专利名称：一种成纤维细胞特异性非病毒载体及其构建和该载体的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种非病毒载体，具体地说是关于一种成纤维细胞特异性非病毒载体及其构建和该载体的应用。
背景技术：
大面积骨缺损是骨科、口腔颌面外科及整形外科领域的一大难题。骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)，特别是其中的BMP-2或BMP-7能促进骨再生和缺损修复。随着分子生物学的发展，ex vivo局部基因治疗方法可将促进骨缺损修复的BMP基因导入基因递送细胞，然后将细胞移植到缺损局部进一步表达，避免了直接局部注射BMP蛋白后蛋白作用浓度难以稳定的问题。目前骨修复基因治疗主要以骨髓基质细胞为基因递送细胞，以病毒载体系统(主要为腺病毒、逆转录病毒和腺相关病毒)为导入系统。
本发明人的研究显示用逆转录病毒载体将BMP-2基因转导入成纤维细胞后，细胞表现出转分化为成骨细胞的能力，而且在动物体内促进骨缺损的修复，但是同时我们也发现逆转录病毒的致瘤性。而采用普通非病毒载体介导BMP-2局部基因治疗，BMP-2在人皮肤成纤维细胞表达水平低，表达时间短，只能在体外表现出微弱的成骨表型，体内未能成骨。
有人研究发现成纤维细胞中I型胶原蛋白α2基因的启动子和增强子调控元件，能特异性地调控下游基因在成纤维细胞中的表达，这和细胞的功能以及所处的微环境中所存在的一些调控蛋白分子有关。在转基因小鼠的研究中发现胶原蛋白启动子和增强子能够使转入的外源基因在成纤维细胞中表达增强。目前这方面的研究主要应用于两个方面一是将这些启动子用于转基因动物和细胞，使得目的基因在动物某些组织或细胞内特异性表达增强，以便于研究这些蛋白或分子在胚胎发育、信号转导及某些生理或病理状态下的的作用等。另一方面主要用于肿瘤基因治疗的研究以解决基因治疗靶向性问题。目前未见用于将成纤维细胞作为基因递送细胞，以非病毒载体为导入系统的基因治疗的研究。
从基因递送细胞来说，骨髓基质细胞是骨系细胞的前体细胞，容易诱导分化，但是骨髓基质细胞从骨髓中提取，取材不易，而且对于许多骨大面积缺损的病人来说，骨髓抽取本身将会引起大的继发性的损伤，不易恢复。成纤维细胞取自皮肤，具有取材容易，体外容易扩增，损伤小，恢复快的优点，但是成纤维细胞作为终末分化细胞，其接受外源基因的能力相对较差。从基因导入的载体系统来说，病毒载体系统虽然转导效率高，但是具有免疫原性强，生物安全性差的缺点。而非病毒载体虽然可以携带大片断DNA，并具有生物安全性好，制备简单等优点，但是其转导的基因表达为瞬时表达，表达时间短，表达效率低，优越性难以体现。
发明内容
本发明的目的在于
(1)提供一种成纤维细胞特异性非病毒载体pcDNA3-CEP-BMP-2；(2)提供一种成纤维细胞特异性非病毒载体pcDNA3-CEP-BMP-2构建方法；(3)提供一种用pcDNA3-CEP-BMP-2表达BMP-2蛋白质的方法；(4)pcDNA3-CEP-BMP-2在制备基因治疗骨缺损药物中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方法来实现的在现有研究结果的基础上，选择人成纤维细胞特异的I型胶原蛋白α2基因的启动子和增强子调控元件，构建含有此种调控元件的、非病毒的BMP-2表达载体，从而增强外源基因BMP-2在人成纤维细胞中特异表达的效率和延长表达时间，使成纤维细胞自身向成骨细胞分化或转分化，并在移植体内后诱导周围细胞向成骨细胞分化或转分化，促进骨修复。一些基因启动子往往有多个增强子调控元件，在不同增强子的调控下，这些基因表现出组织细胞特异性，而在其他表达该基因的细胞中，中心启动子则使基因呈基础水平转录。由于组织或细胞所处的微环境和需要行使的功能各不相同，因此在这些细胞中存在一些特定的基因转录调控蛋白，包括转录因子、反式激活蛋白和阻遏蛋白以及共激活蛋白，这些调控蛋白作用于上述的DNA调控序列，在调控序列的协调作用下，使有些基因的转录活性处于一定的高水平状态。将细胞特异启动子增强子克隆至外源目的基因的上游，可以利用细胞内特定的一些调控蛋白激活载体上的启动子和增强子，增强下游目的基因的表达。这个含有成纤维细胞特异启动子和增强子元件的非病毒载体可以在其他所有将成纤维细胞作为基因递送细胞，以非病毒载体系统为导入系统的局部基因治疗和再生医学目标下应用。
本发明所述的人成纤维细胞特异的非病毒载体是指将I型胶原蛋白α2(COL1A2)的启动子和增强子克隆至普通真核表达载体pcDNA3-BMP-2的的BMP-2上游，构建成pcDNA3-CEP-BMP-2。分别将空载体(pcDNA3)、普通BMP-2表达载体(pcDNA3-BMP-2，简称普通载体)和人成纤维细胞特异的BMP-2表达载体(pcDNA3-CEP-BMP-2，简称细胞特异性载体)转染人成纤维细胞(HDF)和静脉内皮细胞(HVEC)，RT-PCR检测提示I型胶原蛋白α2启动子和增强子确实能提高外源基因BMP-2在成纤维细胞中的表达，而对于上皮细胞则不能提高外源基因的表达。检测转染后人皮肤成纤维细胞分泌BMP-2蛋白，从蛋白水平证明I型胶原蛋白α2启动子和增强子确实能提高外源基因BMP-2在成纤维细胞中的表达，表达持续时间和效率长于普通载体。早期成骨表型碱性磷酸酶含量和活性明显高于普通载体。转染细胞特异性载体的成纤维细胞形成的矿化结节明显多于普通载体，而空载体转染细胞基本上没有矿化结节。这说明与普通载体相比，含I型胶原蛋白α2启动子和增强子的细胞特异性载体能增强HDFs的成骨表型。体内研究说明与普通载体相比，含I型胶原蛋白α2启动子和增强子的细胞特异性载体能增强HDFs的体内促进成骨能力。
本发明中细菌感受态的制备及质粒的细菌转化如下挑取LB平板上的DH5α新鲜菌落单个克隆接种至50ml LB中，37℃摇床振荡培养过夜(250rpm)；次日取0.5ml菌液加至500ml LB中培养至对数期，收集菌液于250ml离心瓶内，冰上放置10分钟至1小时，4℃3000rpm离心10分钟，沉淀细菌；用含10％甘油(v/v)的灭菌水(WB液)洗涤沉淀；4℃ 3000rpm离心30分钟；弃上清，重复上一步；轻轻倒去上清，加入新鲜冰预冷的WB液20ml；轻吹打混匀菌液制备成感受态菌，取200μl为一份分装于预冷的EP管内，现用或-70℃保存备用。
电穿孔细胞转化前，自-70℃取出感受态菌，4℃冰浴融化；加入1μl质粒，混匀；冰上放置10分钟；转入预冷的干净电穿孔样品杯(0.1cm)内，进行电穿孔转化细菌。电穿孔条件300Ω，25μF，2.5kv。电穿孔后立即将样品杯重放置冰上10分钟；然后将混合物加入800μl的SOC培养基内，轻微颠倒混匀；37℃，100rpm温和摇动45分钟；稍离心后，弃去大部分上清，留100μl重悬沉淀，并均匀涂布于含氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，待液体被吸收，倒置平皿，37℃培养12-16小时，挑取转化菌落进行质粒小量制备。
将挑取的菌落接种至5ml含有100μg/ml Amp的LB中，37℃摇床振荡培养过夜(250rpm)；次日取1.5ml菌液，13000rpm离心1分钟；弃上清，加入溶液I，溶液II，溶液III各200μl，充分混匀后，室温15分钟；13000rpm离心5分钟；尽弃上清，加入1/10体积的NaAc和2.5倍体积冰预冷的无水乙醇，4℃ 13000rpm离心30分钟；弃上清，用70％的乙醇快速洗一下沉淀出的DNA，离心，小心吸干上清，以37℃预热的双蒸水50μl溶解DNA。进一步鉴定。
本发明中质粒的大量制备及纯化如下取1ml已扩增的菌液加至100ml LB(含Amp100μg/ml)中，37℃、250rpm摇床培养过夜至对数生长期。4℃6000rpm离心15分钟；弃上清，溶液P1(含RNase A)10ml重悬沉淀，混匀；加入37℃预热的溶液P2 10ml，轻柔颠倒混匀数次；再加入冰预冷的P3 10ml，轻柔颠倒混匀数次；冰浴20分钟；4℃ 20000g离心30分钟；将上清移至预先用缓冲液QBT 10ml平衡过的柱子(QIAGEN-Tip500)上过柱；然后用缓冲液QC 20ml洗柱2次，再用65℃预热的缓冲液QF洗脱质粒，以洁净的高速离心管收集流液；最后加异丙醇3.5ml，4℃ 15000g离心30分钟以沉淀质粒DNA；经75％乙醇洗涤后，用适量双蒸水溶解；260nm测定OD值，鉴定质粒的含量和纯度；适当的限制性内切酶小量酶切，电泳检测。
一种成纤维细胞特异性非病毒载体pcDNA3-CEP-BMP-2，所述的COL1A2启动子-378bp到+52bp的近转录起始位点的启动子与-21.1kb到-18.8kb的一段2.3kb的增强子区域克隆普通真核表达载体pcDNA3-BMP-2上。(含有该载体菌株DH5α/pcDNA3-CEP-BMP-2于2006年5月18日送交位于武汉的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号CCTCC M206050)。
pcDNA3-CEP-BMP-2载体构建包括以下步骤(a)COL1A2增强子连接到pcDNA3；(b)BMP-2基因连接到pcDNA3-CE；(c)COL1A2启动子，连接到pcDNA3-CE-BMP-2得到pcDNA3-CEP-BMP-2载体。
其(a)步骤中COL1A2增强子连接到pcDNA3的Xho I的位点上，其(b)步骤中BMP-2基因连接到pcDNA3-CE的Xba I酶切位点上，其(c)步骤中COL1A2启动子，连接到pcDNA3-CE-BMP-2的BamH I酶切位点上，扩增启动子的上游引物5’-agaggatccgatctgcaaattctgc-3’，下游引物5’-ataggatccgcagtcgtggccagta-3’。
一种BMP-2蛋白质是由下列方法制得(b)构建pcDNA3-CEP-BMP-2载体；(b)用脂质体非病毒的方法转染成纤维细胞。
成纤维细胞特异性非病毒载体pcDNA3-CEP-BMP-2在制备基因治疗骨缺损药物中的应用。
本发明所公开一种成纤维细胞特异性非病毒载体及其构建和该载体的应用，其优点表现在该新型载体既避免了病毒载体的免疫原性、成瘤性等问题，又弥补了普通非病毒载体表达强度不够的缺点，能使成纤维细胞作为基因递送细胞的长处得到发挥，短处得到克服。
在本发明中外源基因为BMP-2，因而该载体促进成纤维细胞介导的成骨，辅以生物材料可能用于骨缺损修复。除了应用于成纤维细胞介导的成骨作用，这一新型载体还可以应用于其他以成纤维细胞为基因递送细胞的基因治疗和再生医学目的，用于促进真皮、肌腱等组织形成。
图1 pcDNA3-CE质粒筛选(lane1及lane6为7.8kb重组质粒，其余lane为空载体)图2酶切鉴定pcDNA3-CE(lane1pcDNA3-CE质粒，lane2DNA marker，lane3Sal I酶切，lane4Kpn I酶切)
图3 pcDNA3-CE-BMP-2质粒筛选鉴定(lane4、5、8、9、10、11、13、15、20、23为插入BMP-2基因的重组质粒)图4 PCR鉴定pcDNA3-CE-BMP-2(lane1pcDNA3；lane2pcDNA3-CE；lane3marker；lane4、8、11、13、23为正向插入的正确的质粒)图5 sph I酶切鉴定pcDNA3-CE-BMP-2(lane1pcDNA3；lane2pcDNA3-CE；lane3-7PCR正确的重组质粒；lane8marker；)图6PCR鉴定pcDNA3-CEP-BMP-2(lane1marker；lane2ddH2O；lane3pcDNA3-CE-BMP-2；lane4pcDNA 3-CEP-BMP-2)图7RT-PCR检测hBMP-2基因的表达((A)HDFs，(B)HVEC；1pcDNA3，2pcDNA3-BMP-2，3pcDNA3-CEP-BMP-2)图8ELISA检测转染后成纤维细胞BMP-2分泌图9酶化学检测转染后成纤维细胞ALP活性图10ELISA检测转染后成纤维细胞骨钙素分泌图11茜素红染色检测转染并经诱导培养后成纤维细胞矿化能力(ApcDNA3，BpcDNA3-BMP-2，CpcDNA3-CEP-BMP-2)图12转染后成纤维细胞移植裸鼠肌肉内8周组织HE染色((A)转染pcDNA3-BMP-2，(B)转染pcDNA3-CEP-BMP-2，HC肥大软骨细胞，M肌肉，F成纤维细胞，B骨组织，C软骨细胞；×10)
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1人成纤维细胞特异性非病毒BMP-2表达载体构建材料真核表达载体质粒pβ-gal-Basic-UE(含collagen 1A2的启动子和增强子)由美国纽约大学Mount Sinai医学院生化和分子生物教研室的Dr.Francesco Ramirez馈赠。
质粒pcDNA3-BMP-2由本室从美国Cambridge遗传研究所Dr Wozney馈赠的质粒pSP65-BMP-2进行亚克隆构建。
限制性内切酶EcoR I，HindIII，Kpn I；Klenow酶(购自Takara公司)；T4 DNA连接酶，CIP酶。(购自Promega公司)方法第一步从质粒pβ-gal-Basic-UE切下2.3kb大小的COL1A2增强子，连接到pcDNA3的Xho I的位点，转化并筛选作Sal I、Kpn I酶切鉴定，正确的克隆(pcDNA3-CE)测序鉴定；第二步将1.6kb大小的BMP-2基因从pcDNA3-BMP-2切下，连接到pcDNA3-CE的Xba I酶切位点，筛选并作PCR鉴定，上游引物CEf5’-aattctgatgatagatt-3’，下游引物BMPr5’-attaaagaagaatcta-3’，正确的克隆(pcDNA3-CE-BMP-2)测序鉴定；第三步用PCR方法从质粒pβ-gal-Basic-UE扩出450bp大小的promotor(启动子)片断，上游引物5’-agaggatccgatctgcaaattctgc-3’，下游引物5’-ataggatccgcagtcgtggccagta-3’，连接到pCDNA3-CE-BMP-2中的BamH I酶切位点，PCR方法鉴定，上游引物为胶原蛋白enhancer序列5’-ttagagggacaatggaagtt-3’，下游引物为promoter序列5’-ataggatccgcagtcgtggccagta-3’，阳性克隆测序鉴定。
结果2.3kb大小的COL1A2 enhancer(增强子)连接到pcDNA3的Xho I酶切位点后形成7.8kb的pcDNA3-CE，质粒筛选后经酶切鉴定并做测序鉴定正确；将1.6kb大小的BMP-2基因连接到pcDNA 3-CE中Xba I酶切位点构建pcDNA 3-CE-BMP-2，质粒筛选，PCR和酶切鉴定后经测序鉴定正确；450bp左右大小的promotor(启动子)连接到pcDNA3-CE-BMP-2的BamH I酶切位点构建形成新的重组载体，我们将其命名为pCDNA3-CEP-BMP-2，经菌落PCR鉴定并测序证实构建正确。CEP代表collagen enhancer and promotor，指人成纤维细胞特异的调控元件，即位于I型胶原蛋白α2(COL1A2)基因近起始位点-378bp到+52bp的启动子区域和远离起始位点-21.1kb到-18.8kb的一段2.3kb的增强子区域。因此pcDNA3-CEP-BMP-2载体是一个将COL1A2的启动子和增强子克隆至普通真核表达载体的BMP-2上游构建而成的人成纤维细胞特异的、非病毒的BMP-2表达载体。
实施例2BMP-2基因在人皮肤成纤维细胞(HDF)和静脉内皮细胞(HVEC)中的表达材料细胞人皮肤成纤维细胞从小儿包皮环切手术废弃物组织法培养扩建，人静脉内皮细胞由本室冻存。
质粒空载体pcDNA3(Invitrogen公司)、普通BMP-2表达载体pcDNA3-BMP-2质粒pcDNA3-BMP-2(由本室从美国Cambr idge遗传研究所Dr Wozney馈赠的质粒pSP65-BMP-2进行亚克隆构建)。、成纤维细胞特异表达载体pcDNA3-CEP-BMP-2。(上述方法构建)方法分别于转染质粒pcDNA3、pcDNA3-BMP-2和pcDNA3-CEP-BMP-2后3、6、9、12天取成纤维细胞和静脉内皮细胞，TE消化，Trizol(购自Invitrogen公司)，裂解细胞，抽提RNA，并做RT-PCR检测，BMP-2上游引物5’-taaaggtcgaccatggtggccg-3’，下游引物5’-ctcttttgtggagaggatgc-3’；扩增片断长度为849bp；G3PDH上游引物5’-accacagtccatgccatcac-3’，下游引物5’-tccaccaccctgttgctgta-3’，扩增片断长度为452bp。
结果在HDF和VEC中，pcDNA3转染均未有BMP-2表达，在HDFs中，BMP-2的mRNA水平在转染pcDNA3-CEP-BMP-2的细胞均要高于pcDNA3-BMP-2，在HVEC细胞中则相反，BMP-2的mRNA水平在转染pcDNA3-CEP-BMP-2的细胞均低于pcDNA3-BMP-2，至第12天，转染pcDNA3-CEP-BMP-2的HVEC细胞已经没有BMP-2的表达，而HDFs中BMP-2表达还可以维持在第9天的水平。说明I型胶原蛋白α2启动子和增强子确实能提高外源基因BMP-2在成纤维细胞中的表达，而对于上皮细胞则不能提高外源基因的表达。
实施例3
ELISA法检测转染后BMP-2蛋白质表达水平材料与方法收集转染pcDNA3、pcDNA3-BMP-2和pcDNA3-CEP-BMP-2后2d、、4d、6d、8d、10d的成纤维细胞上清，根据试剂盒说明检测，酶标仪上读取各孔405nm处的光吸收值(OD405)。据各浓度标准品的OD405得到标准曲线，并据标准曲线算出所测样品中的BMP-2蛋白含量。
结果转染第3天，转染pcDNA3-CEP-BMP-2的成纤维细胞分泌BMP-2蛋白含量为为pcDNA3-BMP-2的1.5倍，在第6天两者没有明显差异，第9天转染pcDNA3-BMP-2的HDFs开始下降，第12天继续下降，而转染pcDNA3-CEP-BMP-2的成纤维细胞则分泌量一直维持至第12天，为空载体的2.3倍。说明I型胶原蛋白α2启动子和增强子确实能提高外源基因BMP-2在成纤维细胞中的表达，表达持续时间长于普通载体pcDNA3-BMP-2。
实施例4转染后成纤维细胞成骨表型检测1.早期指标碱性磷酸酶材料与方法碱性磷酸酶(ALP)是成骨的早期指标，与BCIP/NBT反应产生紫色的溶液。转染后2、4、6、8天的细胞收集裂解，取上清，检测其OD490可反应ALP的活性。
结果酶化学方法检测碱性磷酸酶活性显示转染pcDNA3-CEP-BMP-2后成纤维细胞碱性磷酸酶活性在第2天升高，是空载体的1.5倍，至第4、6天分别为空载体的1.7和2.3倍，而转染pcDNA3-BMP-2的在第2天为空载体的1.1倍，并在第4、6天没有上升。
2.晚期指标骨钙素骨钙素(osteocalcin，OCN)是一种酸性糖蛋白，为骨骼中含量最高的非胶原蛋白，占非胶原蛋白总量的10％～20％。由分化成熟的成骨细胞合成和分泌，主要沉积于骨基质中，与骨钙化密切相关。因为分子中含有依赖维生素K的-羧基谷氨酸残基，故又名r-羧基谷氨酸蛋白(bone-carboxyglutamate protein，BGP)，由于骨钙蛋白主要在矿化形成期出现，故被认为是成骨细胞向矿化发生期即晚期分化的重要标记之一。
材料与方法将转染后人皮肤成纤维细胞用诱导培养基(Medium106+50mg/ml ascorbic acid，+10mM β-glycerophosphate+10-7Mdexamethasone)培养，然后检测晚期成骨表型。ELISA法检测培养30天细胞分泌骨钙素(osteocalcin，OCN)含量，酶标仪读取OD450光吸收值(reference filter 650nm)。据各浓度标准品的OD405得到标准曲线，并据标准曲线算出所测样品中骨钙素含量。
结果转染细胞特异性载体的HDFs在第12天OCN即开始升高并维持该水平至30天，而转染普通载体的细胞分泌在第12天升高以后逐渐下降。说明修饰BMP-2的成纤维细胞的体外成骨能力较未修饰BMP-2的成纤维细胞强这说明与普通BMP-2表达载体相比，含I型胶原蛋白α2启动子和增强子的成纤维细胞特异性BMP-2表达载体能增强晚期成骨表型。
3.矿化结节茜素红属蒽醌衍生物，可与钙形成有色鳌和物，将钙染成双折光性的橘红色，其染色深浅代表矿化能力的强弱。
材料与方法茜素红染色检测转染后细胞的矿化能力。
结果茜素红染色检测诱导培养28天细胞矿化能力，结果显示转染细胞特异性载体的成纤维细胞形成的矿化结节明显多于普通载体，而空载体转染细胞基本上没有矿化结节。这说明与普通BMP-2表达载体相比，含I型胶原蛋白α2启动子和增强子的成纤维细胞特异性BMP-2表达载体能增强成纤维细胞的矿化能力。
实施例5裸鼠肌肉内异位成骨模型的建立(人HDFs移植)材料与方法人皮肤成纤维细胞经脂质体转染后第3天，胰蛋白酶消化，600rpm离心，，无血清Medium106重悬，按每只裸鼠5×106个细胞注射入裸鼠后大腿肌肉内。实验分为2组第1组为pcDNA-BMP-2组20只，另一组为pcDNA-CEP-BMP-2组20只，于注射2、4、6、8、10周分别拉颈处死，各时间点处死4只。取注射部位肌肉4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，HE染色。
结果转染pcDNA3-CEP-BMP-2的HDFs移植入裸鼠后大腿肌肉内，8周后在成纤维细胞团周围出现成熟的或肥大的软骨细胞以及骨组织。由于所形成的骨组织较小，X-Ray检测未见到钙化区，故我们将肌肉组织未经脱钙便进行包埋检测，所以骨组织结构不够完整清晰。共有5％小鼠肌肉内发现异位成骨。而转染普通载体的成纤维细胞移植后周围只能看到少量软骨细胞，没有骨组织。
权利要求
1.一种成纤维细胞特异性非病毒载体pcDNA3-CEP-BMP-2(含有该载体菌株DH5α/pcDNA3-CEP-BMP-2保藏编号CCTCC M 206050)，其特征在于所述的C0L1A2启动子-378bp到+52bp的近转录起始位点的启动子与-21.1kb到-18.8kb的一段2.3kb的增强子区域克隆至普通真核表达载体pcDNA3-BMP-2上。
2.根据权利要求1所述的pcDNA3-CEP-BMP-2载体的构建，其包括以下步骤(a)C0L1A2增强子连接到pcDNA3；(b)BMP-2基因连接到pcDNA3-CE；(c)C0L1A2启动子连接到pcDNA3-CE-BMP-2得到pcDNA3-CEP-BMP-2载体。
3.根据权利要求2所述的pcDNA3-CEP-BMP-2载体构建，其(a)步骤中C0L1A2增强子连接到pcDNA3的Xho I的位点上。
4.根据权利要求2所述的pcDNA3-CEP-BMP-2载体构建，其(b)步骤中BMP-2基因连接到pcDNA3-CE的Xba I酶切位点上。
5.根据权利要求2所述的pcDNA3-CEP-BMP-2载体构建，其(c)步骤中C0L1A2启动子连接到pcDNA3-CE-BMP-2的BamH I酶切位点上，扩增启动子的上游引物5’-agaggatccgatctgcaaattctgc-3’，下游引物5’-ataggatccgcagtcgtggccagta-3’。
6.一种BMP-2蛋白质是由下列方法制得(a)构建权利要求1所述的pcDNA3-CEP-BMP-2载体；(b)用脂质体非病毒的方法转染成纤维细胞。
7.成纤维细胞特异性非病毒载体pcDNA3-CEP-BMP-2在制备基因治疗骨缺损药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种成纤维细胞特异性非病毒载体及其构建和该载体的应用，本发明将成纤维细胞特异表达的I型胶原蛋白启动子与增强子克隆至目的基因上游构建成成纤维细胞特异性的载体，用脂质体非病毒的方法转染成纤维细胞，利用成纤维细胞特有的调控I型胶原蛋白转录表达机制，增强外源基因在成纤维细胞中的表达，使得成纤维细胞成为较为理想的基因递送细胞，同时避免了病毒载体的不安全性和较高的免疫原性。
文档编号A61K48/00GK1896247SQ20061002677
公开日2007年1月17日 申请日期2006年5月22日 优先权日2006年5月22日
发明者易静, 王茸影, 邹嫣琼, 王英 申请人:上海交通大学医学院