专利名称：：一种寻找自发性高血压病致病相关基因的方法
技术领域：
：本发明涉及一种基因的寻找方法，具体是指涉及一种寻找自发性高血压病致病相关基因的方法。技术背景高血压病是最常见的心血管疾病之一，在我国3575岁成年人其发病率高达27.2%，男性(28.6%)略高于女性(25.8%)。高血压病作为一种严重危害老年人健康并且发病率呈逐年上升趋势的常见多发的疾病，它是导致脑血管意外、冠状动脉疾病、外周血管疾病和进行性肾脏损害的重要危险因素，但其发病机理不明。根据近几年国内外学者的研究结果表明高血压病是一种整合基因因素和环境因素(钠盐，酒精过量和肥胖)的疾病，因此高血压病一般可分为原发性高血压病和继发性高血压病，而原发性高血压病有很强的遗传倾向，尤其家族聚集性高血压患者有很强的遗传倾向，可参见MunroePB,CaulfielddM:.geneticsofhypertension.CurrentOpinioninGenetics&2000,10:325-329;O'shaughnessyKM:Thegeneticsofessentialhypertension.BrJClinPharmacol2000,51:5-11。有研究认为，30%到50%的原发性高血压可能都具有遗传性，可参见DominiczakAF，NegrinDC,ClarkJS，etal.Genesandhypertension:fromgenemappinginexperimentalmodelstovasculargenetransferstrategies.Hypertension,2000,35(lPt2):164-172。在国外已完成了一些已知基因(如血管紧张素II、血管紧张素受体、肾素、激肽、G蛋白信号2调节基因及心钠素等)在动物体内进行转基因过度表达或基因敲除研究，可参见BaderM,etal:Transgenicanimalsincardiovasculardiseaseresearch.Exp.Physiol2000,85(6):713-7311;RiddleEL，RanaBK，MurthyKK，etal:PolymorphismsandHaplotypesoftheRegulatorofGProteinSignaling-2GeneinNormotensivesandHypertensives.2006，47(3):415-20.11;GelbanddCH,etal:CurrentPerspectivesontheUseofgeneTherapyforHypertension.C7rc2000,87:1118-1122。高血压病的基因治疗也已拉开序幕，如过度表达舒张血管基因(心钠素，血管舒缓素，内皮一氧化氮合成酶)等，及敲除血管紧张素原，血管紧张素II受体，中性肽链内切酶等基因，可参见WangT,LiH，ZhaoC，etal:Recombinantadeno-associatedvirus-mediatedkallikreingenetherapyreduceshypertensionandattenuatesitscardiovascularinjuries.2004S印；11(17):1342-50;ZhaoC,WangP，XiaoX,etal:Genetherapywithhumantissuekallikreinreduceshypertensionandhyperinsulinemiainfructose-inducedhypertensiverats.Hypertension.2003Nov;42(5):1026-33。但是，目前医学界对高血压病发病机理及基因调控仍不清楚，其发病属于单基因还是多基因仍有争议。因此，如果能够获知更多与高血压病致病相关基因，无疑对建立新的高血压诊断方法以及开发高血压病新的基因治疗药物具有非常重要的意义。
发明内容为了探讨高血压病的发病机理，寻找自发性高血压病致病相关基因，也为建立新的高血压诊断方法和开发高血压病新的基因治疗药物打下基础，本发明的目的是提供了一种稳定可靠的寻找自发性高血压病致病相关基因的方法。为实现上述目的，本发明的技术方案是包括以下步骤(1)、试验组和对照组的选取以及组织采集选取至少三只纯种患有自发性高血压病哺乳动物作为试验组，选择与试验组同物种且数量相同的血压正常的哺乳动物作为对照组，并分别对试验组和对照组中的哺乳动物的阻力血管组织和肾脏组织进行采集；(2)、总RNA和mRNA的提取分别从试验组和对照组中采集到的阻力血管组织和肾脏组织中提取总RNA并进一步分离提取mRNA;(3)、mRNA逆转录合成cDNA:分别将试验组和对照组中提取的mRNA通过逆转录酶逆转录成cDNA;(4)、利用基因芯片法初步筛选有差异表达的候选基因利用至少含IO，OOO大鼠基因的表达谱芯片比较试验组和对照组的基因表达情况，寻找出基因表达水平上调的一组候选基因和下调的一组候选基因；基因芯片法能一次性对大鼠10,000个基因进行筛选，操作成本相对较低，效率高。(5)、对候选基因采用RT-PCR进行链式扩增并对链式扩增产物进行凝胶电泳分析排除掉基因芯片法获得的候选基因中的假阳性基因分别对试验组和对照组候选基因的mRNA通过逆转录DNA合成酶逆转录合成cDNA，并对cDNA进行链式扩增，然后再对链式扩增产物进行凝胶电泳分析排除掉假阳性的候选基因；(6)、对经过RT-PCR排除后剩下的候选基因采用荧光实时定量RT-PCR进行进一步验证得到与自发性高血压病致病相关基因。本方案对试验组和对照组的阻力血管组织和肾脏组织进行采集，并通过基因芯片法、RT-PCR、实时定量RT-PCR逐次筛选验证，排出假阳性的候选基因，来获得与自发性高血压病致病相关基因，另外选用阻力血管组织和肾脏组织作为采集组织使得筛选结果更加可靠进一步设置是所述的试验组选用3只13周龄的自发性高血压大鼠，所述的对照组选用三只13周龄的正常大鼠。本设置选用13周龄自发性高血压大鼠和13周龄的正常大鼠作为试验组和对照组不仅成本便宜，自发性高血压大鼠(SHR)和非高血压正常大鼠(WKY)因遗传因素简单，环境因素可严格控制，能够比较有效地排出干扰。进一步设置是所述的步骤4为用Cy3-dUTP标记试验组总RNA，用Cy5-dUTP标记对照组总RNA,再对标记过的试验组和对照组中的总RNA进行反转录制备两组cDNA探针，将含10,000个大鼠基因表达谱芯片和探针分别在95"C水浴中变性5分钟，将探针加在大鼠表达谱芯片上，用盖玻片封片，置于42"C杂交12-20小时，冲洗盖玻片，洗涤10分钟，室温晾干，再通过基因芯片读片仪进行扫描分析。进一步设置是所述的步骤5为通过Oligo引物法分别将试验组和对照组的含候选基因的mRNA片段逆转录合成cDNA，并以候选基因为模板设计上、下游引物，并经Blast验证，内参照基因选用GAPDH基因，其上游引物5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3，；下游引物5，-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，并分别按下列条件进行链式扩增在9(TC一10(TC变性0.5分钟，然后在55'C—60。C退火0.5分钟，然后在65。C一75。C延伸1分钟，根据不同基因做18、22、26、30、34个循环，最后在65°C—75。C延伸10min，取出反应管置于4'C下10分钟，然后将链式扩增产物在含医用染料的2%琼脂糖凝胶上电泳，并对电泳成像图结果进行摄像，并以看家基因GAPDH为内参照比对，排除掉假阳性的候选基因。进一步设置是所述的步骤6为分别对试验组和对照组中含经过RT-PCR排除后留下的候选基因的mRNA进行荧光实时定量RT-PCR进行进一步验证，反应体系为10SYBRGreenPCR缓冲液13ul、5pmo1引物1ul、cDNA模板+双蒸水11ul共25ul，5(TC孵育2分钟，然后95i:水浴变性2分钟;接着进行40个循环95"C下变性15秒再59t下孵育l-3分钟。进一步设置是所述的步骤6分别对试验组和对照组的mRNA做至少3次条件完全相同的PCR反应孔。本发明的优点在于通过对试验组和对照组的阻力血管组织和肾脏组织进行采集，并通过基因芯片法、RT-PCR、实时定量RT-PCR逐次筛选验证，排出假阳性表达的候选基因，比较可靠稳定地寻找到与自发性高血压病致病相关基因，并且本发明选用阻力血管组织和肾脏组织作为组织采集对象，使寻找到的基因更加可靠，另外本发明寻找与自发性高血压病致病相关基因的方法，对建立新的高血压诊断方法以及开发高血压病新的基因治疗药物具有非常重要的意义。下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做进一步介绍。说明书附1本发明具体实施方式流程图具体实施方式如图1所示的本发明的具体实施方式，包括以下步骤(1).试验组和对照组的选取以及组织采集选取三只13周龄的自发性高血压大鼠(SHR)作为试验组，选取三只13周龄的正常大鼠(WKY)作为对照组，并分别对试验组和对照组的大鼠的阻力血管组织和肾脏组织进行采集。本步骤中自发性高血压大鼠(SHR)源于东京远交系Wistar大鼠，1963年由0kamoto培育。用群体动物中患有自发性高血压的雄鼠与一只血压升高的雌鼠交配繁殖，之后进行兄妹连续交配，以获得自发性高血压动物模型。自发性高血压大鼠(SHR)和非高血压正常大鼠(WKY)因遗传因素简单，环境因素可严格控制，是被最为广泛应用的高血压研究动物模型，可参见(OkamotoK,AokiK.Developmentofastrainofspontaneouslyhypertensiverats.JpnCircJ，1963，27:282—293)。自发性高血压大鼠(SHR)的高血压及终末器官的损害和人类相似，可参见(McBrideMW，CharcharFJ,GrahamD,etal.Functionalgenomicsinrodentmodelsofhypertension.JPhysiol，2004;554:56—63，MuellerPW,HallWD),(CaudillSP，etal.Anin-depthexaminationoftheexcretionofalbuminandothersensitivemarkersofrenaldamageinmildhypertension.AmJHypertens,1995,8:1072-1082)。另外，动物随年龄的增加，血压模式和外周血液动力学发生改变，高血压的患病率增加，除了环境因素的影响外，内源性的因素可能也伴随着年龄的增加而影响血压，可参见(FranklinSS，LarsonMQKhanSA，etal.DoestherelationofbloodpressuretocoronaryheartdiseaseriskchangewithagingTheframinghamheartstudy.Circulation,2001，103:1245—1249)、(SafarME,LevyBI，andStruijker-BoudierH.Currentperspectivesonarterialstiffiiessandpulsepressureinhypertensionandcardiovasculardiseases.Circulation,2003,107:2864-2869.)。既往有基因芯片法研究过自发性高血压大鼠(SHR)的3周、4周、9周和22周的肾或平滑肌细胞的基因表达水平，可参见(Ja-RyongKoo,KaiHuiLiang，NosratolaDVaziri.MicroarrayAnalysisofAlteredGeneExpressioninKidneysofAdultSpontaneouslyHypertensiveRats.JApplres,2004，4(1):111-126.)、(HuWY,FukudaN，KanmatsuseK.Growthcharacteristics,angiotensinIIgeneration,andmicroarray曙determinedgeneexpressioninvascularsmoothmusclecellsfromyoungspontaneouslyhypertensiverats.JHypertens,2002,20(7):1323-1333.)，而自发性高血压大鼠(SHR)的13周是高血压形成进展期，但耙器官还未出现明显损害，因此本发明采用了13周龄的S服为试验对象具有更好的稳定性和借鉴意义。另外肾脏和高血压密切相关，最有说服力的证据主要来自近30年的临床或实验性的肾脏移植结果。在正常血压者移植了遗传性高血压患者的肾脏，则会发生高血压，而在遗传性高血压患者移植了正常血压人的肾脏，则血压会下降，可参见(GuidiE,MenghettiD,MilaniS,etal.Hypertensionmaybetransplantedwiththekidneyinhumans:along-termhistoricalprospectivefollow-upofrecipientsgraftedwithkidneyscomingfromdonorswithorwithouthypertensionintheirfamilies.JAmSocNephrol,1996，7:113l-l138.)、(SmallegangeC，KlineRL，AdamsMA.TransplantationofenalapriltreatedkidneysconferspersistentloweringofarterialpressureinSHR.Hypertension,2003,42:932-936.)，另一方面，在人的各型高血压或各种高血压动物模型中外周血管阻力均增加，肠系膜二、三级动脉代表外周阻力血管,其在高血压形成中起重要作用。因此本发明采用阻力血管组织(肠系膜二、三级动脉)和肾脏组织作为mRNA的采集对象。(2)、总RNA和mRNA的提取分别从试验组和对照组中采集到的阻力血管组织和肾脏组织中提取总RNA并进一步分离提取mRNA;本步骤直接采用试剂盒来提前RNA，本实施方式采用QIANEN公司生产的提取总RNA试剂盒来提取总RNA，然后再用GIBCO公司生产的提取mRNA试剂盒从总RNA中分离提取mRNA。(3)、mRNA逆转录合成cDNA:分别将试验组和对照组中提取的mRNA通过逆转录酶逆转录成cDNA;本实施方式该步骤采用GIBCO公司生产的逆转录DNA合成酶，把mRNA逆转录成cDNA。(4)、利用基因芯片法初步筛选有差异表达的候选基因Cy3-dUTP标记试验组总RNA，Cy5-dUTP标记对照组总RNA，再通过反转录制备两组cDNA探针，将含10,000个大鼠基因表达谱芯片和探针分别在95"C水浴中变性5分钟，本实施方式采用含10,000个大鼠基因表达谱芯片，将探针加在所述的大鼠表达谱芯片上，用盖玻片封片，置于42r杂交16小时，冲洗盖玻片，洗涤10分钟，室温晾干，再通过基因芯片读片仪进行扫描分析，本实施方式所述的基因芯片读片仪采用Axon公司的GenePix4100，并用GenePixPro4.0软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值。经内参基因的标准化后，用以下2个条件为判断基因差异表达的标准①Cy3和Cy5信号比值>2.0为表达上调，<0.5为表达下调，0.52.0为不存在显著表达差异。②Cy3和Cy5信号值其中之一必须大于200或其中之一大于800及Cy5/Cy3在0.110之间，作为判断基因差异表达的标准。通过分析比较试验组中与对照组的基因表达情况，寻找到基因表达水平上调的一组基因和下调的一组基因，均定义为候选基因，如表1、表2所示:表l利用基因芯片的方法获得的SHR下调基因基因库标识基因名称下调倍数NM一139192stearoyl-CoenzymeAdesaturase121U05341p55CDC2.17NM—021909FXYDdomain-containingiontransportregulator52.33XM—131732similartohypotheticalproteinDJ159A19.32.21NM一012797InhibitorofDNAbinding1,helix-loop-helixprotein2.01NM一053907deoxyribonucleaseI-like33.66M18854RatT-cellreceptoractivebeta-chainC-regionmRNA15.63羅—017014Glutathione-S-transferase,tnutype23.22NM」31902Cyclindependentkinaseinhibitor2C2.82L22653Ratanti-acetylcholinereceptorantibodygene,kappa-chain10.59NM一017165glutathioneperoxidase42.05AB028626mRNAforR-rasGTPaseactivatingprotein2NM一016698ringfingerprotein1014.04AF343581RanBp21mRNA2.13NM一O19292carbonicanhydrase313.37BC022167nuclearprotein952.32丽—013191S100calcium-bindingprotein,beta2.38NM一017332fattyacidsynthase2.38XM一131329similartoMitogen-activatedproteinkinasekinasekinase75.85表2利用基因芯片的方法获得的SHR上调的基因基因文库标识基因名称上调倍数U40652tyrosinephosphatase-likeproteinIA-2amRNA3.812画一l30744stellatecellactivationassociatedprotein3.036NM—017116calpain23.029顧—031822nuclearreceptorcoactivator23.022AY090783platelet-derivedgrowthfactorreceptorbeta2.596画—024369follistatin-relatedproteinprecursor2.399AF139830insulin-likegrowthfactorbindingprotein52.535NM—053583Olf-l/EBFassociatedZnfingerproteinRoaz2.35NM—030856neuronalleucine-richrepeatprotein-32.246X72859mRNAfortropomyosinisoform62.227NM053582glucocorticoid-inducibleprotein2.225NM—021587NM—022948NM—017064Z75029transforminggrowthfactor-betatricarboxylatecarrier-likeproteinSignaltransducerandactivatoroftranscription5ahsp70.2mRNAforheatshockprotein70Proteolipidproteinvascularendothelialgrowthfactorgenesolutecarrierfamily7A8Musmusculuscofilin22.1572.1512.1352.1062.092.0762.0272.02NM_030990U22372NM—053442XM122409(5)、对候选基因采用RT-PCR进行链式扩增并对链式扩增产物进行凝胶电泳分析排除掉假阳性的候选基因通过OligO引物法分别将试验组和对照组的含候选基因的mRNA逆转录合成cDNA，以各个候选基因为模板设计上、下游引物，本实施方式采用引物设计软件Premier5.0和Oligo6.71进行引物设计，并经Blast验证，内参照基因选用GAPDH基因，其上游引物5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3';下游弓l物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，并分别按下列条件进行链式扩增在90。C一100。C变性0.5分钟，然后在55。C一60。C退火0.5分钟，然后在65。C一75X:延伸l分钟，根据不同基因做18、22、26、30、34个循环，基因的丰度越高，表达数越多，需要的PCR循环数越少。所以，不同的基因，需要做的循环数不同，最后在65'C—75'C延伸10min，取出反应管置于4'C下10分钟，然后将链式扩增产物在含医用染料的2%琼脂糖凝胶上电泳，并对电泳成像图结果进行摄像，本实施方式采用美国PharmaciaBiotech凝胶成像系统对图像结果进行摄像，并以看家基因GAPDH为内参照比对，排除掉假阳性的候选基因。经过本步骤排除掉一些假阳性表达的候选基因，剩余的候选基因如表3所示表3RT-PCR验证后的候选基因列表<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>(6)、对经过RT-PCR排除后剩下的候选基因采用荧光实时定量RT-PCR进行进一步验证得到与自发性高血压病致病相关基因，分别对试验组和对照组中含经过RT-PCR排除后留下的候选基因的mRNA进行荧光实时定量RT-PCR进行进一步验证，反应体系10SYBRGreenPCR缓冲液13ul、5pmo1引物1ul加cDNA模板+双蒸水11ul共25ul，5(TC孵育2分钟，然后95。C，2分钟;接着进行40个循环95°C，15秒；59'C，1分钟。本实施方式本步骤采用实时定量RT-PCR仪(ABIPrism7000)来完成，且分别对试验组和对照组的RNA做至少3次条件完全相同的PCR反应孔。最终确定与自发性高血压致病相关基因，如表4所示，表4定量RT-PCR验证的自发性高血压致病相关基因<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>权利要求1.一种寻找自发性高血压病致病相关基因的方法，其特征是包括以下步骤(1)、试验组和对照组的选取以及组织采集选取至少三只纯种患有自发性高血压病的哺乳动物作为试验组，选择与试验组同物种且数量相同的血压正常的哺乳动物作为对照组，并分别对试验组和对照组中的哺乳动物的阻力血管组织和肾脏组织进行采集；(2)、总RNA和mRNA的提取分别从试验组和对照组中采集到的阻力血管组织和肾脏组织中提取总RNA并进一步分离提取mRNA；(3)、mRNA逆转录合成cDNA分别将试验组和对照组中提取的mRNA通过逆转录酶逆转录成cDNA；(4)、利用基因芯片法初步筛选有差异表达的候选基因利用至少含10,000大鼠基因片段的芯片比较试验组和对照组的基因表达水平，寻找出在试验组基因表达水平上调的一组候选基因和下调的一组候选基因；(5)、对候选基因采用RT-PCR进行链式扩增并对链式扩增产物进行凝胶电泳分析排除基因芯片法获得的候选基因中的假阳性基因分别对试验组和对照组候选基因的mRNA通过逆转录DNA合成酶逆转录合成cDNA，并对cDNA进行链式扩增，然后再对链式扩增产物进行凝胶电泳分析排除假阳性的候选基因；(6)、对经过RT-PCR排除后剩下的候选基因采用荧光实时定量RT-PCR进行进一步验证得到与自发性高血压病致病相关基因。2.根据权利要求1所述的一种寻找自发性高血压病致病相关基因的方法，特征在于所述的试验组选用三只13周龄的自发性高血压大鼠，所述的对照组选用三只13周龄的正常大鼠。3.根据权利要求1或2所述的一种寻找自发性高血压病致病相关基因的方法，其特征在于所述的步骤4为使用Cy3-dUTP标记试验组总RNA，使用Cy5-dUTP标记对照组总RNA，再对标记过的试验组和对照组中的总RNA进行反转录制备两组cDNA探针，将含io,ooo个大鼠基因表达谱芯片和探针分别在95t:水浴中变性5分钟，将探针加在大鼠表达谱芯片上，用盖玻片封片，置于42"C杂交12-20小时，冲洗盖玻片，洗涤，室温晾干，再通过基因芯片读片仪进行扫描分析。4.根据权利要求3所述的一种寻找自发性高血压病致病相关基因的方法，其特征在于所述的步骤5为通过Oligo引物法分别将试验组和对照组的含候选基因的mRNA逆转录合成cDNA，并以候选基因为模板设计上、下游引物，并经Blast验证，内参照基因选用GAPDH基因，其上游引物5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3';下游弓l物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，并分别按下列条件进行链式扩增在90。C一100。C变性0.5分钟，然后在55。C—60'C退火0.5分钟，然后在65。C—75'C延伸l分钟，根据不同基因做18、22、26、30、34个循环，最后在65'C—75。C延伸10min，取出反应管置于fC下10分钟，然后将链式扩增产物在含医用染料的2%琼脂糖凝胶上电泳，并对电泳成像图结果进行摄像，并以看家基因GAPDH为内参照比对，排除掉假阳性的候选基因。5.根据权利要求4所述的一种寻找自发性高血压病致病相关基因的方法，其特征在于所述的步骤6为分别对试验组和对照组中含经过RT-PCR排除后留下的候选基因的mRNA进行荧光实时定量RT-PCR进行进一步验证，反应体系为10SYBRGreenPCR缓冲液13ul、5pmol引物lul、cDNA模板+双蒸水11ul共25ul，5(TC孵育2分钟，然后95"C水浴变性2分钟;接着进行40个循环95"C下变性15秒再59'C下孵育1-3分钟。6.根据权利要求5所述的一种寻找自发性高血压病致病相关基因的方法，其特征在于所述的步骤6分别对试验组和对照组的RNA做至少3次条件完全相同的PCR反应孔。全文摘要本发明公开了一种寻找自发性高血压病致病相关基因的方法，对试验组和对照组的阻力血管组织和肾脏组织进行采集，并通过基因芯片法、RT-PCR、实时定量RT-PCR逐次筛选验证，排出假阳性的候选基因，来获得与自发性高血压病致病相关基因。本发明的优点在于通过对试验组和对照组的阻力血管组织和肾脏组织进行采集，并通过基因芯片法、RT-PCR、实时定量RT-PCR逐次筛选验证，排出假阳性表达的候选基因，比较可靠稳定地寻找到与自发性高血压病致病相关基因，并且本发明选用阻力血管组织和肾脏组织作为组织采集对象，使寻找到的基因更加可靠，另外本发明寻找与自发性高血压病致病相关基因的方法，对建立新的高血压诊断方法以及开发高血压病新的基因治疗药物具有非常重要的意义。文档编号C12Q1/68GK101265499SQ20081002357公开日2008年9月17日申请日期2008年4月8日优先权日2008年4月8日发明者杨德业申请人:杨德业