专利名称：：用载肝细胞生长因子聚乳酸-o-羧甲基壳聚糖纳米粒子的肝细胞培养方法
技术领域：
：本发明涉及一种肝细胞的培养方法。
背景技术：
：急性肝衰竭死亡率高达70%。肝细胞移植可以起到一定的肝功能支持和促进肝再生作用。由于其具有操作简单、对机体生理环境干扰小、供体来源广泛等优点，己引起了众多研究者的广泛关注。然而，如何提高移植肝细胞的活性、降低免疫排斥反应和促进受体肝再生是急需解决的三大问题。
发明内容本发明的目的在于提供一种可有效促进肝细胞生长、提高肝细胞活力的用载肝细胞生长因子聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子的肝细胞培养方法。本发明的技术解决方案是一种用载肝细胞生长因子(HGF)聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子的肝细胞培养方法，其特征是在肝细胞培养时，将载肝细胞生长因子聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子与肝细胞混合进行接种培养。所述载肝细胞生长因子聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子是通过下列步骤制得将载肝细胞生长因子加入到聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子悬浮溶液中，在4"C、800rpm电磁搅拌的条件下充分反应4小时，然后10000rpm高速离心、蒸馏水洗涤、冷冻抽干，得到固化的载HGF聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子。肝细胞培养时，培养温度为3538。C，且5。/。C02条件下培养，培养12小时内，每30分钟振荡一次，每次持续5分钟。肝细胞与载肝细胞生长因子聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子的用量关系为5xl()S个/ml肝细胞与40吗/ml的载HGF聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子相混合接种。本发明可有效促进肝细胞生长，提高肝细胞活力，必定对肝细胞培养技术的发展起到巨大的推动作用。实验证明，与普通肝细胞培养相比较，本发明培养的肝细胞形成球形聚集体的时间明显縮短，球形聚集体的比例明显增加，细胞形态好，培养后第2天至第7天，采用CCK-8体外细胞增殖试剂盒检测培养肝细胞的活力，发现载HGF纳米培养组生成黄色甲臢染料的量高于普通培养组(P<0.05)。表明载HGF纳米培养组活细胞数目多于普通培养组，载HGF纳米粒子在体外能够持续地促进大鼠肝细胞生长和活性的保持。下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。图1是载肝细胞生长因子聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子透射电镜照片。图2是载肝细胞生长因子聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子扫描电镜照片。下面结合实施例对本发明作进一步说明。具体实施例方式聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖(PLA-O-CMC)纳米粒子的制备将10ml浓度为0.03%的PLA(聚乳酸)二氯甲烷溶液与10ml浓度为0.15W的O-CMC溶液在超声情况下充分反应(约25分钟左右)，待其中的有机溶剂挥发完全后得到乳光较重的均匀悬浊液。将此悬浊液先以2000rpm低速离心5分钟，取低速离心后所得的上清液以14000rpm高速离心10分钟，得到部分白色沉淀，吸去部分上清液，将沉淀用蒸馏水离心洗涤两次后，将沉淀冷冻抽干取出并行钴-60辐照消毒后备用。载HGF的聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子的制备称取5mgPLA-O-CMC纳米粒子放入5ml去离子水中进行超声波分散，制得纳米粒子悬浮溶液。取5吗HGF加入5mlPLA-OCMC纳米粒子悬浮溶液中，在4"C、800rpm电磁搅拌的条件下充分反应4小时，然后10000rpm离心、蒸馏水洗涤、冷冻抽干，得到固化的载HGF的聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子。载HGF聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子的表征透射电子显微镜观察取5mg固化的载HGF的PLA-O-CMC纳米粒子放入5ml去离子水中进行超声波分散，制得纳米粒子悬浮溶液。然后将少量悬浮溶液滴到已载膜的铜网上，用滤纸吸去多余的液体，晾干后即制成样品，透射电子显微镜观察载HGF的PLA-O-CMC纳米粒子的结构、粒径及表面形貌。激光粒度仪/zeta电位仪测试:用激光粒度仪/zeta电位仪检测上述载HGF的PLA-O-CMC纳米粒子悬浮溶液中载HGF纳米粒子的粒径和表面电位。载HGF的PLA-O-CMC纳米粒子载药率与包封率的测定载药率(drugloading,LD)是指微粒中药物的质量百分比，包封率(embeddingmtio，ER)是指微粒中药物量与投入制备体系中的药物量的质量百分比。分别通过以下公式计算载药率和包封率载药率=纳米粒子中HGF含量/纳米粒子质量xl00。/a，包封率=纳米粒子中HGF含量/HGF投入量xl00%。采用改良超声乳化法制得的载HGF的PLA-O-CMC纳米粒子具有较为光滑的表面形貌和相对均一的粒径分布，其平均粒径为B9.82nm，粒径分布指数为0.108，粒子的表面电位为32.8eV，载药率为0.12665%，包封率为76.32%。具有较为明显的核-壳结构存在，微粒表面有较为均匀的高聚物包裹，粒子的表面电位为32.8eV。这表明该纳米粒子表面有较强的正电荷，便于载HGF纳米粒子和带负电荷的肝细胞相接触实现药物的靶向治疗。称取一系列载HGF纳米粒子，每份lmg，分别装入离心管中，加入lmlpH7.4的PBS溶液；将离心管放在37°C的水浴恒温振荡器内(频率60rpm)，并计时，间隔一段时间取出一个离心管离心沉淀(14000rpm)载HGF纳米粒子，将上清液和沉淀分别收集。用ELLISA法检测上清液中HGF的含量，并用酸度计测定释放液的pH值，用冷冻抽干机冷冻干燥释放后的纳米粒子并精确称重。重复试验3次，取平均值，绘制载HGF微粒释放曲线。通过动态观察载HGF纳米粒子体外降解过程发现初制的载HGF纳米粒子呈球形，具有光滑的表面形貌和相对均一的粒径，且具有明显的核-壳结构存在，表面有一层高聚物包裹。经过15天的释放和降解，粒子表面皱縮变形、体积变大、部分粒子崩塌失去球状外形。45天后，载HGF纳米粒子进一步释放和降解，大多数粒子降解为絮状物质，少部分粒子仍有核-壳结构。随着纳米粒子的不断降解，将出现质量损失，主要发生本体降解。对纳米粒子在体外的释药行为研究发现载HGF纳米粒子前24小时的降解可以分为高速释药，中速释药，低速释药3个阶段，前24小时的释药动力学方程为Q=148.4266+189.0493t1/2(R=0.97589)，符合Huguchi方程。载HGF纳米粒子在前30天内的的释药行为可以分为早期药物突释阶段，后期稳定释放阶段。释放动力学方程Q4086.28966+58.23938t(R=0.99716)，符合零级释放方程。大鼠肝细胞的分离和培养采用Seglen原位两步灌流法分离大鼠肝细胞。将分离所得肝细胞进行培养将肝细胞以5xl()S个/ml与40昭/ml的载HGF聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子相混合接种到培养板上(lml/孔)，置于37'C，5%(302条件下静置培养，培养12小时内，每30分钟振荡一次，每次持续5分钟，以促进载纳米粒子与肝细胞的结合且有利于细胞集聚形成球形体。培养12小时后，细胞与载HGF纳米粒子紧密结合。培养48小时后，形成细胞粘附聚集的球形体，提高了细胞密度。培养24小时，大部分细胞仍保持圆球状，部分肝细胞向多边形转变，多数肝细胞相互粘连，成束状生长。约培养48小时后，大部分肝细胞重建细胞极性，呈现较典型、均匀的多边形形态特征。为了更好地分析本发明的效果，同时建立了普通培养组对肝细胞进行培养将肝细胞以5xl()S个/ml的浓度接种到培养板上(lml/孔)，置6于37'C，浓度为5%的(302条件下静置培养，培养12小时内，每30分钟振荡一次，每次持续5分钟，以利于细胞集聚形成球形体。普通培养的肝细胞，接种后很快沉于培养板底并贴壁生长，其形态立即由刚分离的圆球形向单层扁平多边形伸展，4872小时后细胞进一步变薄，渐失去多边形特征，肝细胞连接成片生长。培养肝细胞活力检测采用CCK-8体外细胞增殖检测试剂盒检测培养肝细胞活力。CCK-8所含的WST-8在电子载体作用下，能被活细胞线粒体中的脱氢酶还原成具有高度水溶性的黄色甲臢染料(Formazen)，生成的甲臢染料的量与活细胞数目成正比。下面表中将用本发明方法的培养组称为"载HGF纳米粒子培养组"，与普通培养组作比较。表1CCK-8法比较两组培养肝细胞的活力(mean士SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>经统计学处理，培养一天两组细胞活力无较大差异(P〉0.05)，这可能与肝细胞分离培养后第一天正处于潜伏期有关。培养27天，HGF纳米粒子组细胞活力明显高于普通培养组(P<0.05)，说明载HGF纳米粒子对体外培养大鼠肝细胞的增殖有明显的持续的促进作用。通过研究载HGF聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子对体外培养大鼠肝细胞发现，该载HGF纳米粒子在体外能够持续地促进大鼠肝细胞生长。权利要求1、一种用载肝细胞生长因子聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子的肝细胞培养方法，其特征是在肝细胞培养时，将载肝细胞生长因子聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子与肝细胞混合进行接种培养。2、根据权利要求1所述的用载肝细胞生长因子聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子的肝细胞培养方法，其特征是所述载肝细胞生长因子聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子是通过下列步骤制得将载肝细胞生长因子加入到聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子悬浮溶液中，在4°C、800rpm电磁搅拌的条件下充分反应4小时，然后10000rpm高速离心、蒸馏水洗涤、冷冻抽干，得到固化的载HGF聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子。3、根据权利要求1或2所述的用载肝细胞生长因子聚乳酸-0-羧甲基壳聚糖纳米粒子的肝细胞培养方法，其特征是肝细胞培养时，培养温度为3538。C，且5%(302条件下培养，培养12小时内，每30分钟振荡一次，每次持续5分钟。4、根据权利要求1或2所述的用载肝细胞生长因子聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子的肝细胞培养方法，其特征是肝细胞与载肝细胞生长因子聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子的用量关系为5xl()S个/ml肝细胞与40)ig/ml的载HGF聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子相混合接种。全文摘要本发明公开了一种用载肝细胞生长因子聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子的肝细胞培养方法，在肝细胞培养时，将载肝细胞生长因子聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子与肝细胞混合进行接种培养。本发明可有效促进肝细胞生长，提高肝细胞活力，必定对肝细胞培养技术的发展起到巨大的推动作用。文档编号C12N5/06GK101250498SQ20081002347公开日2008年8月27日申请日期2008年4月7日优先权日2008年4月7日发明者常仁安,李志峰,钟陈申请人:南通大学附属医院