起搏通道基因亚型hcn2重组慢病毒载体的构建方法

专利名称：：起搏通道基因亚型hcn2重组慢病毒载体的构建方法
技术领域：
：本发明涉及一种起搏通道基因亚型HCN2重组慢病毒载体的构建方法。技术背景哺乳动物基因组编码四种HCN基因，分别命名为HCN1HCN4。这四种异构体在心脏中均已发现，但不同种属、不同心脏组织和发育不同阶段这些异构体的表达存在差异不同种属成年动物窦房结均优势表达HCN4，约占窦房结总体HCN的80%。在四种异构体中HCN1，2，4是心脏中的主要部分，HCN3只在胚胎起搏细胞中有低水平表达。起搏活性小的区域(如心室肌)，HCN2的表达占优势；而起搏活性髙的区域HCN4的表达占优势。目前对于生物起搏的研究集中于HCN2和HCN4。目前的研究大多使用腺病毒表达系统来初步探讨生物起搏的可行性；虽然此类研究也获得了较大的成就，但由于腺病毒表达系统具有髙免疫原性，其病毒基因组游离于宿主基因组外，所以只能瞬时表达外源基因，国外体内的研究仅仅持续了3-10天，这就限制了它的发展。慢病毒是逆转录病毒的一种，具有逆转录病毒的基本结构，但也有不同于逆转录病毒的组份和特性，该病毒既可以感染分裂细胞又可以感染非分裂细胞；其病毒基因组可以整合于宿主基因组中，长时间、稳定表达外源基因并具有较低的免疫原性，这是其最为突出的优点。可见慢病毒可能是基因治疗的最佳载体，以后的发展趋势也许是利用慢病毒为载体，结合细胞治疗和基因治疗；把起搏基因HCNl-4转到干细胞中，增加起搏细胞的起搏电流(If)来治疗慢性心律失常。而构建起搏通道基因亚型HCN重组慢病毒载体是研究HCN基因、起搏电流的特性以及生物起搏等的前提和基础。
发明内容本发明的目的是提供一种起搏通道基因亚型HCN2重组慢病毒载体的构建方法，将带有HCN2基因的穿梭质粒pCDHl-GFP-HCN2与慢病毒一起建立HCN2重组病毒载体，成为慢性心律失常的细胞治疗和基因治疗的基础。本发明的技术方案是一种起搏通道基因亚型HCN2重组慢病毒载体的构建方法，包括将带有HCN2基因的穿梭质粒与病毒系统一起建立HCN2重组病毒载体，所述穿梭质粒为pCDHl-GFP-HCN2，所述病毒为慢病毒。本发明进一步的技术方案是一种起搏通道基因亚型HCN2重组慢病毒载体的构建方法，包括将带有HCN2基因的穿梭质粒与病毒系统一起建立HCN2重组病毒载体，所述穿梭质粒为pCDHl-GFP-HCN2，所述病毒为慢病毒；所述穿梭质粒pCDHl-GFP-HCN2的构建方法包括以下步骤(1)将目的片段HCN2基因从pcDNA3-HCN2中切下，连接入Pucl9质粒中，构建质粒Pucl9-HCN2;(2)将目的片段HCN2基因从质粒Pucl9-HCN2中切下，连接入pcDNA3.1A质粒中，构建质粒pCDNA3.1A-HCN2;(3)将目的片段HCN2基因从pcDNA3.1A-HCN2中切下，连接入pCDHl-MCSl-EFl-copGFP质粒中，构建穿梭质粒pCDHl-GFP-HCN2。所述构建方法还包括将穿梭质粒pCDHl-GFP-HCN2与慢病毒系统混合重组后的HCN2慢病毒载体包装质粒共转染293T细胞，获得病毒液。本发明优点是慢病毒是逆转录病毒的一种，其既可以感染分裂细胞又可以感染非分裂细胞；其病毒基因组可以整合于宿主基因组中，长时间、稳定表达外源基因并具有较低的免疫原性。构建起搏通道基因亚型HCN重组慢病毒载体是研究HCN基因、起搏电流的特性以及生物起搏等的前提和基础。如果把带有起搏基因HCN2的片段重组到慢病毒中，进而再转到干细胞中，可以增加起搏细胞的起搏电流(If)来治疗慢性心律失常。图1为慢病毒包装系统质粒图谱图2为转染293T细胞24小时后的荧光照片(放大倍数250x);图3为Westernblot蛋白电泳图，转染转染细胞；空未转染细胞；图4为HCN2real-timeRT-PCR实时定量检测结果曲线；图5为HCN2重组慢病毒载体的构建及转染流程示意图；图6a为本发明阳性克隆质粒的测序报告第一部分；图6b为本发明续图6a的阳性克隆质粒测序报告的第二部分。具体实施方式下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述实施例一种起搏通道基因亚型HCN2重组慢病毒载体的构建方法，包括将带有HCN2基因的穿梭质粒与病毒系统一起建立HCN2重组病毒载体，所述穿梭质粒为pCDHl-GFP-HCN2，所述病毒为慢病毒将全长约3.0kb的hHCN2目的序列从pCDNA3-hHCN2质粒(我们实验室以前构建)卸载下来，最终装载到带有免疫荧光蛋白的质粒pCDHl-MCS1-EF1-copGFP上，构建穿梭质粒pCDHl-GFP-HCN2,所述穿梭质粒pCDHl-GFP-HCN2的构建方法包括以下步骤(1)将目的片段HCN2基因从pcDNA3-HCN2中切下，连接入Pucl9质粒中，构建质粒Pucl9-HCN2;(2)将目的片段HCN2基因从质粒Pncl9-HCN2中切下，连接入pcDNA3.1A质粒中，构建质粒pCDNA3.1A-HCN2;(3)将目的片段HCN2基因从pcDNA3.1A-HCN2中切下，连接入pCDHl-MCSl-EFl-copGFP质粒中，构建穿梭质粒pCDHl-GFP-HCN2。所述构建方法还包括将穿梭质粒pCDHl-GFP-HCN2与慢病毒系统混合重组后的HCN2慢病毒载体包装质粒共转染293T细胞，获得病毒液。具体实施例一、穿梭质粒pCDHl-GFP-HCN2的构建hHCN2的目的序列插入于pcDNA3载体上，插入的位点为EcoRI和XbaI,首先用EcoRI和XbaI从pCDNA3-hHCN2质粒切下目的片段连接到Pucl9载体中，再用EcoRI和HindIII从质粒Pucl9切下目的片段连接到pcDNA3.1(A)载体中，再用XbaI单酶从质粒pc隱3.1(A)双切至ljpCDH卜MCSl-EFl-copGFP中。最终将阳性质粒送上海生工进行基因测序鉴定，观察hHCN2基因是否插入穿梭质粒。1.准备工作pCDNA3-hHCN2、Pucl9、pcDNA3.1(A)pCDHl-MCSl-EFl-copGFP质粒的抽提采用碱裂解法小量抽提质粒。首先配置以下溶液溶液I(P1)溶液II(P2)溶液III(P3)BufferPl(resuspensionbuffer)50mMTris-Cl，pH8.0:10mMEDTA;15-25。C。BufferP2(lysisbuffer)200mMNaOH,19GSDS(w/v)15-25。C。BufferP3(neutralizationbuffer)3.0M乙酸钾(potassiumRNaseA(10mg/ml)用前煮沸IO分钟灭活。a)抽质粒的前一晚接菌于3迈1抗性LB中，240rpm,37T摇过夜。b)倒菌液于1.5mlEP管中，12，000rpm，30秒。去上清(可以倒置纸上敲，至沉淀散开，并可以用溶液I洗一次沉淀。)c)加200ul溶液I，同时加适量RNaseA(2ul)d)加200ul溶液n,缓慢倒置6-8次，至溶液澄清。e)加200ul溶液ni，缓慢倒置6-8次，产生白色沉淀。f)12,OOOrpm离心5min，取上清，加等体积氯仿，混匀。g)12,OOOrpm离心5min,取上清，加360(0.6V)异丙醇。h)12,OOOrpm离心10分钟，lml70W乙醇洗沉淀。i)晾干5-IO分钟。j)无菌水30ul溶解沉淀，-2(TC保存。所得质粒于1%琼脂糖凝胶电泳。2.开始穿梭质粒pCDHl-GFP-HCN2的构建(1)将目的片段从pcDNA3-HCN2中切下，连接入Pucl9质粒中，构建质粒Puc-19-訓21)对带有目的片段的pcDNA3-HCN2和Pucl9用EcoRI和XbaI进行顺序双酶切(由于EcoRI和XbaI没有适合的双酶切buffer,因此采用顺序酶切)a)XbaI酶切体系如下XbaI(20U/U1)1ii1NEBuffer2(10X)3u1pc画3-HCN2/Pucl9(500ng/ixl)2u1dH20_24u1Total30u1反应条件如下37"、6小时b)将单酶切产物进行乙醇沉淀30ul酶切体系中加入3ul3M乙酸钠(PH5.2),再加入70ul无水乙醇，—20TC沉淀30分钟10000rpm离心IO分钟，弃上清，沉淀进行下一步酶切反应；c)EcoRI酶切体系如下EcoRI(20U/U1)1U1NEBufferEcoRI(10X)3u1pc纖3-HCN2/Pucl9(500ng/ul)2uldH20_241Total30u1反应条件如下37'C、6小时。2)对酶切载体和目的基因片段进行凝胶电泳后回收，由于紫外线会造成碱基突变，因此在该步骤中不进行拍照，直接切胶回收，回收方法如下a)在紫外灯下，用干净的手术刀将目的片断条带切下，放于干净的1.5ml离心管中，尽量不要切到多余的凝胶；b)称童，加三倍体积的BufferQG到离心管中，即每lOOmg凝胶加300ulBufferQG;c)将离心管放于50X:水浴中，放置10分钟，直至凝胶完全融解，期间每两、三分钟晃动离心管一次；d)观察凝胶溶液的颜色，如果为橙色或紫色，则添加5ul3M的NaAC(pH5.2);e)加100ul，即一倍凝胶体积的异丙醇于凝胶溶液中，将凝胶混合液加入到QIAquickspincolumn中，将回收柱插于2ml废液收集管中，13,OOOrpm离心一分钟；f)弃收集管中废液，将回收柱插回收集管中，柱中添加0.5mlBufferQG,13,OOOrpm离心一分钟；g)弃收集管中废液，将回收柱插回收集管中，柱中添加0.75mlBufferPE，放置2—5分钟，13，OOOrpm离心一分钟；h)弃收集管中废液，将回收柱插回收集管中，13，OOOrpm离心一分钟；i)将回收柱取下插入干净的1.5ml离心管中，柱中加入50ulBufferEBUOmMTris-Cl,pH8.5)到柱子中心的膜上，放置2—5分钟，13,000rpm离心一分钟；若想获得更多量的回收产物，可以重复该步骤一次1.5ml离心管中则为回收产物。3)将回收的双酶切的Pucl9和目的基因片段进行连接反应，根据Epicentre试剂盒说明书进行如下操作a)连接体系如下:线性化Pucl92ul双酶切目的基因4ul10Xbuffer1u1ATP1u1Ligase0.7ii1dH20_1.3ix1TotallOu1b)反应条件室温连接8分钟；4)将连接产物转化大肠杆菌，涂布Amp+LB平板，37C过夜培养a)取一80C保存的DH5a感受态细菌，冰浴放置5-10分钟，使之冰中融化；b)将5ul连接产物加入感受态细菌，用移液枪缓慢混匀，冰浴放置30分钟c)将混有连接产物的感受态细菌放入42X:水浴中，热击90秒，冰浴2分钟；d)将转化产物加入900ul的S0C培养基中，37t、150rpm摇床培养1小时；e)3，000rpm离心2分钟，弃上清，加入200ulLB培养基重悬细菌涂布Amp+LB平板。其中根据BIOSCIENCES试剂盒说明书制备感受态细菌，过程如下a)取DH5ci甘油菌种，在LB平板中划线，37"C培养箱中培养过夜；b)挑取一个单克隆接种入0.5迈1LB培养基中，240rpm，37T摇床培养过夜c)将过夜培养的0.5ml菌液转移到50mlSOB培养基中，240rpm,25t!摇床培养，直至0D600在0.4-0.6之间；d)将培养细菌的锥形瓶放于冰上冷却IO分钟；e)将菌液转移到灭菌的50ml离心管中，2,500Xg，4'C离心6分钟；f)弃上清，用5ml冰上预冷的1Xwashbuffer重悬沉淀，2,500Xg,4"C离心6分钟；g)弃上清，用5ml预冷的1Xcompetentbuffer重悬沉淀；h)小量分装，每管100ul，快速放入液氮中；i)—80"C保存，备用。5)挑取单菌落，接种于5mlAmp+LB液体培养基中，37"C、250rpm摇床培养过夜；使用Axygen质粒抽提试剂盒提取质粒，根据Axygen试剂盒说明书质粒抽提步骤如下a)过夜培养的5ml菌液用2ml做甘油菌保，剩余3ml分两次于一个1.5ml离心管中12,000Xg离心1分钟，彻底去除上清；b)加入250^1BefferSl，振荡器充分重悬细菌；c)加入250^1BefferS2,颠倒混匀4一6次；注意不能剧烈混合，否则会出现基因组DNA污染d)加入250ftlBefferS2五分钟内加入350^1SolutionIII，轻轻颠倒混匀6—8次；e)12,000Xg,离心10分钟；将上清转移到Miniprep柱中，Miniprep柱插于废液收集管中，12，000Xg离心1分钟；注意不要吸到沉淀，否则会出现基因组DNA和蛋白质污染；f)弃收集管中的废液，将Miniprep柱插于收集管中，加70(^1BufferW2到Miniprep柱中，12，000Xg离心1分钟；重复该步骤一遍；g)弃收集管中的废液，将Miniprep柱放入同一支收集管中，12，000Xg离心1分钟彻底去除BufferW2:h)将Minipre柱放入新的干净的1.5ml离心管中，加50nlEluent,室温放置1分钟后，12,000Xg离心1分钟；离心管中的溶液即为所抽提的质粒，抽提后质粒浓度统一调整为500ng/ul。(2)将目的片段从质粒Pucl9-HCN2中切下，连接入pcDNA3.1A质粒中，构建质粒pCDNA3.1A-HCN21)对带有目的片段的Pucl9-HCN2和pcDNA3.1A用EcoRI和Hindm进行双酶切(由于EcoRI和Hindm没有适合的双酶切buffer,因此采用顺序酶切)a)酶切体系如下Hindm(20U/w1)1u1國uffer2(10X)3u1Pucl9-HCN2/pCDNA3.1A(500ng/ii1)2u1dH20_23ix1Total30ii1反应条件如下37"、6小时；b)将单酶切产物进行乙醇沉淀30ul酶切体系中加入3ul3M乙酸钠(pH5.2)，再加入70ul无水乙醇，—20'C沉淀30分钟；10000rpm离心IO分钟，弃上清，沉淀进行下一步酶切反应;c)EcoRI酶切体系如下EcoRI(20U/u1)1u1隱ufferEcoRI(10X)3u1pc謹3-HCN2/Pucl9(500ng/ul)2uldH20_24u1Total30u1反应条件如下37°C、6小时。2)对酶切载体和目的基因片段进行凝胶电泳后回收，由于紫外线会造成碱基突变，因此在该步骤中不进行拍照，直接切胶回收，回收方法同步骤(1)中2)项所述；3)将回收的双酶切的pCDNA3.1A和目的基因片段进行连接反应，根据Epicentre试剂盒说明书进行如下操作a)连接体系如下线性化pCDNA3.1Alul双酶切目的基因5ul10XbufferlulATP1U1Ligase0.7u1dH20_1.1TotallOii1b)反应条件室温连接8分钟。4)将连接产物转化大肠杆菌，涂布Amp+LB平板，37匸过夜培养，方法同步骤(1)中4)项所述；5)挑取单菌落，接种于5mlAmp+LB液体培养基中，37"、250rpm摇床培养过夜；使用Axygen质粒抽提试剂盒提取质粒，方法同步骤(1)中5)项所述；(3)将目的片段从pcDNA3.1A-HCN2中切下，连接入pCDHl-MCS1-EF1-copGFP质粒中，构建质粒pCDHl-GFP-HCN21)对带有目的片段的pcDNA3.1A-HCN2和pCDHl-MCSl-EF1-c叩GFP(以下简写为pCDHl-GFP)用Xbal进行单酶切a)酶切体系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>b)反应条件如下37'C、6小时。2)对酶切载体和目的基因片段进行凝胶电泳后回收，由于紫外线会造成碱基突变，因此在该步骤中不进行拍照，直接切胶回收，回收方法同步骤(1)中2)项所述；3)将回收的单酶切的pCDHl-GFP和目的基因片段进行连接反应，根据Epicentre试剂盒说明书进行如下操作a)连接体系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>b)反应条件室温连接8分钟。4)将连接产物转化大肠杆菌，涂布Amp+LB平板，37'C过夜培养，方法同步骤(1)中4)项所述；5)挑取单菌落，接种于5mlAmp+LB液体培养基中，37^C、250rpm摇床培养过夜使用Axygen质粒抽提试剂盒提取质粒，方法同步骤(1)中5)项所述6)将阳性克隆质粒送上海生工测定基因序列。(4)使用Qiagen小抽试剂盒抽提pCDHl-GFP-HCN2穿梭质粒用于后续的慢病毒包装实验1)吸取10ul阳性克隆的菌保接种于2—5mlAmp+LB培养基中，37"、300rp迈摇床培养8小时；2)将步骤1)中培养的菌液按1/500或1/1000接种到Amp+LB中，即3-6ul菌液接种于3mlAmp+LB中，37'C、300rpm摇床培养12—16小时；3)菌液转移至1.5ml离心管中，4"、6000Xg离心15分钟；4)弃上清，加0.3ml含有RNaseA的BufferPl重悬细菌沉淀，振荡、充分重悬；5)加入0.3mlBufferP2,颠倒混匀4一6次，不能振荡混匀，以免出现基因组污染，室温放置5分钟；6)加入0.3ml预冷的BufferP3,颠倒混匀4一6次，冰上放置5分钟；7)4C、20，000Xg离心10分钟，将上清转移至干净的离心管中；重复该步骤一次；8)将lmlBufferQBT加入QIAGEN-tip20中，Buffer靠重力作用流过QIAGEN-tip20以平衡QIAGEN-tip20;9)将步骤7)中的上清加入到QIAGEN-tip20中，溶液靠重力作用流出，质粒DNA则结合在QIAGEN-tip20的膜上；10)用2mlBufferQC洗QIAGEN-tip20两次；11)用500ulBufferQF将质粒从QIAGEN-tip20的膜上洗脱下来。12)取1—2ul用分光光度计测定质粒浓度，用无菌水将质粒浓度调整为0.5ug/ul，以备后续构建病毒载体实验用。(5)将阳性克隆质粒送上海生工测序，测序结果表明，与GENEBANK目的基因序列完全相同，表明成功构建pCDHl-GFP-HCN2穿梭质粒。测序报告如图6a和图6b所示。二、使用穿梭质粒pCDHl-GFP-HCN2包装构建起博通道基因亚型HCN2重组慢病毒实验过程参照SBI的LentivectorExpressionSystem的操作手册进行；慢病毒包装系统pPACKHl-LentivectorPackagingKit(SBI)三个包装质粒图谱见图l;操作流程图如图5所示，具体操作过程如下1.假病毒颗粒的包装(包装产生的假病毒颗粒中含有携带目的基因的穿梭质粒)1)转染前2-3天，D-MEM完全培养基培养293T细胞株。转染前一天，接种293T细胞到新的lOcm培养皿，接种量约为5X106,完全吹散细胞，充分混匀，使细胞均匀分布。转染时，细胞铺满培养皿的50-70%:2)将2ng(浓度为500ng/ixl)携带目的基因的穿梭质粒pCDHl-GFT-HCN2同10ug(浓度为500ng/ul)慢病毒包装质粒混合物混合，将混合的质粒稀释到750ii1Opti-MEM培养基中，充分混匀，室温孵育5分钟；3)将60w1Lipofectamine2000TM转染试剂稀释到750u1Opti-MEM培养基中，轻轻地混匀，室温孵育5分钟；4)将稀释的Lipofectamine2000TM试剂逐滴加入到质粒-Opti-MEM混合液中，轻轻地上下颠倒混匀，室温孵育20分钟；5)在第4步孵育形成转染混合物的同时，用10mlOpti-MEM洗293T细胞一次，然后加入8.5ml含2%血清不含抗生素的D-MEM培养基；6)将第4步中产生的质粒-Lipofectamine2000TM混合物加入第5步处理后的培养皿中，轻轻地混匀使转染复合物均匀分布在培养基中，37'C、59tC02培养箱中培养；7)6小时后，用新鲜的含抗生素和2%血清的D-MEM培养基替换掉含有转染混合物的培养基，继续培养48小时；8)收集转染后24和48小时的上清液；用含2%血清不含抗生素的D-MEM培养基替换掉上清液注意观察培养基的颜色，培养24小时后和48小时后，由于293T细胞的代谢活性，会引起培养基颜色变黄(呈酸性)；9)将含有假病毒颗粒的培养基3000rpm室温离心5分钟，去除细胞碎片，然后将上清用Millex-HV0.45Um的PVDF滤膜过滤过滤后的病毒液用于后续的转染基质干细胞研究。2.将构建的慢病毒转染293-T细胞，并将稳定转染的细胞扩大培养，当细胞培养到足够量时，收集细胞RNA和蛋白用于实时定量PCR鉴定和WesternBlot鉴定。3.原代细胞和稳转细胞继续培养两周后行Westernblot鉴定蛋白的表达蛋白抽提方法1)从贴壁细胞培养瓶中小心倾去培养液。2)预冷的PBS清洗贴壁的细胞2次，小心倾去PBS。3)配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂(1ml抽提试剂中加入5Pi蛋白酶抑制剂混合液，5PlPMSF和5Jil磷酸酶混合液)。4)细胞瓶中加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂(107个细胞中加入lml抽提试剂；5X10e个细胞中加入0.5ml抽提试剂)，轻轻摇动5分钟。5)用一预冷的橡胶和塑料细胞刮将培养瓶壁上贴壁细胞刮下来，转移细胞悬浮液到离心管中，冰浴下摇动15分钟进行裂解。6)裂解液于预冷的离心机中14,000Xg离心15分钟。弃去沉淀，上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。使用上清液5ul上样，凝胶蛋白电泳。4.原代细胞和稳转细胞继续培养两周行real-timeRT-PCR实时荧光定量检测1)RNA抽提TrizolRNA抽提及质量检测方法和步骤a)匀浆转基因细胞培养两周后，离心沉淀细胞。加入lmlTRIZ0L试剂，使用匀浆器破碎细胞使其裂解。注意避免在加入TRIZOL试剂进行裂解前清洗细胞，因为清洗会很可能导致mRM的降解。b)两相分离匀浆后样品于15~30°C孵育5分钟，以便核酸蛋白复合体完全解离。每lml的TRIZ0L试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15~30°C孵育2到3分钟。4°C下12,000Xg离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相。RNA全部被分配于水相中。水相的体积大约使匀浆时加入的TRIZ0L试剂的60先。c)RNA沉淀将水相转移到新离心管中。水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入异丙醇的量为每个样品匀浆时加入lmlTRIZOL试剂的此时加O.5ml的异丙醇。混匀后15~30。C孵育10分钟后，于4°C12,000Xg离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。d)RNA清洗移去上清液，每lmlTRIZ0L试剂勾浆的样品中加入至少1ml的7596乙醇，清洗RNA沉淀。振荡后，4°C7,500Xg离心5分钟。e)重新溶解RNA沉淀去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5~10分钟，切勿真空离心干燥。注意RNA沉淀不要完全干燥，否则将大大降低RNA的可溶性。部分溶解的RM样品A260/280比值将小于1.6。f)变性琼脂糖凝胶电泳i)制胶1g琼脂糖溶于72迈l水中，冷却至60°C,10ml的10XMOPS电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液(12.3M)。10XMOPS电泳缓冲液浓度_成分0.4MMOPS,pH7.00.1M乙酸钠0.01MEDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25H1溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的lXMOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。ii)准备RNA样品取3PgRNA,加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10Pg/ml。加热至70°C孵育15分钟使样品变性。iii)电泳上样于胶孔中，5-6V/cm电压下电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。2)以提取的RNA为模板合成cDNA:a)配制退火混合物RNA3[ig0.5ug/ulOligo(dT)18lPl加无RNA酶的&0至总体积10Jil混合液在70t:水浴3分钟，降到37'C放置IO分钟。b)RT反应液5XRT缓冲液4Jil2.5mMdNTP混合液4mRNA酶抑制剂1JilMMLV反转录酶1fil混合后37"恒温1分钟c)加10W的RT反应液到10jxl退火混合物中，37C水浴60分钟，加热到95X:维持5min。得RT终溶液即为cDNA溶液，置冰浴待用。3)合成的cDNA用于实时定量PCRa)制备用于绘制标准曲线的梯度稀释DNA模板i)针对每一需要测量的基因和管家基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应d證(2.5mMeach)2.10XPCR缓冲液2.5PiMgCl2溶液1.5MllimitslOuM的PCR特异引物F1H1lOuM的PCR特异引物Rlnic函1Ml加水至总体积为25JU轻弹管底将溶液混合，40个PCR循环(94'C，20秒；退火温度，20秒；721C,30秒)；72°C延伸5分钟。ii)PCR产物与100bpDNALadder在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。iii)将PCR产物进行IO倍梯度稀释设定PCR产物浓度为1,分别稀释为1Xl(T1，1Xl(T2，1X10—3,1X10",1X10—5,1X10—6，1X10—7这几个梯度浓度的DNA。4)进行RealtimePCR反应a)几个梯度稀释的DM模板以及所有cDNA样品分别配置RealtimePCR反应体系。体系配置如下dNTP(2.5mMeach)2.5^110XPCR缓冲液2.5HiMgCl2溶液1.5M1rag聚合酶lunitsSybergreenI终浓度O.25XlOuM的PCR特异引物FlUllOuM的PCR特异引物R1^1cDNAorDNA1Ml加水至总体积为25PI轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心。b)步骤1配置的PCR反应溶液置于RealtimePCR仪上进行PCR反应。GAPDH:95C5min;35个PCR循环(95'C,10秒；58^C，15秒；20秒；85"C(收集荧光)，5秒)。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后继续从72"C缓慢加热到99^C(每5秒升高ir);HCN2:95'C，5min:35个PCR循环(95t!，10秒；58'C，15秒；72t!,20秒；85'C(收集荧光)，5秒)。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后继续从72C缓慢加热到99^(每5秒升高1X:)。表l实时定量PCR使用引物列表<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>5.结果(1)将带有目的基因的穿梭质粒pCDHl-GFP-HCN2同慢病毒包装质粒混合物混合后感染293T细胞后，培养24小时，可以发现大量的荧光出现，如图2所示。(2)提取蛋白后进行Westernblot的蛋白鉴定结果如图3所示。(3)各样品的目的基因和管家基因分别进行RealtimePCR反应。根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线，各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量。标准曲线法的相对定量(见图4)此方法中量的表达是相对于某个参照物的量而言的，对于所用的标准品只要知道其相对稀释度即可。在整个实验中样本的耙序列的量来自于标准曲线，最终必须除以参照物(对照组)的量，即参照物(对照组)是1倍的样本，其它的样本为参照物量的n倍。实时定量PCR时各样品加样量均为1然而由于受RNA浓度定量误差和RNA逆转录效率误差等的影响，每个样品的1W体积的cDNA其含量并不完全相同，为校正此差异，我们使用管家基因GAPDH(不同样品间表达量基本恒定)作为内参，以样品待测基因得值除以此样品内参得值，最终得到的比值为样品的待测基因相对含量。待测基因以内参校正。结果显示稳转细胞的RNA是原代细胞的123倍。表2内参校正列表<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>HCN2real-timePCR实时定量检测如图4所示。以上结果表明已成功构建起博通道基因亚型HCN2重组慢病毒载体。慢病毒是逆转录病毒的一种，其既可以感染分裂细胞又可以感染非分裂细胞；其病毒基因组可以整合于宿主基因组中，长时间、稳定表达外源基因并具有较低的免疫原性。构建起搏通道基因亚型HCN重组慢病毒载体是研究HCN基因、起搏电流的特性以及生物起搏等的前提和基础。如果把带有起搏基因HCN2的片段重组到慢病毒中，进而再转到干细胞中，可以增加起搏细胞的起搏电流(If)来治疗慢性心律失常。权利要求1.一种起搏通道基因亚型HCN2重组慢病毒载体的构建方法，包括将带有HCN2基因的穿梭质粒与病毒系统一起建立HCN2重组病毒载体，其特征在于所述穿梭质粒为pCDH1-GFP-HCN2，所述病毒为慢病毒。2.根据权利要求1所述的起搏通道基因亚型HCN2重组慢病毒载体的构建方法，其特征在于所述穿梭质粒pCDHl-GFP-HCN2的构建方法包括以下步骤(1)将目的片段HCN2基因从pcDNA3-HCN2中切下，连接入Pucl9质粒中，构建质粒Pucl9-HCN2;(2)将目的片段HCN2基因从质粒Pucl9-HCN2中切下，连接入pcDNA3.1A质粒中，构建质粒pCDNA3.1A-HCN2;(3)将目的片段HCN2基因从pcDNA3.1A-HCN2中切下，连接入pCDHl-MCSl-EFl-copGFP质粒中，构建穿梭质粒pCDHl-GFP-HCN2。3.根据权利要求1所述的起搏通道基因亚型HCN2重组慢病毒载体的构建方法，其特征在于所述构建方法还包括将穿梭质粒pCDHl-GFP-HCN2与慢病毒系统混合重组后的HCN2慢病毒载体包装质粒共转染293T细胞，获得病毒液。全文摘要本发明公开了一种起搏通道基因亚型HCN2重组慢病毒载体的构建方法，包括将带有HCN2基因的穿梭质粒与病毒系统一起建立HCN2重组病毒载体，所述穿梭质粒为pCDH1-GFP-HCN2，所述病毒为慢病毒。本发明将带有HCN2基因的穿梭质粒pCDH1-GFP-HCN2与慢病毒一起建立HCN2重组病毒载体，成为慢性心律失常的细胞治疗和基因治疗的基础。文档编号C12N15/12GK101265484SQ20081002378公开日2008年9月17日申请日期2008年4月18日优先权日2008年4月18日发明者周亚峰,李红霞,杨向军,蒋文平,韩莲花申请人:苏州大学附属第一医院