。
[0268]本发明实施例显示了 AAV生产中YB1的血清型特异性作用;特别是，YB1敲减可分别 将AAV2和AAV8生产提高50倍和10倍，而对AAV5生产没有显著影响。所研究的AAV载体的3种 血清型，即AAV2、AAV5和AAV8,具有同一的ITR序列，共享潜在的YB1结合基序GGGG(TT)且在 相同腺病毒辅助要素的存在下生产。AAV2和嵌合AAV8载体进一步共享了在Rep/Cap包装质 粒中相同的AAV2rep基因序列。就3个血清型AAV2、AAV5和AAV8载体之间的区别而言，血清型 特异性cap基因序列属于其中一个。AAV2和AAV8衣壳蛋白在其一级序列共享了82%以上的 同源性，在衣壳蛋白结构的总拓扑结构更加相似。AAV2和AAV8衣壳蛋白之间的显著结构差 异位于衣壳表面，并已知与AAV2和AAV8结合到靶细胞的结合特性相关联，而不是参与到衣 壳装配和基因组包装中，进一步证实了 AAV2和AAV8在衣壳装配方面之间的相似性。相反， AAV5是最不同的AAV血清型之一，仅仅与包括AAV2和AAV8的其他血清型共享有~55 %的序 列同源性。AAV5衣壳蛋白独特的结构特征，包括较小的HI和VR-IV loop以及较大的VR-VII， 其位于控制衣壳装配、基因组包装和抗原决定簇的特异性的VP区域内，从而解释了在AAV2 和AAV8载体生产中观测到的差异。在此公开的结果还显示了 YB1基因敲减导致了 rep基因表 达和载体DNA产量分别提高了多达12倍和13倍，以及cap基因表达降低7倍，揭示了 YB1对AAV 载体生产影响的分子机制。
[0269] 另一个显著的差异是AAV5的rep基因，仅仅与AAV2和AAV8载体内AAV2rep基因共享 有58%的同源性。进一步序列分析显示了AAV2和AAV5使用不同的启动子，即分别为对于 AAV2和AAV5的转录和翻译的p5和p7。已经表明，由于p7在rep基因表达中的效率，当与 AAV2p5相比时293细胞内AAV5p7启动子较少依赖于Ad5要素。另一方面，腺病毒蛋白E1A-E1B and E2A在激活AAV2p5启动子中起重要作用，导致了AAV2rep基因的转录和翻译。关于YB1对 细胞和病毒启动子的调控机制已经有很多报道。例如，YB1结合到VEGF启动子阻遏了其他转 录因子的结合，并导致了转录和翻译的抑制。还已经表明，YB1结合到启动子的ssDNA区导致 了 ssDNA的稳定，这也抑制了基因的转录和翻译。因此，有可能是，YB1的下调促进E2A结合到 AAV2p5，这协同促进了我们所观察到的AAV2和AAV8效价的显著提高。
[0270] 考虑到YB1在DNA复制、AAV转录和翻译中的潜在作用，可能YB1下调不仅仅通过降 低YB1与E2A竞争结合AAV2ssDNA如ITR序列导致了AAV DNA的复制的提高，还在AAV2p5启动 子的控制下导致了 Rep and Cap的表达的提高。另外，相比于嵌合AAV2/8Rep/Cap，AAV2/2内 天然AAV2p5启动子在Rep and Cap蛋白表达中可更加有效，引起所观察到的AAV2和AAV8产 量分别提高50倍和10倍。至于AAV5,也可通过与AAV2和AAV8相似的基于竞争的机制，同样的 提高载体DNA的复制;但是，在AAV5p7启动子控制下AAV5Rep/Cap的低水平表达，其较少依赖 于结合的YB1和腺病毒辅助功能，可能限制了额外的AAV载体基因组包装成为完整的AAV5载 体，导致了 AAV载体DNA在生产细胞内的累积。
[0271] 综上所述，本发明人已经使用LC-MS/MS鉴定和使用免疫印迹验证了 YB1与AAV载体 的关联，首次揭露了 YB1基因敲减对AAV载体产量的显著提升。AAV2载体效价的显著提高可 能是由于相比于scramble细胞YB1敲减细胞内rep基因表达和载体DNA生产的显著提高。尽 管没有报道显示YB1直接参与AAV生命周期，可以被推测的是YB1对AAV生产发挥了负面作 用，包括妨碍AAV载体DNA复制。这可以通过以下来调控:与E2A竞争结合到ITR序列和AAV2p5 启动子，通过结合到AAV2p5启动子和通过阻遏激活蛋白如E2A的结合来抑制AAV病毒蛋白 (如AAV rep蛋白）的转录和表达。YB1对AAV的影响可能是腺病毒辅助病毒依赖性的。
【主权项】
1. 转基因生产细胞系，其中与对照生产细胞系相比较，YB1、NPM1和NCL中的至少一种的 表达被调节。2. 权利要求1的转基因生产细胞系，其中与对照生产细胞系相比较，（i)NPMl和NCL; (i i) YB 1 和NPM1; (i i i) YB 1 和NCL或（i v) YB 1、NPM1 和NCL;的表达被调节。3. 权利要求1或2的转基因生产细胞系，其中与对照生产细胞系相比较，YBUNPM1和NCL 中的至少一种的表达被降低。4. 权利要求3的转基因生产细胞系，其中使用CRISPR基因组编辑、双链RNA(dsRNA)、小 干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA或反义RNA来降低YB1、NPM1和/或NCL的表达。5. 权利要求4的转基因生产细胞系，其中使用shRNA降低YB1、NPM1和/或NCL的表达，并 且优选地： (a) 使用包含核苷酸序列SEQ ID N0s:14至18(Y1至Y5)的shRNA降低YB1的表达； (b) 使用包含核苷酸序列SEQ ID N0s:4至8(NPM-N6至NPM-N10)的shRNA降低NPM1的表 达； (c) 使用包含核苷酸序列SEQ ID N0s:9至13(NCL-N1至NCL-N5)的shRNA降低NCL的表 达。6. 权利要求4的转基因生产细胞系，其中使用CRISPR基因组编辑来降低YB1、NPM1和/或 NCL的表达。7. 权利要求6的转基因生产细胞系，其中使用选自SEQ ID N0s:33和34;SEQ ID N0s:35 和36;SEQIDN0s:37和38;和/或SEQIDN0s:39和40的gRNA对来降低YBl的表达。8. 权利要求1至7任一的转基因生产细胞系，其中与对照生产细胞系相比较，表2所列的 一种或多种附加基因和/或蛋白质的表达被调节。9. 权利要求1至8任一的转基因生产细胞系，为人胚胎肾293T细胞系。10. -种生产腺相关病毒(AAV)载体的方法，包括在其中YB1、NPM1和NCL中至少一种的 表达被调节的生产细胞系中培养腺相关病毒。11. 权利要求10的方法，其中在所述生产细胞系中（i)NPMl和NCL;(ii)YBl和NPM1; (iii)YBl和NCL;或（iv)YBl、NPMl和NCL;的表达被调节。12. 权利要求10或11的方法，其中调节YB1、NPM1和/或NCL的表达是降低YB1、NPM1和/或 NCL的表达。13. 权利要求12的方法，其中使用CRISPR基因组编辑、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA (s iRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA或反义RNA来降低YB 1、NPM1和/或NCL的表达。14. 权利要求13的方法，其中使用shRNA降低YB1、NPM1和/或NCL的表达，并且优选地： (a) 使用包含核苷酸序列SEQ ID N0s:14至18(Y1至Y5)的shRNA降低YB1的表达； (b) 使用包含核苷酸序列SEQ ID N0s:4至8(NPM-N6至NPM-N10)的shRNA降低NPM1的表 达;和/或 (c) 使用包含核苷酸序列SEQ ID NOs:9至13(NCL-N1至NCL-N5)的shRNA降低NCL的表 达。15. 权利要求13的方法，其中使用CRISPR基因组编辑来降低YB1、NPM1和/或NCL的表达。16. 权利要求15的方法，其中使用选自SEQ ID NOs:33和34;SEQ ID NOs:35和36;SEQ ID NOs:37和38;和/或SEQ ID NOs:39和40的gRNA对来降低YB1的表达。17. 权利要求10至16任一的方法，其中在所述生产细胞系中表2所列的一种或多种附加 基因和/或蛋白质的表达被调节。18. 权利要求10至17的任一方法，其中与对照方法生产的AAV载体效价相比较，AAV载体 效价提高了至少2倍。19. 权利要求10至18的任一方法，其中与对照方法生产的完整：空A A V载体的比率相比 较，完整:空AAV载体的比率提高了至少20 %。20. 权利要求10至19的任一方法，其中生产细胞系为人胚胎肾293T细胞系。21. 权利要求10至20的任一方法，其中AAV的血清型为AAV2、AAV5或AAV8。22. 可从权利要求1至9的任一生产细胞系或权利要求10至21的任一方法得到的腺相关 病毒(AAV)载体的种群。23. 权利要求22的种群，其中与对照方法生产的种群内的完整：空AAV载体的比率相比 较，所述种群内的完整:空AAV载体的比率提高了至少20 %。24. 权利要求22或23的种群，其中AAV载体为AAV2、AAV5或AAV8血清型载体。
【文档编号】C12N15/86GK105980551SQ201580006117
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2015年1月30日
【发明人】赵媛, 斯蒂法尼·萨库纳内森
【申请人】英国卫生部