专利名称：一种植物dna病毒侵染性载体构建方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种植物DNA病毒侵染性载体构建方法。
背景技术：
植物病毒侵染性载体是研究病毒功能基因组的至关重要的平台，在分子生物学水平上研究病毒基因组结构与功能以及寄主与病毒之间的互作，必须要获得病毒的侵染性克隆，在此基础上才能获得野生型分子或者突变型分子的均一群体，进而利用DNA重组技术进行突变、缺失、插入、置换以及互补实验对病毒基因组进行功能区域的定位，从而能在寄主植物表型水平上反映和评价基因功能的表达。该技术是深入研究病毒的基因功能以及病毒与寄主植物互作的有效手段，该技术首先在噬菌体病毒Qβ(Taniguchi 1978)，脊髓灰质炎病毒(Racaniello 1981)中获得成功，植物RNA病毒是1983年在雀麦花叶病毒(bromemosaic virus，BTV)(Ahlquist 1983)上首次获得侵染性cDNA克隆，而植物DNA病毒的侵染性克隆是1982年在番茄金色花叶病毒(TGMV)上通过磨擦接种的方法首次构建成功的。虽然该技术产生较迟，但是发展却是极为迅速，现已作为前沿技术被广泛应用于各个领域，除了用于病毒基因组结构、功能和表达调控机制研究以外，它还被应用于其它两个非常重要、有潜力的领域。一个是利用病毒载体进行外源蛋白表达。通过转基因的方法表达外源蛋白，工作量大，周期性长，获得的外源蛋白浓度低，而植物病毒一般都具有很强的繁殖能力，并且构建简易，周期性短，是一种理想的工具载体。另外一个是利用病毒诱导的基因沉默进行功能基因组研究，近几年的最新研究发现，在生物界RNA存在一种Guiding的机制，它能够形成dsRNA，并能够特异性的降解其同源序列，利用这一机制，在病毒载体上插入植物的一段同源基因就可沉默植物中的基因，从而通过正向遗传学的方法研究植物的功能基因组。植物病毒是一种非常理想的模式，其基因组小，结构简单，易于分子生物学操作，而植物DNA病毒基因组稳定的特性相对于RNA病毒更优于分子生物学的操作以及外源蛋白表达载体的应用。本发明以粉虱传双生病毒中国番茄黄化曲叶病毒为材料来建立侵染性载体构建的方法。
粉虱传双生病毒(whitefly-transmitted geminivirus，WTG)是世界范围内广泛发生的一类植物单链DNA病毒，病毒基因组大部分是双组分(DNA-A和DNA-B)，DNA-A和DNA-B基因组大小2.5-3.0kb，DNA-A和DNA-B序列之间有一非常保守的共同区，如番茄金花叶病毒(tomato golden mosaic virus，TGMV)，非洲木薯花叶病毒(Africa cassava mosaic virus，ACMV)，菜豆金花叶病毒(Beangolden mosaic virus，BGMV)，还有一些病毒是单组分，并且单组分足以引发病毒的成功侵染和致病症状，如番茄黄花叶病毒(tomato yellow mosaicvirus，ToYMV)，番茄花叶病毒(tomato mosaic virus，ToMV)。近年来，在单组分双生病毒上发现一种新型的卫星DNAβ分子，该分子大小约为DNA-A的一半，DNA-A必需依赖与这个新型的卫星分子DNAβ才能在寄主上引发典型的症状。本发明的侵染性构建过程中涉及这一新型的卫星DNA分子。
纵观双生病毒侵染性载体构建的历史发展，主要有三种方法1.磨擦接种法；2.基因枪法；3.农杆菌注射法。磨擦接种法只适用于能够机械传染的病毒，而大部分双生病毒都不能经过磨擦接种而侵染寄主植物，因此这一方法存在很大的局限性。使用基因枪法时，构建克隆简易，但高度依赖于实验设备，并且每次基因枪轰击所耗金粉的费用昂贵，这在大规模实验时将收到成本太高的限制。使用农杆菌注射法，首先在dsDNA病毒中的花椰菜花叶病毒中成功应用(Grimsley 1986)，并逐渐被应用于双生病毒，它是一种简易，有效的方法，但是已往所用的植物表达载体复制量低，不易进行分子生物学操作，本发明基于中国黄化曲叶病毒基因组DNA-A和新型卫星分子DNAβ，对这一方法进行了改造。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物DNA病毒侵染性载体构建方法。
植物DNA病毒侵染性载体构建方法，其步骤为1)从中国云南地区收集双生病毒的样本，提取基因组总DNA；2)以植物基因组总DNA为模板，设计简并引物对双生病毒的两个组分(DNA-A和DNAβ)进行PCR扩增，扩增产物克隆至T-Vector；3)对克隆产物进行阳性克隆的筛选并进行序列测定；4)序列测定结果通过DNA分析软件进行组合、拼接，获得DNA-A组分和DNAβ组分的全长基因组序列；5)在序列测定的基础上，利用Overlap-PCR和限制性酶切的方法把DNA-A组分的1.7个重复的基因组构建到改良型植物表达载体上，获得带有DNA-A组分的重组植物表达载体，并将其导入大肠杆菌细胞；
6)使用5)中相同的方法把两个正向重复的DNAβ组分构建到改良型植物表达载体上，获得带有DNAβ组分的重组植物表达载体，并将其导入大肠杆菌细胞；7)通过三亲交配的方法把大肠杆菌细胞中的带有DNA-A组分的重组植物表达载体和带有DNAβ组分的重组植物表达载体导入具有较强感染能力的农杆菌菌株EHA105；8)重组载体导入农杆菌菌株以后，带有DNA-A和DNAβ的农杆菌接种5ml YEP液体培养基28℃培养以进行侵染性测定；9)侵染性测定时，试验植株选用4-6叶充分展开的苗龄期的植株为宜，接种组合为单DNA-A接种，单DNAβ接种和DNA-A+DNAβ接种；10)接种时，取1ml一次性针筒吸取农杆菌菌液对植株进行伤口感染，接种的具体方法和部位在距离根部1-2cm处取三点进行韧皮部注射，或在叶片的叶柄处取三点进行注射，或在上部嫩叶背部用带有菌液的针头对叶脉产生伤口使菌液进入植株体内；11)接种植株置于25℃隔离温室培养，10-30dpi后观察接种植株的症状；12)对出症状和没有出症状的植株进行ELISA、PCR和Southern Blot检测以鉴定其侵染性。
本发明的优点1)构建双生病毒侵染性载体需要构建1.3-2.0个重复以上的基因组克隆。抽提总DNA进行氯化铯离心纯化提取大量scDNA并进而酶切得到全长基因组是一种构建两个重复的可行的策略，但这种方法需要大量的样品，对于不能机械传播的双生病毒来说，进行病毒毒源的扩繁是一重大障碍，本发明使用Overlap-PCR和酶切的方法对不同的克隆进行拼接，拼接组合，可以得到任何1.3-2.0个重复以上的病毒基因组克隆；2)传统的农杆菌介导法使用pBinl9，这个载体复制量小，加上本身质粒大，对其进行重组克隆时不易操作，本发明使用对其复制起始位点经过改良的改良型植物表达载体pBinPLUS，其复制量大大加强，并且感染植物的效率也大大加强。在这个改良型载体上也可以直接进行简单方便的操作；3)常规农杆菌介导法的宿主细胞对植物的感染能力较低，本发明使用对植物细胞转移能力大、侵染能力强的农杆菌菌株；4)磨擦接种法仅限于机械传播的病毒；基因枪法受设备和资金的限制，以及病毒轰入植株后发病率不高；本发明采用改良型农杆菌介导的方法，构建方法简易，不受严格条件的限制，接种方法简单、侵染性强、发病率高、应用性广；5)本发明使用的方法可以通过突变，缺失，插入，置换以及互补进行病毒基因组结构、功能和表达调控机制研究；6)本发明使用的方法可以对构建的载体进行药物蛋白基因的插入，进行植物反应器生产药物蛋白的研究；7)本发明使用的方法可以对构建的载体进行植物内源基因cDNA片段的插入，以进行病毒诱导的基因沉默的植物功能基因组研究。
具体实施例方式
本发明以粉虱传双生病毒(whitefly-transmitted geminivirus，WTG)中国番茄黄化曲叶病毒云南红河Y10分离物为材料进行侵染性载体的构建，中国番茄黄化曲叶病毒病毒基因组有两个组分，DNA-A和一个新型的卫星分子-DNAβ，DNAβ基因组大小是DNA-A分子的一半，与DNA-A没有序列同源性。DNA-A和DNAβ在寄主体内是一种互补的关系，DNA-A能够系统侵染植株，但是单独不能引发典型的症状，只有当DNAβ存在时，植株才能引发典型的严重的致病型，并且DNAβ能够大大促进DNA-A的基因组的含量，而DNAβ不能独立复制，它必须依赖于DNA-A复制。本发明对中国番茄黄化曲叶病毒云南红河Y10分离物DNA-A和DNAβ的全序列进行了克隆和测序，在序列测定的基础上，设计引物分别把1.7个copy的全长基因组DNA-A和两个copy的全长基因组DNAβ克隆到高复制量的植物表达载体上，通过农杆菌注射的方法使病毒基因组进入植物细胞并开始自行复制，从而实现病毒对植物的高效感染。
实施例1中国番茄黄化曲叶病毒云南红河Y10分离物DNA-A组分和DNAβ组分基因组全序列的克隆和测定1.植物总DNA的抽提称取0.5-1g双生病毒发病叶片，加液氮研磨至粉末状，加入15ml抽提Buffer(100mM Tris.Cl pH8.0，50mM EDTA pH8.0，500mM NaCl，临用前加入β-巯基乙醇2.3μl/ml)，继续研磨，转移至50ml离心管所有样品保持在4℃。加入1ml20％SDS，温和地颠倒混匀，65℃温浴10min。加入5ml 5M KAc，温和地颠倒混匀，冰上放置20分钟。4000rpm离心30分钟，上清液经纱布过虑倒入预冷的15ml异丙醇的50ml离心管中，混匀，-20℃放置30min(或-80℃放置10min)。13000rpm离心15min，弃上清，沉淀用0.75ml TE溶解(50mM Tris-Cl pH8.0，10mMEDTA)，并转移至1.5ml离心管，加入15μl 1μg/ml的RNase，37℃温浴30min。14000rpm离心10min，上清夜倒入含0.75ml预冷异丙醇的1.5ml离心管中，加入75μl 3M NaAc pH5.2，-20℃放置30min(或-80℃放置10min)。13000rpm离心15min，用70％乙醇洗沉淀.待酒精完全挥发后，溶于300μl TE。
2.PCR扩增、克隆以及全基因组序列测定和分析以中国番茄黄花叶病毒云南红河分离物总DNA为模板，以简并引物PA(5’-TAATATTACCKGWKGVCCSC-3’)和PB(5’-TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA-3’)对DNA-A组分进行PCR扩增，反应参数为94℃ 3min；94℃变性45sec，48℃退火1min，72℃ 1.5min，35个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物经QiaGen胶纯化Kit回收后克隆至pGEM-TEasy Vector，阳性克隆经PCR或酶切鉴定进行序列测定和分析，在序列测定和分析的基础上设计另一对全长引物Y10V/F(5’-TCGCCGGCTGAACTTCGACAG-3’)和Y10V/R(5’-ATGTCGAAGCGTCCCGCAGAT-3’)进行扩增，PCR产物为约2.7kb的条带，经QiaGen胶纯化Kit回收后克隆至pGEM-T Easy Vector，获得阳性克隆pGEM-T-DNA A，但是克隆pGEM-T-DNA A缺少几十个碱基，并不是一个完整的全长，对这个克隆进行序列测定并用DNAstar的Seqman对不同克隆进行拼接得到Y10 DNA-A的全长序列共2737bp。同样以中国番茄黄花叶病毒云南红河Y10分离物总DNA为模板，以Newbeta01(5’-GGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC-3’，含Kpn I位点)与beta02(5’-GGTACCTACCCTCCCAGGGGTACAC-3’，含Kpn I位点)为引物，对DNAβ全长基因组进行PCR扩增，PCR产物克隆至pGEM-T Easy Vector，获得一个全长copy的克隆pGEM-T-β(New)对其进行序列测定，获得DNAβ的全长基因组序列1336bp。
实施例2 中国番茄黄化曲叶病毒云南分离物DNA-A和DNAβ侵染性载体的构建a.DNA-A组分侵染性克隆的构建双生病毒的农杆菌介导的侵染性克隆需要1.3-2.0个重复以上的全长基因组，并且必须包括共同区。以全长DNA-A克隆为模板，以FL/F(5’-CGTCGACACCTGTTTGGGGATATGAGAT-3’)与PL/R(5’-TGAGCTCGTATTAGTCATAGAGGGTGATAG-3’)为引物，PCR产物克隆至pGEM-T Easy Vector，获得pGEM-T-Vector-PL，用Sal I和EcoR I进行酶切后回收约2kb条带插入农杆菌载体pBinPLUS相应位点，得到0.7个全长的克隆pBINplus-PL。另外一个DNA-A的全长copy来自于对同向插入的pGEM-T-Vector-DNA A和pGEM-T-PL的拼接，用Bam H和Sac I对pGEM-T-PL进行酶切，回收约1.8kb片段后与用相同酶切的pGEM-T-Vector-DNA A连接，得到的克隆用EcoR I就可获得一个copy的全长基因组DNA并插入pBinPLUS-PL的相应位点，从而获得1.7个拷贝的pBinPLUS-PL+FL克隆(DH5α)。b.DNAβ侵染性克隆的构建以Y10总DNA为模板，以Old Beta01(5’-GGTCACTACGCTACGCAGCAGCC-3’，)与beta02进行PCR扩增，PCR产物插入pGEM-T Easy Vector，获得克隆另一个全长基因组copy的pGEM-T-β(Old)。用KpnI对pGEM-T-β(New)酶切得到1.3kb全长基因组插入pGEM-T-β(Old)的相应位点，获得pGEM-T-2β，用EcoR I对pGEM-T-2β进行酶切切下两个copy的DNAβ，插入农杆菌载体pBinPLUS的EcoR I位点，从而获得在pGEM T-Vector上的两个DNAβ全长基因组的侵染性克隆pBinPLUS-2β(DH5α)。
实施例3.重组载体对农杆菌的转化植物表达载体的转化是通过三亲交配的方法进入农杆菌宿主细胞，植物表达载体pBinPLUS需要通过辅助质粒pROK2013的介导才能进入农杆菌EHA105。pBinPLUS-PL+FL(DH5α)接种5ml含Km(50mg/ml)LB液体培养基，37℃条件下200rpm过夜培养；EHA105接种5ml含Sm(50mg/ml)YEP液体培养基，28℃下200rpm培养48小时；辅助质粒pROK2013接种5ml含Km(50mg/ml)LB液体培养基，37℃条件下200rpm过夜培养。各取400μl pBinPLUS-PL+FL(DH5α)，EHA105，pROK2013菌液，颠倒混匀后，6000rpm 30秒收集菌液，收集的菌体用200μl ddH2O悬浮，用玻璃涂棒涂布于没有抗性的YEP固体培养基平板进行三亲交配，28℃培养24小时后，用玻璃涂棒在生长出来的菌斑上蘸一下，随即连续涂布三块含有Km(50mg/ml)和Sm(50mg/ml)的YEP固体培养基平板，以此得到含有pBinPLUS-PL+FL的EHA105的单菌落，长出单菌落后用特异性引物对其进行PCR鉴定，获得重组农杆菌pBinPLUS-PL+FL(EHA105)。同样方法，pBinPLUS-2β(DH5α)也通过三亲交配的方法导入农杆菌EHA105，从而获得农杆菌介导的具侵染能力的pBinPLUS-2β(EHA105)克隆。
实施例4.农杆菌注射接种pBinPLUS-PL+FL(EHA105)和pBinPLUS-2β(EHA105)分别在5ml含Km(50mg/ml)和Sm(50mg/ml)的YEP液体培养基培养，28℃下200rpm振荡48小时。接种时分为三组接种单DNA-A接种、单DNAβ接种和DNA-A+DNAβ接种。DNA-A+DNAβ接种时，等量混合pBINplus-PL+FL(EHA105)和pBINplus-2β(EHA105)菌液。接种植株选用4-6叶充分展开苗龄期为宜。DNA-A，DNAβ和DNA-A+DNAβ分别接种本氏烟，心叶烟，三生烟，番茄，黄瓜，辣椒和菜豆。具体接种方法如下，取一支1ml的一次性注射器，吸取菌液，在距离根部1-2cm处取三点进行韧皮部注射，或在植株叶柄处取三点进行韧皮部注射，或在上部嫩叶背部用带有菌液的针头划数下，接种植株置于25℃隔离温室培养。
实施例5.双生病毒侵染性克隆的侵染性测定接种植株进行症状观察，对出症状或未出症状的植株都进行EILSA和PCR检测，如果PCR也为阳性，则进一步进行Southern Blot检测。症状观察表明，在本氏烟上，单DNA-A接种的植株几乎没有症状，而Southern Blot在上部叶片上能够检测到病毒基因组，说明单DNA-A接种能够系统侵染，但是并不引发典型的在田间观察到的曲叶症状。单DNAβ接种的植株没有出现症状，上部叶片也没有检测到DNAβ，说明DNAβ并不能独立复制。当DNA-A与DNAβ两个组分一起接种的时候，10dpi后，上部叶片开始出现下卷，25-35dpi症状发展到顶峰，并出现曲茎，叶片皱缩，植株矮化，到后期出现耳突；用Southern Blot检测表明DNA-A+DNAβ病毒的基因组浓度比单DNA-A接种的DNA浓度明显增加，表明DNA-A与DNAβ是相互依赖的，DNAβ依赖与DNA-A复制，而DNAβ则能大大加强DNA-A的基因组DNA含量，并且DNAβ对于病毒的致病性是必需的，没有DNAβ的存在就不能引发典型的曲叶症状。
DNA-A与DNAβ接种时，在心叶烟，三生烟，香料烟和番茄上，都能形成典型的症状，叶片下卷、皱缩，植株矮化，发病后期出现耳突，但是发病株数没有本氏烟高，EILSA和Southern Blot都能检测到两个组分。在黄瓜，辣椒和菜豆上，并没有观察到症状，ELISA和PCR检测也没有发现病毒DNA，因此这些植物并不是中国番茄黄花叶病毒云南红河Y10分离物的寄主。DNA-A与DNAβ侵染不同寄主上的侵染效率及ELISA检测见表一。表一.DNA-A+DNAβ对不同寄主的侵染性测定，侵染性效率及ELISA检测
权利要求
1.一种植物DNA病毒侵染性载体的构建方法，其特征在于，其步骤为1)从收集的双生病毒发病株中提取基因组总DNA；2)以植物总DNA为模板，设计简并引物对双生病毒的两个组分DNA-A和DNAβ进行PCR扩增，扩增产物克隆至T-Vector；3)对克隆产物进行阳性克隆的筛选并进行序列测定；4)序列测定结果通过DNA分析软件进行组合、拼接，获得DNA-A组分和DNAβ组分的全长基因组序列；5)在序列测定的基础上，利用Overlap-PCR和限制性酶切的方法把DNA-A组分的1.7个重复的基因组构建到改良型植物表达载体上，获得带有DNA-A组分的重组植物表达载体，并将其导入大肠杆菌细胞；6)使用5)中相同的方法把两个正向重复的DNAβ组分构建到改良型植物表达载体上，获得带有DNAβ组分的重组植物表达载体，并将其导入大肠杆菌细胞；7)通过三亲交配的方法把大肠杆菌细胞中的带有DNA-A组分的重组植物表达载体和带有DNAβ组分的重组植物表达载体导入具有较强感染能力的农杆菌菌株EHA105；8)重组载体导入农杆菌菌株以后，带有DNA-A和DNAβ的农杆菌接种5ml YEP液体培养基培养；9)侵染性测定时，试验植株选用4-6叶充分展开的苗龄期的植株为宜，接种组合为单DNA-A接种，单DNAβ接种和DNA-A+DNAβ接种；10)接种时，取1ml一次性针筒吸取农杆菌菌液对植株进行伤口感染，接种的具体方法和部位在距离根部1-2cm处取三点进行韧皮部注射，或在叶片的叶柄处取三点进行注射，或在上部嫩叶背部用带有菌液的针头对叶脉产生伤口使菌液进入植株体内；11)接种植株置于25℃隔离温室培养，10-30dpi后观察接种植株的症状；12)对出症状和没有出症状的植株进行ELISA、PCR和Southern Blot检测以鉴定其侵染性。
全文摘要
本发明涉及一种植物DNA病毒侵染性载体的构建方法。以中国番茄黄化曲叶病毒云南分离物为材料对基因组DNA－A和一新型的卫星分子DNAβ进行了侵染性克隆的构建，通过Overlap－PCR和酶切的方法获得两个正向重复的基因组，并插入到具有高度复制能力的植物表达载体，重组载体通过三亲交配的方法导入具有强感染力的农杆菌菌株，从而获得以农杆菌介导的对寄主植物具有高效感染能力的侵染性载体。本发明为病毒基因组结构与功能以及寄主与病毒之间的互作研究、外源蛋白的表达载体以及病毒诱导的基因沉默的植物功能基因组研究提供了成熟的方法和体系。
文档编号C12N15/74GK1424400SQ0215988
公开日2003年6月18日 申请日期2002年12月24日 优先权日2002年12月24日
发明者周雪平, 陶小荣, 崔晓峰, 谢艳, 李正和 申请人:浙江大学