针对活性肝生长因子激活剂的特异抗体和应用该抗体的方法

专利名称：针对活性肝生长因子激活剂的特异抗体和应用该抗体的方法
技术领域：
本发明涉及用于特异地检测活性肝细胞生长因子激活剂(HGFA)的抗体或单克隆抗体，应用该抗体的方法和检测试剂盒。本发明还涉及用活性的HGFA作为指示以检测具有病理症状患者的疾病，特别是器官炎症，肾小球肾炎，癌症，心绞痛，心肌梗塞或血栓溶解的方法，并进一步涉及收集适宜实施该方法的生物组分和血液的方法。
已知肝生长因子激活剂(此后简写为“HGFA”)是一种丝氨酸蛋白酶，在其活性中心有一丝氨酸残基(Miyazawa等人.，生物化学杂志，268，pp.10024-10028，1993)。与包含于凝血/纤维蛋白溶解作用系统级联体中的一般血液蛋白酶不同，HGFA具有作用于肝生长因子(此后简写为“HGF”)的独有特性，已知肝生长因子是与肝细胞生长或器官再生相关的细胞因子(Naka等人，生物化学杂志267，pp.20114-20119，1992)，HGFA特异地且有限地分解HGF并由此激活它(Shimomura等人.，细胞技术，8，pp.219-229(1992))。但是，对于HGFA的作用，仅在用大鼠进行的动物模型实验或体外实验(Miyazawa等人.，生物化学杂志，271，pp3615-3618，1996)中其对HGF的激活作用是已知的，HGFA在人病理条件下的作用和功能，以及其在血液中的水平与病理学症状之间的关系都不清楚。
对于HGFA，已知其中一个由SDS-PAGE确定的分子量约为96,000-98,000(此后简写为“98kDa HGFA”)，一个是分子量约为34,000-38,000(此后简写为“36kDa HGFA”)，后者是对该蛋白从翻译起始氨基酸起算第372位的精氨酸和第373位的缬氨酸之间的键进行有限的蛋白水解而得到的位于该蛋白C末端一侧的肽。分子量的变化是由糖链结合量的异质性引起的，而所测得的分子量的数值上的差异是由于SDS-PAGE测定是分别在还原或非还原条件下进行而造成的，它们实质上是相同的蛋白。而且，每一HGFA通常是作为非活性底物存在于血液中，但对其在从翻译起始氨基酸起算第407位的精氨酸和第408位的异亮氨酸之间的键进行有限的蛋白水解，可将其激活，从而使单链的HGFA转化成由二硫键异源二聚体化的双链HGFA。据认为这一激活的HGFA可以特异地激活底物HGF(Shimomura等人.，生物化学杂志.，268，pp.22927-22932，1993)。
为分析HGFA血液水平和病理学症状之间的关系，存在于生物组分如人体组织，体液或血液中的活性HGFA需经特异地测定。而且为特异地检测或测定活性HGFA，必须获得一种抗体，特别优选的极为特异地识别活性的HGFA，而基本上不识别非活性的HGFA单克隆抗体。但任何具有此种特性的抗体至今未见报道。而且，没有特异地用于检测存在于生物组分，如人体血液中的活性HGFA的方法或试剂盒。
发明概述据此，本发明的一个目的是提供一种抗体，其可特异地识别活性的HGFA，而基本上不识别非活性的HGFA，一种应用上述抗体检测活性HGFA的方法，以及检测与活性HGFA相关疾病的方法和试剂盒。
本发明的发明人构建了一个对血液中的HGFA进行定量的系统，用以分析血液中HGFA的水平和有关人体病理学症状的多种人类疾病之间的关系。首先，他们用已知的针对HGFA的现有的鼠单克隆抗体7E10，P1-4，A-1，A-6，A-23，A-32，A-51，A-75通过双抗夹层方法(酶联免疫吸附分析，此后简写为“ELISA检测系统”)构建了酶标抗体检测系统(Miyazawa等人.，生物化学杂志.，271，pp 3615-3618，1996)。而且，他们分析了在健康的供试者和具有多种疾病，包括器官疾病的患者血液(血浆和血清)中HGFA单克隆抗体的反应性。但是用这些单克隆抗体通过ELISA检测系统检测，发现在包括正常供试者在内的所有人体血样中都呈现出一致的强反应性，而没有对人类疾病特异的反应性，也就是说，没有检测到HGFA血液水平标志性的变化。因此，本发明的发明人分析了目前存在的针对HGFA的单克隆抗体的对HGFA反应性，以探究其中原因。
首先，由于存在两种形式的HGFA，活性形式和非活性形式，因此分析了针对每一种HGFA的单克隆抗体对HGFA的反应性。更特别地，将活性的和非活性的HGFA粘附于一个固相的盘中，分析了每种单克隆抗体与粘附于固相盘中的HGFA之间的反应性。结果发现，这些单克隆抗体具有与活性HGFA和非活性HGFA均起反应的特性。这些结果表明，用目前存在的单克隆抗体通过ELISA检测系统，检测到了通常大量恒定存在于血液中的非活性的HGFA(Shimomura等人.，生物化学杂志.，268，pp.22927-22932，1993)，或同时检测到痕量的活性HGFA和非活性HGFA。从而发现，用目前存在的单克隆抗体通过ELISA检测系统根本不能揭示HGFA和人类疾病之间的关系。
其后，注意到HGFA存在两种形式的事实，即活性形式和非活性形式，本发明的发明人特异地检测到了激活状态的HGFA存在于人的活体中，并检测了多种人类疾病与具有这些疾病的患者血液中活性HGFA数量之间的关系。通过他们的辛勤工作，第一次成功地生产出了仅识别活性HGFA而基本上不识别非活性HGFA的多克隆抗体和单克隆抗体。而且，他们研究出了与存在于人体生物组分中的活性HGFA起反应，而基本不与非活性的HGFA起反应的方法和试剂盒，即用上述抗体通过免疫分析的方法特异地检测活性HGFA的方法和试剂盒。
而且本发明人第一次发现，当使用本发明的特异地检测活性的HGFA方法和试剂盒时，可以观察到与健康的供试者相比，具有器官紊乱的患者，包括肾小球肾炎患者和癌症患者的血液中，活性HGFA的量显著提高。而且他们还第一次发现，以血液中活性HGFA量升高为指示可以精确地预测血栓的形成，例如心绞痛，心肌梗塞和脑梗塞。
同时，检测了存在于包括人体血液在内的生物组分中的活性HGFA的量后，即需要一种具有良好再现性的方法，以稳定地收集存在于其中的活性HGFA。本发明的发明人检测了在这一方法中添加多种蛋白酶抑制剂等，发现通过添加一种选择性的凝血酶抑制剂阿戈托班可以非常稳定地测定出活性的HGFA，并具有良好的再现性。而且许多详尽研究的结果表明即使将人体血液例如全部血液，血浆和血清的收集起来，阿戈托班也是有效的，在血液组分中用含枸橼酸盐的血浆可以获得非常良好的结果。
本发明是在以上的发现的基础上完成的，并提供下述内容(1)识别活性肝生长因子激活剂(HGFA)而基本上不识别非活性的HGFA的抗体。
(2)如(1)所述的抗体，其对活性HFGA的解离常数为1×10-8M或更低。
(3)如(1)或(2)所述的抗体，其是单克隆抗体。
(4)如(3)所述的抗体，其识别由SDS-PAGE方法确定的分子量约为34,000-98,000的活性HGFA，而基本上不识别非活性的HGFA。
(5)如(4)所述的抗体，其识别由SDS-PAGE方法确定的分子量约为34,000-38,000的活性HGFA。
(6)如(4)所述的单克隆抗体，其由保藏号为FERM BP-7779的杂交瘤产生。
(7)识别活性HGFA而基本上不识别非活性的HGFA的单克隆抗体，所述的活性HGFA是通过非活性的HGFA在从翻译起始氨基酸起算第407位的精氨酸和第408位的异亮氨酸之间进行有限的蛋白水解从而将其激活而获得的，所述非活性HGFA是活性HGFA的前体。
(8)识别活性HGFA而基本上不识别非活性的HGFA的单克隆抗体和活性HGFA与蛋白酶抑制剂的复合物。
(9)产生如(3)到(8)中任意一项的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
(10)测定活性HGFA的方法，包括用一种或多种依照(1)到(8)中任意一项中所述的抗体的免疫学方法特异性测定活性HGFA的步骤。
(11)如(10)项中所述的方法，其中待检测活性HGFA的样品是由疑有某种疾病的供试者或实验动物中收集的生物组分。
(12)如(11)项中所述的方法，其中所述疾病是器官炎症，肾小球肾炎，癌症，心肌梗塞，心绞痛，脑梗塞或血栓形成。
(13)检测疾病的方法，包括检测或测定由怀疑具有某种疾病的供试者收集的生物组分中的活性HGFA的步骤。
(14)如(13)项中的方法，其中所述疾病选自下面的组，该组包括器官炎症，肾小球肾炎，癌症，心肌梗塞，心绞痛，脑梗塞和血栓形成。
(15)如(13)或(14)项所述方法，其中生物组分是血液或其组分或其加工产品。
(16)如(15)项所述方法，其中的生物组分是血浆。
(17)如(16)项所述的方法，其中所述血浆为含枸橼酸盐的血浆。
(18)如(13)到(17)中任意一项的方法，其中将阿戈托班加入到生物组分中。
(19)检测或测定活性HGFA的试剂盒，其中包括一种或多种如(1)到(8)项中任意一项所述的抗体。
(20)如(19)项所述的试剂盒，其用于诊断选自下列组中的疾病，该组包括器官炎症，肾小球肾炎，癌症，心肌梗塞，心绞痛，脑梗塞或血栓形成。
(21)如(19)或(20)项所述的试剂盒，检测或测定由怀疑具有某种疾病的供试者收集的生物组分中的活性HGFA。
(22)如(19)到(21)项中任意一项所述的试剂盒，其中活性的HGFA通过免疫染色的方法进行检测或测定。
(23)用于收集血清，血浆或全部血液的血液收集管，其中加入阿戈托班。
(24)如(23)项所述的血液收集管，其收集用于活性HGFA测定的血清，血浆或全部血液。
在本说明书中，识别活性HGFA而基本上不识别非活性的HGFA的单克隆抗体指“活性HGFA特异性的单克隆抗体”，识别活性HGFA而基本上不识别非活性的HGFA的多克隆抗体指“活性HGFA特异性的多克隆抗体”。而且这些抗体总的称为“活性HGFA特异性的抗体”。“识别活性HGFA”是指通过抗原/抗体相互作用结合于活性HGFA，优选地指对HGFA的解离常数为1×10-8M或更低，更优选1×10-9M或更低。
“基本上不识别非活性的HGFA”是指基本上不通过抗原/抗体相互作用与非活性的HGFA结合。更特异地，“基本上不识别非活性的HGFA”是指非活性的HGFA不能通过常规的免疫分析检测到，对非活性的HGFA的解离常数为1×10-5M或更高。
能根据本发明，其提供了特异结合于活性HGFA而基本上不与非活性的HGFA相结合的单克隆抗体和多克隆抗体。本发明所述的抗体可用于特异地检测或测定活性HGFA。
本发明中特异地测定活性HGFA的方法可以用于诊断多种与活性HGFA在血液中的水平有关的疾病。
附图简要描述

图1示出了单克隆抗体对活性HGFA和非活性HGFA的反应性。
图2示出活性HGFA与蛋白酶抑制剂的复合物与单克隆抗体之间的反应性。
图3示出由活性HGFA测定系统测定的活性HGFA和非活性HGFA与单克隆抗体之间的反应性。图3A示出HGFA的浓度在0-500ng/ml的范围。在图3B中，对图3A中所示的0-55.6ng/ml的HGFA浓度范围的放大。
图4示出健康供试者血清中活性HGFA的量的频率分布图。
图5示出在血清，枸橼酸盐血浆，肝素血浆和EDTA血浆中活性HGFA的储存稳定性的值，以及添加了阿戈托班的效果。
发明的详细描述以下详细阐述本发明。<1>免疫原和筛选用以生产抗活性HGFA的特异抗体的抗原本发明所用术语“活性HGFA”是指具有将其底物肝细胞生长因子(HGF)由非活性的单链HGF形式(Naka等人，生物化学杂志26720114-20119(1992))转化成为活性的双链HGF形式的能力的物质。单链HGF指去除由HGF基因翻译所得的蛋白前体上的信号肽后所得的蛋白，而双链HGF是指异源二聚体，该异源二聚体是从翻译起始氨基酸起算第494位的精氨酸和第495位的缬氨酸之间进行有限的蛋白水解所形成的两条链，经二硫键异源二聚体化形成的。HGFA的活性是指将非活性的单链HGF转化成活性的双链HGF的活性。
活性HGFA特异地包括通过从翻译起始氨基酸起算第407位的精氨酸和第408位的异亮氨酸之间进行有限的蛋白水解而激活在日本公开待审专利申请(Kokai)No.6-153946所公开的HGFA前体蛋白而获得的HGFA。通过SDS-PAGE测定这一活性蛋白通常的分子量约为34,000-98,000，而且已知活性的HGFA是通过N端部分进行有限的蛋白水解而获得的，因此表现为多种分子量(Mitsubishi Kasei R & D Review，8(1)，26-35(1994))。作为这样的HGFA的例子有由还原条件下的SDS-PAGE方法测定分子量约为98,000的一种，与从翻译起始氨基酸起算第88位的精氨酸和第89位的丙氨酸之间进行有限的蛋白水解而获得的C末端相对应并且显示HGFA的分子量为80,000的一种，与从翻译起始氨基酸起算第372位的精氨酸和第373位的缬氨酸之间进行有限的蛋白水解而获得的C末端侧肽相对应并且显示HGFA的分子量为36,000的一种。依所结合的糖链的量的异质性，以及分子量的测定方法和纯化方法的不同，前面提到的分子量为98,000的活性HGFA，其分子量可在约96,000到98,000的范围，前面提到的分子量为36,000的活性HGFA，其分子量可在约34,000到38,000的范围。因此，这里所指的活性HGFA并为其分子量所限，而是包含了那些对底物HGF具有激活作用的分子。
可依照Shimomura等人，生物化学杂志26822927-22932(1993))所述的方法等，用从人体血液纯化的那些活性的或非活性的HGFA用作筛选单克隆抗体等的免疫原。而且，也可以利用由日本公开待审专利申请(Kokai)Nos.6-153966和6-153946，US5466593和US5677164公开的HGFA的cDNA和微生物例如大肠杆菌，及昆虫细胞，酵母，动物细胞或动物所获得的重组蛋白HGFA。
为了获得对活性HGFA特异的抗体，具体说来，需要制备不含非活性HGFA的高纯度活性HGFA和不含活性HGFA的高纯度非活性HGFA作为免疫抗原或筛选用抗原。为了这些目的，优选地使用由HGFA的cDNA获得的重组蛋白作为本发明中所使用的活性HGFA和非活性HGFA。例如，重组蛋白可通过下述方法获得，该方法包括将由日本公开待审专利申请(Kokai)Nos.6-153946公开的编码全长或部分HGFA前体的HGFA cDNA插入合适的载体，将此载体引入微生物例如大肠杆菌，昆虫细胞，酵母，动物细胞或动物，然后对转基因细胞的培养物上清液，细胞内容物，组织或体液进行纯化。
也可以不用细胞系统，而采用快速翻译系统RTS 500(罗氏诊断)之类的体外转录和翻译系统来生产靶HGFA。
具体地说，可以用将编码655个氨基酸的HGFA cDNA插入动物细胞表达载体启动子下游所获得的表达载体的方法，上述cDNA序列相应于日本公开待审专利申请(Kokai)Nos.6-153946公开的包括信号肽序列的全长非活性HGFA前体；或应用通过将合适的信号肽序列与编码HGFA前体从翻译起始氨基酸起算第373位的缬氨酸起的C末端部分的cDNA相连接所获得的动物细胞表达载体的方法，上述的cDNA由日本公开待审专利申请(Kokai)Nos.6-153966所公开；或通过将合适的信号肽序列与编码有发挥HGFA活性的能力的区域的cDNA相连接，所获得的动物细胞表达载体的方法。HGFA重组蛋白可以通过下述方法获得，即将上述任何一种表达载体引入动物细胞，然后选择表达HGFAcDNA的细胞，在从细胞培养物上清液中纯化所需HGFA。
通过上述方法获得的HGFA重组蛋白一般为非活性的HGFA。可以参考Shimomura等人.(生物化学杂志.，26822927-22932(1993))的方法，向非活性的HGFA中添加适量的凝血酶和葡聚糖硫酸脂或血管舒缓素和凝血酶来激活这种非活性的HGFA。通过凝胶过滤或用HPLC进行亲和层析进行纯化可以提高用上述方法激活的HGFA的纯度。
经纯化的高纯度活性HGFA和非活性HGFA不仅作为免疫原是重要的，其在通过亲和纯化选择对活性HGFA特异的多克隆抗体或筛选对活性HGFA特异的单克隆抗体时也是非常重要的物质。
作为本发明的发明人详尽研究的结果，他们发现纯化的非活性的HGFA非常不稳定，通过掺入少量杂质可以将其激活。若这样使用掺有活性HGFA的非活性HGFA，或相反，使用掺有非活性HGFA的活性HGFA，将很难获得对活性HGFA特异的多克隆抗体或对活性HGFA特异的单克隆抗体。因此，本发明的发明人研究了多种蛋白酶抑制剂作为制备非活性HGFA时防止人工激活作用的抑制剂。结果，他们发现添加阿戈托班(Mitsubishi-Tokyo Pharmaceuticals)十分有效，阿戈托班是对HGFA选择性的凝血酶抑制因子。也就是说，在纯化非活性的HGFA或筛选单克隆抗体时，向非活性的HGFA中添加阿戈托班可以防止人工激活作用及活性HGFA的污染。用这种方法制备的活性HGFA，适宜作为在制备对活性HGFA特异的抗体的免疫学作用中的抗原，也可用作选择和纯化可识别活性HGFA而基本上不识别非活生的HGFA的抗体的材料。
另一方面，非活性的HGFA适合于作为制备可识别非活性的HGFA而基本上不识别活性HGFA的抗体的免疫反应中的抗原，而且它可以用作选择，吸收或去除除可识别活性HGFA而基本上不识别非活性HGFA的抗体之外的抗体的物质。
可以用一种位于表现出活性HGFA和非活性HGFA之间一级结构(氨基酸序列)序列不同或构象不同的位点的肽作为用于制备对活性HGFA特异的抗体的免疫反应的抗原或筛选用抗原。例如，可以采用在仅暴露于活性HGFA蛋白表面而不暴露于非活性的HGFA蛋白表面的位点的肽。这样的蛋白构象通常可由本领域的技术人员所预测，其三维构象结构也可以在活性和非活性的HGFA的氨基酸序列的基础上通过计算机程序描绘出来。通过对两种构象进行比较可以发现作为表现出对活性HGFA具有特异的反应性的抗体结合位点的区域(抗原位点)，并将通过合成该区域的部分氨基酸序列所获得的肽用作免疫原。
而且，也可能发现一个区域，该区域作为表现活性和非活性的HGFA之间不同的位点，上述不同为二者亲水性或疏水性不同，基于Cho-Fasman方法或Robson方法等对其二级结构分析结果不同，或基于用蛋白结构分析软件，例如GENETYX(SOFTWARE开发公司)对HGFA的氨基酸序列进行分析的信息表明其抗原性不同，并可以将通过合成该区域的部分氨基酸序列所获得的肽用作免疫原或筛选抗原。例如，活性的HGFA有通过在从翻译起始位点起算第407位的精氨酸和第408位的异亮氨酸之间进行有限的蛋白水解HGFA前体蛋白所获得的氨基酸序列。另一方面，非活性的HGFA的氨基酸序列中第407位的精氨酸和第408位的异亮氨酸是相连的。因此，仅存在于活性的HGFA中，而不存在于非活性的HGFA中的氨基酸序列，即含第407位的精氨酸作为C末端的和几个氨基酸存在于其N末端的肽可以被利用。下述是作为这种肽可选择的例子。序列2到12的氨基酸序列是相应与从序列1(SEQ ID NO1)N端进行氨基酸残基逐个缺失所形成的序列。
序列1GRRHKKRTFLRPR序列2 RRHKKRTFLRPR序列3 RHKKRTFLRPR序列4 HKKRTFLRPR序列5KKRTFLRPR序列6 KRTFLRPR序列7 RTFLRPR序列8 TFLRPR序列9FLOPR序列10LOPR
序列11 OPR序列12 PR另外，作为仅存在于活性HGFA中而不存在于非活性HGFA中的氨基酸序列，即含第408位的异亮氨酸作为其N末端和氨基酸存在于其C末端的肽，下述是可以选择的例子。序列14到24的氨基酸序列是相应与从序列13(SEQ IDNO2)C端进行氨基酸残基逐个缺失所形成的序列。
序列13IIGGSSSLPGSHP序列14IIGGSSSLPGSH序列15IIGGSSSLPGS序列16IIGGSSSLPG序列17IIGGSSSLP序列18IIGGSSSL序列19IIGGSSS序列20IIGGSS序列21IIGGS序列22IIGG序列23IIG序列24II另外，作为仅存在于非活性HGFA中而不存在于活性HGFA中的氨基酸序列，即含从翻译起始位点起算，HGFA前体的第407位的精氨酸和第408位的异亮氨酸(序列25的第13和14位之间)相连的氨基酸序列的肽，例如序列25(SEQ ID NO3)是可选择的。
序列25GRRHKKRTFLRPRIIGGSSSLPGSHP当这些肽作为免疫作用的抗原时，通常期望利用那些结合于作为载体的蛋白或多聚体上，例如KLH(匙孔血蓝蛋白)，BSA(牛血清白蛋白)和OVA(卵清白蛋白)的肽作为免疫作用的抗原。例如，可以合成包含序列1到12之一的肽，在其N末端添加半胱氨酸，包含序列13到24之一的肽，在其C末端添加半胱氨酸，包含序列25的肽，在其N末端或C末端添加半胱氨酸，与Imject马来酰亚胺激活的载体蛋白(PIERCE)相连接，用作免疫作用的抗原。
而且，也可以用由相应于序列1到25中任意一序列的cDNA与作为载体蛋白的cDNA相连接的cDNA编码的融合蛋白，用遗传工程的方法在多种细胞中表达包含由上述的两部分编码的肽的融合蛋白，并纯化融合蛋白。包含序列1到24中任何一项的肽适于作为获得对活性HGFA特异的抗体的免疫作用的抗原，也可以用作选择和纯化对活性HGFA特异的抗体的物质。另一方面，类似序列25所示的肽适于作为获得可识别非活性HGFA而基本上不识别活性HGFA的抗体的免疫作用的抗原，也可以用作吸收或去除除对活性HGFA特异的抗体之外的抗体的物质。<2>识别活性HGFA而基本上不识别非活性的HGFA的单克隆抗体的生产为了获得对活性HGFA特异的单克隆抗体抗体，经常使用的免疫学方法是用前述的活性HGFA作为免疫反应的抗原。例如，使用活性的98kDa HGFA，活性的36kDa HGFA，或二者的混合物。
而且，用上述的方法将含序列1到24中任意序列的肽与载体融合，一种或多种这样的物质可以混合起来用作免疫反应的抗原。而且，可以使用含活性HGFA的特定抗原位点的肽。
用于免疫反应的动物无需特别限定，兔，山羊，绵羊，小鼠，大鼠，豚鼠，鸡等的任何一种均可使用。用于免疫反应的抗原与弗氏完全佐剂、弗氏非完全佐剂等充分混合，然后通过皮下，肌内，腹膜内方式接种于动物。每2到5周进行一次接种，连续进行直到所免疫动物体内针对所接种抗原的抗体效价足够高。然后仅将抗原通过静脉内方式注射于所免疫的动物，三天后，收集据认为包含抗体产生细胞的脾和淋巴结，再将脾细胞和淋巴结细胞与肿瘤细胞融合。其后分离由细胞融合(杂交瘤)无限增殖的抗体生成细胞。虽然这里所用的肿瘤细胞与所制备的脾细胞或淋巴细胞应源于同种的被免疫动物，但也可以用异种动物的肿瘤细胞。
可使用的肿瘤细胞的例子包括，骨髓瘤细胞例如p3(p3/x63-Ag8)，P3U1，NS-1，MPC-11，SP 2/0，FO，x63.6.5.3，S194和R210。可以通过普通的方法进行细胞融合，可依照例如“单克隆抗体实验手册”(Kodansha Scientifec，1987)中所述的方法进行。可通过向悬浮有待融合细胞的融合培养基中添加细胞融合促进剂进行细胞融合。细胞融合促进剂的例子包括仙台病毒，平均分子量为1000到6000的聚乙二醇等。此种情况下，为进一步提高融合效率还可以向融合培养基中添加辅助物质，例如二甲亚砜，细胞因子，如IL-6等。至于肿瘤细胞与所免疫的脾细胞或淋巴细胞的混合比例，例如所使用的脾细胞或淋巴细胞的量可约10倍于相关肿瘤细胞。
对于前述的融合培养基，可以使用多种常用的培养基，如ERDF培养基，RPMI-1640培养基和MEM培养基，且在融合过程中一般应从培养基中去除血清，如胎牛血清(FBS)。融合是通过下述方式进行的，将预定量的用于上述免疫反应的脾细胞或淋巴细胞与肿瘤细胞在上述培养基中充分混合，添加约20％到50％量的预先保温于约37℃的聚乙二醇，优选地使其在30℃到37℃反应约1分钟到10分钟。此后，重复进行下列操作偶尔添加合适的培养基，离心培养基和去除上清。
靶杂交瘤在常规的选择培养基，例如HAT培养基(含次黄嘌呤，氨基蝶呤，胸腺嘧啶脱氧核苷的培养基)中培养。培养物需在这种HAT培养基中培养一段时间，足以使除杂交瘤之外的细胞(非融合细胞等)被杀死，通常需要几天到几周。对于获得对活性HGFA特异的单克隆抗体，技术上最关键的一点是其筛选。可以用前述的物质，如活性的HGFA和非活性的HGFA，通过多种免疫学方法进行分析，来筛选产生对活性HGFA特异的单克隆抗体的杂交瘤。例如，可以通过活性或非活性的HGFA作为用于筛选的抗原，通过诸如ELILSA，Western印迹分析等酶免疫测试方法分析用于筛选的抗原与分泌于杂交瘤培养物上清液中的单克隆抗体的结合来筛选靶杂交瘤。
具体地说，活性HGFA附着于筛选平皿之类物体上，所述平皿用BSA之类封闭，然后加入上述的杂交瘤培养物上清液来筛选可分泌识别活性HGFA的抗体的杂交瘤。将所选出的杂交瘤加入附着于用BSA之类封闭的筛选平皿之类的物体上的非活性的HGFA，进一步筛选能分泌不识别这一非活性HGFA的抗体的杂交瘤。例如，用于筛选的杂交瘤的培养物上清液加入进行ELISA且附着有活性HGFA和非活性HGFA的平皿中，使其反应，经过充分洗涤操作后，向平皿中加入抗鼠IgG多克隆抗体进一步反应。清洗后，通过检测标记来筛选杂交瘤，该杂交瘤培养物上清液表现出对附着有活性HGFA的平皿有反应性而对附着有非活性的HGFA的平皿没有反应性。可选用多种酶，荧光底物，化学发光底物，放射性同位素，生物素，抗生物素蛋白等作为标记，这将在后面进行描述。
通过上述筛选，可以获得产生识别活性HGFA而基本上不识别非活性HGFA的单克隆抗体的杂交瘤。而且，在筛选这种杂交瘤的过程中，可用与含上述的序列1到24中任一序列的肽反应而不与含序列25的肽反应的抗体作为标记。对于通过这种方式筛选出的杂交瘤所产生的抗体，优选地进一步确证该抗体与活性HGFA反应而不与非活性的HGFA反应。
上述抗体的反应性可通过测定其对活性或非活性HGFA的解离常数来确证。本发明的抗体对活性HGFA的解离常数优选地为1×10-8M或更低，更优选1×10-9M或更低。对非活性HGFA的解离常数优选地为1×10-5M或更高。
所获得的杂交瘤可以通过有限稀释的方法克隆，以获得产生单一种类单克隆抗体的杂交瘤克隆。这一杂交瘤克隆在添加了约1-5％已预先去除了其中的牛抗体的FBS培养基中培养，或在无血清的培养基中培养，所获得的培养物上清液可作为纯化靶单克隆抗体的粗提物。进而，可将所获得的杂交瘤转入预先用降植烷醇处理过的Balb/C小鼠或Balb/c小鼠(nu/nu)的腹腔内，10到14天后抽提含高浓度单克隆抗体的腹水，用其作为纯化靶单克隆抗体的粗提物。对于纯化单克隆抗体的方法，可以用常规的纯化免疫球蛋白的方法，可通过下述方法进行，例如硫酸铵分级分离，聚乙烯分级分离，乙醇分级分离，离子交换层析，用蛋白A或蛋白G进行亲和层析等。<3>识别活性HGFA而基本上不识别非活性的HGFA的多克隆抗体的制备为获得对活性HGFA特异的多克隆抗体，可以用活性HGFA或非活性的HGFA作抗原进行免疫反应，从源于所免疫动物的多克隆抗体中纯化识别活性HGFA而基本上不识别非活性的HGFA的抗体。
而且，作为为了获得多克隆抗体的免疫反应的抗原，可以应用上述包含对非活性HGFA特异的抗原位点的肽和载体的融合物。例如，一种或多种与载体蛋白或多聚体化合物相融合且含序列1到25中任意一序列的肽的物质可以混合用作免疫反应的抗原。用于免疫反应的动物并没有特别的限定，兔，山羊，绵羊，小鼠，大鼠，豚鼠，鸡等中的任意一种均可使用。用于免疫反应的抗原与弗氏完全佐剂、弗氏非完全佐剂等充分混合，然后通过皮下，肌内，腹膜内方式接种于动物。每2到5周进行一次接种，连续进行直到所免疫动物体内相对所接种抗原的抗体效价足够高。然后仅将抗原通过静脉内方式注射于所免疫的动物，3到5天后，收集抗血清。
从所得抗血清中纯化多克隆抗体的方法，可以用常规的纯化免疫球蛋白的方法，可通过下述方法进行例如，硫酸铵分级分离，聚乙烯分级分离，乙醇分级分离，离子交换层析，用蛋白A或蛋白G进行亲和层析等。
获得活性HGFA特异的多克隆抗体的纯化操作可以以任意的方法进行，只要该方法可以分级分离或或纯化识别活性HGFA而基本上不识别非活性HGFA的多克隆抗体，这样的方法的例子包括，如离子交换层析，疏水层析，分子筛层析，反向层析，羟基磷灰石层析，亲和层析，凝胶电泳，免疫电泳等。作为一种特异的方法，可以提及的是用固定有活性或非活性的HGFA的树脂进行的亲和柱层析。例如用上述的方法获得的多克隆抗体作为粗提物，用固定有活性或非活性的HGFA的树脂进行的亲和层析。通过这种方法收集存在于非吸附组分中的不与非活性的HGFA结合的多克隆抗体。然后，这一非吸附组分用作进行用固定有活性HGFA的树脂进行的亲和柱层析的粗提物，由此收集存在于吸附组分中的结合于活性HGFA的多克隆抗体。
通过这些方法可以获得对活性HGFA特异的多克隆抗体。而且，另一种亲和层析方法，也可以用包含据认为是对活性HGFA抗原位点特异性氨基酸序列的肽。例如，可以用结合有序列1到25中一种或几种肽的树脂进行亲和层析。例如结合有含序列1到24中任一序列的肽的树脂可以用作纯化活性HGFA特异性多克隆抗体的亲和层析的固定化载体。另一方面，结合有序列25的肽等的树脂可用作吸收或去除除对活性HGFA特异的抗体之外的抗体的亲和层析的固定化载体。<4>特异地测定活性HGFA的方法特异地测定活性HGFA的方法是指，一种方法包括使对活性HGFA特异的抗体与活性HGFA反应的步骤。因此这是一种以测定活性HGFA而基本上不测定非活性HGFA为特征的方法。这一方法可用作多种诊断方法，测定方法和分析方法，其中可以用本发明的对活性HGFA特异的抗体对生物样品中的活性HGFA进行定性或定量的测定。只要该方法是以检测活性HGFA为目的，对这样的方法并没有其它特别的限定。这样的方法的例子包括，如特异的检测活性HGFA的组织染色法和免疫沉淀法，特异检测活性HGFA的竞争结合分析法，直接或间接夹层分析法，双抗夹层分析法等。而且，检测方法的例子还包括酶免疫分析法，放射免疫分析法，荧光免疫分析法，化学发光免疫分析法，免疫印记法，免疫层析法，乳胶凝集法等等。
免疫印记应用的例子包括那些应用结合于微阵列或芯片上的对活性HGFA特异的抗体的方法。也可以用荧光标记物标记对对活性HGFA特异的抗体，用荧光去极化的方法或荧光相关差异法检测其与活性HGFA的相互作用。也可以通过用表面胞质团谐振装置测定对活性HGFA特异的抗体与活性HGFA之间的相互作用。例如可以定量测定生物组分中活性的HGFA将含活性HGFA的生物组分流加到附着有该抗体的传感芯片的表面胞质团谐振装置，并示踪反应信号随时间的变化。
本方法中所用特异性测定活性HGFA的抗体，例如一种活性HGFA特异性抗体，可按自身使用，也可用作通过常规木瓜蛋白酶处理得到Fab形式的抗体，或者以通过胃蛋白酶处理得到的F(ab′)2或F(ab′)形式，进一步说，一种具有识别活性HGFA而基本上不识别无活性HGFA特性的抗体片段也属本发明的保护范围。这样的片段包括，例如一种包含一个互补决定子区(CDR)或在活性HGFA特异性抗体等等的重链和轻链可变区域高变区的片段双抗体夹层测定法用于定量测定生物组分中活性HGFA可以是以下例子一种特异性测定活性HGFA的方法包括(1)反应步骤，该步骤使含有一种或几种活性HGFA特异性抗体的试剂与样品中活性HGFA反应以形成免疫反应产物，(2)分离步骤，分离免疫反应产物然后使其与标记的能够识别免疫反应产物所含的HGFA的抗体反应，和(3)测定步骤，测定与免疫反应产物结合的标记抗体量，或一种特异性测定活性HGFA的方法包括(1)反应步骤，使包含活性HGFA和一种或几种活性HGFA特异抗体作为初级抗体的试剂与样品中活性HGFA反应，以形成免疫反应产物，(2)分离步骤，分离免疫反应产物然后使其与能够识别免疫反应产物中HGFA的二级抗体反应，(3)分离步骤，分离免疫反应产物然后使其与能够识别免疫反应产物中标记的二级抗体反应，和(4)测定步骤，测定与免疫反应产物结合的标记抗体量。
进一步的，活性HGFA特异性多克隆抗体或HGFA特异性单克隆抗体通过常规手段固定在固体相例如微量滴定板孔以及磁性微珠上，作为初级抗体，然后用小牛血清，脱脂牛奶，明胶等等阻断固相表面的过量蛋白结合位点，然后加入带有活性HGFA的生物组分，以在固相表面形成免疫反应产物，再清洗固相表面。然后加入可识别HGFA的标记多克隆抗体或标记单克隆抗体，作为二级抗体进行反应。在这种情况下，当单克隆抗体被用作初级抗体，带有区别于初级抗体抗原决定部位的标记活性HGFA特异性单克隆抗体可以作为二级抗体。然后，清洗后，可以测定标记抗体的量，来测定生物组分中活性HGFA的量。
标记所使用的多克隆抗体或单克隆抗体可以用酶，如碱性磷酸酶辣根过氧化物酶，β-半乳糖苷酶，脲酶和葡萄糖氧化酶，或一种荧光物质，如荧光素衍生物和罗丹明衍生物。而且，标记可以是化学发光物质如吖啶酯或放射性同位素如125I，3H，14C和32P。就是说，本发明包括通过测定发光物质，荧光物质，化学发光物质，电化学发光物质或放射性的方法，定量测定生物组分中活性HGFA的量。本发明还包括一种方法，该方法包括生物素化二级抗体和检测与抗生物素蛋白形成复合物的碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，β-半乳糖苷酶，脲酶和葡萄糖氧化酶，荧光素衍生物和罗丹明衍生物，化学发光物质如吖啶酯或放射性同位素如125I，3H，14C和32P。(5)特异性测定或染色活性HGFA的试剂盒一种活性HGFA特异性测定试剂盒或一种活性HGFA特异性染色试剂盒是用于诊断特点为测定或检测活性HGFA的疾病的试剂盒。所用术语“特异性”是指当测定或检测活性HGFA时，无活性的HGFA不影响活性HGFA的测定值或检测值。本发明首次发现通过测定活性HGFA，可诊断或预测病理状况下的病人，如器官紊乱患者例如肾小球肾炎，肾炎，肝炎，胰腺炎，肺炎，肠炎和胃炎，癌症患者，带有血栓形成症状的病人，如心绞痛，心肌梗塞，大脑梗塞。所以，通过测定或检测活性HGFA可以诊断以上所提及的各种不同疾病。本发明中，只要当试剂盒是用于诊断疾病的一种活性HGFA特异性测定试剂盒，构成本试剂盒的材料以及用来制造该试剂盒的方法并无特别局限。
进一步说，试剂盒的例子包括那些使用电泳，HPLC，各种柱层析技术，各种阵列和芯片，表面胞质基因共振仪等等测定或检测活性HGFA来诊断疾病的试剂盒。更进一步说，还可涉及一种试剂盒，该试剂盒采用利用抗体的免疫方法用于测定或检测活性HGFA。所述抗体至少是一种或几种以上提及的可识别活性HGFA而基本上不识别无活性HGFA的抗体。
例如当本发明试剂盒是基于双抗体夹层技术，试剂盒可以是一种特异性测定活性HGFA的试剂盒，用于包括以下步骤的方法(1)反应步骤，使包括活性HGFA和一种或几种活性HGFA特异性抗体的试剂与样品中活性HGFA反应，形成免疫反应产物，(2)分离步骤，分离免疫反应产物，然后使其与标记的可识别免疫反应产物中HGFA的抗体反应，和(3)测定步骤，测定与免疫反应产物结合的标记抗体量，或一种特异性测定活性HGFA的试剂盒，用于包括以下步骤的方法(1)反应步骤，使包括一种或几种活性HGFA特异性抗体的试剂作为初级抗体与样品中活性HGFA反应，以形成免疫反应产物，(2)分离步骤，分离免疫反应产物，使其与可识别免疫反应产物中活性HGFA的二级抗体反应，以形成一种免疫反应产物，(3)分离步骤，分离免疫反应产物，然后使其与可识别免疫反应产物中二级抗体的标记抗体反应，和(4)测定步骤，测定结合到免疫反应产物上的标记抗体量。
该试剂盒包括至少一种活性HGFA特异性单克隆抗体或一种活性HGFA特异性多克隆抗体，还可进一步包括检测或测定活性HGFA方法所需的部分。所需的部分可包括活性HGFA或无活性HGFA作为标准蛋白，酶，底物等等。试剂盒中单克隆抗体或多克隆抗体可以是用酶或类似物标记的抗体，或者试剂盒可包括一个识别上述抗体的标记抗体。更进一步的，试剂盒可包括不同的缓冲液，稀释抗原的溶液，稀释反应混合物的溶液，底物溶液，停止反应的溶液等等。试剂盒还可包括检测和定量测定活性HGFA所需的联接标记和封闭物质的容器。一个合适的容器的例子包括玻璃或不同塑料材料如聚丙烯，聚苯乙烯，聚碳酸酯，尼龙和特氟隆。试剂盒优选包括描述一种检测或测定活性HGFA的方法建议，该方法与上述检测或测定活性HGFA物质及容器一同使用。
(6)与人类疾病相关的活性的HGFA抗体及其使用方法通过使用活性HGFA特异性抗体的本发明方法和试剂盒，病理状况下的患者中收集得到生物组分中活性HGFA可被检测出来甚至进行定量测定。所用检测活性HGFA的生物物质并无特别限定，任何组织，血清，血浆，尿液，浆液，脊髓液，抽提组织等等都可在适当的预处理后使用。通过检测或定量测定从病理状况下患者中收集得到生物组分中存在的活性HGFA，就可诊断，预测疾病或测知疾病的进程。疾病可包括器官紊乱如肾小球肾炎，肾炎，肝炎，胰腺炎，肺炎，肠炎和胃炎；癌症；血栓形成如心绞痛，心机梗塞，大脑梗塞等等。
肾炎的例子进一步包括肾小球系膜增生性肾病，IgA肾病，膜性增生性肾小球肾炎，膜性肾病，多发性肾小球硬化，急性肾衰竭，链球菌感染后急性肾小球肾炎，慢性和急性间质性肾炎，肾病并发症等等。心绞痛和心肌梗塞包括稳定性劳累心绞痛，非稳定性心绞痛，急性心肌梗塞，慢性心肌梗塞和稳定性心绞痛，还可以得知经过冠状介入，经食管心回波描记术，末端动脉旁路手术或主动脉囊泵患者以及急性主动脉剖开等等患者的病理状况或预后状况。
更进一步的，由于活性HGFA特异性抗体可以特异性抑制活性HGFA，可用做由活性HGFA引起疾病的药物治疗手段。例如，活性HGFA具有作用于无活性HGF从而将其激活的性质，所以，抑制活性HGFA活性的抗体抑制生物活体中活性HGF分泌量的增加，可被用做活性HGF导致疾病的治疗或预防药物(WO96/38557；Genentech Incorporated，”HGF的分子医学”，医学综述，1998)，例如，各种癌症如胃癌，肺癌，结肠癌，脾癌和肝癌及其转移瘤等，各种肾炎如肾小球肾炎等等。
抑制活性HGFA(单克隆抗体P1-4)的小鼠单克隆抗体的存在是由Miyazawa等人。(生物化学杂志.，2713615-3618(1996))披露的，本发明发明者通过研究阐明这个P4-1抗体与活性HGFA和无活性HGFA两者都起反应。由于无活性HGFA在生物体内大量存在，可认为需要极端大量的P4-1抗体才能抑制活性HGFA的活性。另一方面，由于本发明中活性类型特异性抗体被认为是抑制活性HGFA活性的抗体，可以认为作为药物，只需少量就可以对上述疾病起到良好的治疗效果。
针对这个目的，优选采用遗传工程技术人化的抗体。抗体的人化可通过本领域技术人员众所周知的方法，例如，日本(Tokuhyo)公开国际专利No.11-506327披露的方法等等。
(7)用于测定活性HGFA的血样采集方法和血样采集试管虽然检测或测定活性HGFA的生物组分没有特殊限制，通常是血液或其成分或其加工产物，但希望生物组分可以从容器方便收集，如血液，血清，血浆如柠檬酸钠血浆，肝素血浆和EDTA血浆，其成分或其加工产物或尿液。在收集和储存生物组分过程中，尤其是防止生物样品中无活性HGFA人为地转换成活性HGFA的操作是很必要的。例如，需要将收集到的血清或血浆，尿液等等应该立即放入低温环境如在冰水中冷却。
进一步地，为快速收集容器中的血液，血浆，柠檬酸钠血浆，肝素血浆和EDTA血浆，需要使用血液收集试管。尤其是，用于检测或测定活性HGFA的血液特别优选的是血浆状态，特别是柠檬酸钠血浆，进一步地，一种向用于检测或测定活性HGFA生物组分中加入不同蛋白酶抑制剂的方法也是优选的。例如阿戈托班，一种选择性的凝血酶抑制剂，如果将其加入收集生物样品以防止生物组分中无活性HGFA在生物组分收集或储存过程中人为地转化成活性HGFA，则取得了良好效果。特别优选使用预先加入阿戈托班的试管来收集血液，血清，血浆，柠檬酸钠血浆，肝素血浆和EDTA血浆。
(8)筛选活性HGFA蛋白酶抑制剂的方法通过使用识别活性HGFA的抗体，该抗体基本上不识别无活性HGFA，也不能识别活性HGFA和蛋白酶抑制剂的复合物，作用于活性HGFA的蛋白酶抑制剂可以被筛选出来。
一种带有上述性质的抗体可通过进一步从活性HGFA特异性抗体中选择一种不识别活性HGFA和蛋白酶抑制剂复合物的抗体来实现。
上述筛选方法特异性地包括，例如(1)混合步骤，将活性HGFA和一种蛋白酶抑制剂候选化合物混合，使其反应，(2)向活性HGFA和蛋白酶抑制剂候选化合物的复合物中加入识别无活性HGFA但基本上不识别活性HGFA和蛋白酶抑制剂复合物的单克隆抗体的步骤，和(3)分离免疫反应产物，然后测定由活性HGFA和蛋白酶抑制剂候选化合物复合物和抗体构成的免疫反应产物的减少量。
关于检测免疫反应产物减少量的方法，可以用酶免疫法，放射性免疫法，荧光免疫法，化学发光免疫法，电化学发光免疫法，免疫印记法，免疫层析法，胶乳黏结法，应用免疫印记的微阵列法，和应用荧光去极化法的方法，荧光联系方差法或表面胞质基因共振仪。例如，可以通过在表面胞质基因共振仪中流动生物样品，随时间追踪反应信号的变化来筛选蛋白酶抑制剂，该共振仪带有传感器芯片，芯片上结合有能够识别活性HGFA并且基本上不识别无活性HGFA以及不识别活性HGFA与蛋白酶抑制剂混合物的抗体。
本方法所用抗体可以本身使用，也可作为Fab形式的抗体使用，该形式是通过常规木瓜蛋白酶处理而得到的，或者以F(ab′)2或F(ab′)形式的抗体使用，该形式是通过胃蛋白酶处理得到的。进一步，带有本方法所用抗体性质的抗体片段也可使用。
本发明最佳实施方式本发明可参考以下实施例进一步解释。但是本发明的范围并不局限于这些实施例1制备无活性HGFA和活性HGFA无活性HGFA是通过使用编码HGFA前体的HGFA cDNA来制备，该HGFA前体如日本待审专利公开号No.6-153946中所述，所用方法见日本待审专利公开号No.6-153966中重组无活性HGFA的制备。就是说，编码全长度无活性HGFA前体的HGFA cDNA，655个氨基酸，按常规手段插入pcDNA3.1(Invitrogen)中CMV启动子的下游，该pcDNA3.1是一种动物细胞表达载体。
得到的表达载体根据所附的说明使用Transfectam(BioSepra)导入CHO细胞，该细胞是起源于中国仓鼠卵巢细胞的一种动物细胞系。然后，表达HGFA cDNA的CHO细胞通过存在于被导入的表达载体上新霉素抗性基因特性被选择出来。那即是说，选出在5％CO2，37℃条件下，在含有400μg/ml新霉素和5％小牛血清的ERDF培养基(Kyokuto Seiyaku)上能够生长的细胞。进一步，选出的表达HGFA cDNA的CHO细胞在含有100μM甲磺酸萘莫司他，400μg/ml新霉素和5％小牛血清的ERDF培养基上培养约10天，得到约5L培养上清液。
在过滤得到的培养上清液，加入含有10mM EDTA，10mM苯甲脒，100μM甲磺酸萘莫司他的蛋白酶抑制剂，大豆胰蛋白酶抑制剂和1000KIU/ml抑肽酶并进一步加入0.5M醋酸盐缓冲液(pH4.5)来调节培养上清液pH值到约5.8。将该培养上清液加到含有100mM NdCl磷酸钠缓冲液(pH7.5)的50mM醋酸盐缓冲液(pH5.5)平衡过的硫酸化Cellofine柱(Seikagaku Corporation)，并用含100mM NaCl的50mM乙酸盐缓冲液(pH5.5)洗脱，然后，用50mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)洗脱以得到无活性HGFA成分，该磷酸钠缓冲液含有500mMNaCl，0.05％CHAPS(3-[(3-胆汁酰氨基丙基)二甲氨基]丙烷磺酸)。
得到的成分在含有150mM NaCl的50mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)中透析，上样A6单克隆抗体亲和柱(Shimomura等人.，生物化学杂志，26822927-22932，1993)，再用50mM甘氨酸-HCl缓冲液(pH3.0)洗脱。得到的无活性HGFA成分缓冲液用含有100mM NaCl和0.05％CHAPS的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.3)代替。成分的一部分加入蛋白酶抑制剂阿戈托班，使其终浓度为40μM并作为无活性HGFA在-40℃保存。另一方面，未加入阿戈托班的无活性HGFA以1/100HGFA重量比率加入血浆舒血管素和凝血酶，在37℃下充分反应以得到活性36kDa HGFA。
进一步的，在未加入阿戈托班的无活性HGFA中按1/100的重量比率加入凝血酶，以及10μg/ml葡聚糖硫酸酯，然后37℃反应20分钟，得到活性98kDaHGFA。通过使用A6单克隆抗体亲和柱层析再次纯化每种活性HGFA成分，Asahipak GS520HQ柱(Showa Denko)进行HPLC，该柱已用含有100mM NaCl和0.05％CHAPS的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.3)平衡，然后以活性36kDa HGFA和98kDa HGFA形式保存于-40℃。
实施例2制备ELISA板筛选活性HGFA特异性单克隆抗体将实施例1中制得活性36kDa HGFA或活性98kDa HGFA用生理盐水配制的磷酸氢盐缓冲液(PBS(-))稀释至终浓度为1μg/ml，作为抗原来筛选杂交瘤，96-孔板每孔中加入100μl该溶液，4℃保存24小时，以使每种抗原都被吸附到96-孔板上。去除抗原吸附板上的溶液，然后每孔中加入250μl含5％小牛血清白蛋白的PBS(-)(以下简写为BSA)，再4℃过夜(约12小时)或37℃保存2小时或更长以封闭板，然后，将该板作为筛选活性HGFA的ELISA板保存在4℃。
分别的，实施例1中制备的无活性HGFA用PBS(-)稀释到终浓度为1μg/ml作为抗原筛选杂交瘤，然后，向96孔板中的每一孔加入100μl该溶液，4℃保存24小时使抗原可吸附在96孔板上，去除抗原吸附板上的溶液，再在每孔中加入250μl含有5％小牛血清白蛋白的PBS(-)(以下简写为“BSA“)，4℃过夜(约12小时)或37℃保存2小时或更长以封闭板，然后，该板作为筛选无活性HGFA的ELISA板保存在4℃。这些ELISA板中的封闭液在使用前迅速去除。
实施例3制备活性HGFA特异性单克隆抗体实施例1中制得的含有100μ36kDa HGFA或100μg98kDa HGFA的溶液，对Bal b/c小鼠以皮下或腹腔方式给药，并且与等体积的完全弗氏估剂一起给药，每次给药间隔两周，共给药六次，当确定小鼠血清内已产生抗体后，尾部血管给药含有100μgHGFA的溶液，三天后，取出脾脏，利用聚乙二醇1500将脾脏细胞与骨髓瘤细胞P3U1进行融合，所用方法参见“单克隆抗体试验手册”(Kodansha Scientific，1987)，再将细胞加入到96孔板的孔中，加入HAT培养基培养14天。
接下来，选择出在培养基中产生相应活性HGFA特异性的单克隆抗体杂交瘤，就是说，将选择出的杂交瘤培养上清液加入到ELISA板，用于筛选实施例2中制得的36kDa HGFA或活性98kDa HGFA，分析培养上清液中单克隆抗体的反应性。将选出的杂交瘤培养上清液以100μl/孔的量加入到ELISA板中，以筛选每种活性类型，并在4℃反应2小时或更长。
然后，用含有0.05％吐温20的PBS(-)溶液(以下简写为“PBST溶液”)充分洗涤该板，再向每孔中加入100μl含有1μg/ml HRP(辣根过氧化物酶)结合的羊抗鼠IgG/Fc多克隆抗体以及1％BSA的PBS(-)，室温下反应1小时，用PBST溶液充分清洗该板，加入含有0.4mg/ml邻苯二胺(OPD，Sigma，P-9029)和0.015-0.03％过氧化氢溶液的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH5.0)，室温下反应显色，然后，向反应混合物中加入1N H2SO4溶液以停止反应，在波长490nm，参考波长650nm下测定。
然后，用产生具有与36kDa HGFA或活性98kDa HGFA反应性的单克隆抗体杂交瘤培养上清液以相同方式，在ELISA板上筛选实施例2中制得的无活性HGFA，以选出与无活性HGFA无反应性的杂交瘤。通过这种筛选，得到产生识别活性36kDa HGFA而基本上不识别无活性HGFA单克隆抗体以及识别98kDa HGFA而不识别无活性HGFA(AHGA-A，AHGA-B，AHGA-C)单克隆抗体的杂交瘤。得到的每种杂交瘤经过有限稀释法进行4次克隆收集上清液，用蛋白A(Amersham Pharmacia Biotec)亲合层析纯化单克隆抗体。
AHGA-A杂交瘤克隆于2001年10月19日保藏在国际专利生物体保藏机构国家高级工业科学和技术研究院(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本)，保藏号为FERM BP-7779。
实施例4活性HGFA特异性单克隆抗体的反应特异性分析在实施例3中制备纯化的活性HGFA特异性单克隆抗体中，分析杂交瘤克隆AHGA-A，AHGA-B和AHGA-C来源的单克隆抗体反应活性，为达到该目的，向实施例2中制得用于筛选活性36kDa HGFA和活性98kDa HGFA的ELISA板或用于筛选无活性HGFA的ELISA板上每孔中加入100μl含有1μgl/ml来源于每种杂交瘤克隆AHGA-A，AHGA-B，AHGA-C的单克隆抗体和1％BSA的PBS(-)，并在4℃反应2小时或更长。
然后，用含有0.05％吐温20的PBS(-)溶液(以下简写为“PBST溶液”)充分洗涤该板，再向每孔中加入100μl含有1μg/ml HRP结合的羊抗鼠IgG多克隆抗体(DAKO)以及1％BSA的PBS(-)，室温下反应1小时，用PBST溶液充分清洗该板，加入含有0.4mg/ml邻苯二胺(OPD，Sigma，P-9029)和0.015-0.03％过氧化氢溶液的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH5.0)，室温下反应，显色。
然后，向反应混合物中加入1N H2SO4溶液以停止反应，在测定波长490nm，参考波长650nm下进行测定，测定结果如图1所示。杂交瘤克隆AHGA-A和AHGA-B来源的单克隆抗体与活性36kDa HGFA进行反应，但不与无活性HGFA反应。进一步，来源于杂交瘤克隆AHGA-C的抗体与活性98kDa HGFA反应，但不与无活性HGFA进行反应(图1)。分别的，分析针对HGFA(7E10，P1-4，A-1，A-6，A-23，A-51，A-75)存在的单克隆抗体中与活性36kDa HGFA和无活性HGFA的反应性，结果显示，它们与活性HGFA和无活性HGFA的反应性相同，并不具备本发明中单克隆抗体与活性HGFA的特异性反应。
实施例5活性HGFA特异性单克隆抗体离解常数的测定。
实施例3中制备纯化的活性HGFA特异性单克隆抗体中，测定来源于杂交瘤克隆AHGA-A单克隆抗体的离解常数。向固定活性HGFA及BSA封闭制成的活性HGFA固定板上加入不同浓度的抗体，进行充分反应直至达到平衡(2小时或更长)。
接下来，用含有0.05％吐温20的PBS(-)溶液(以下简写为“PBST溶液”)充分洗涤该板，再向每孔中加入100μl含有1μgml HRP(辣根过氧化物酶)结合的羊抗鼠IgG/Fc多克隆抗体(ICN)以及1％BSA的PBS(-)，室温下反应1小时，PBST溶液充分清洗该板，加入含有0.4mg/ml邻苯二胺(OPD，Sigma，P-9029)和0.015-0.03％过氧化氢溶液的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH5.0)室温下反应显色。
然后，向反应混合物中加入1N H2SO4溶液以停止反应，在测定波长490nm，参考波长650nm下进行测定，Schatchard plot测定离解常数，测定结果为4.05×10-10M。该结果提示本发明的抗体具有高亲合性。
实施例6制备特异性识别活性HGFA并且不识别活性HGFA和蛋白酶抑制剂混合物的单克隆抗体。
将实施例3中选出的产生特异性识别活性HGFA并且不识别无活性HGFA单克隆抗体的杂交瘤进一步按以下步骤进行筛选。
去除实施例2中制备的筛选活性36kDa HGFA或活性98kDa HGFA所用板上的封闭液，每孔中加入20μl含有200μM甲磺酸萘莫司他蛋白酶抑制剂的PBS(-)，室温下反应1小时，以形成活性HGFA和甲磺酸萘莫司他混合物，然后，每孔中加入100μl选出的杂交瘤培养上清液，4℃反应2小时。
接下来，用含有0.05％吐温20的PBS(-)溶液(以下简写为“PBST溶液”)充分洗涤该板，再向每孔中加入100μl含有1μg/ml HRP结合的羊抗鼠IgG多克隆抗体(DAKO)以及1％BSA的PBS(-)，室温下反应1小时，再用PBST溶液充分清洗该板，加入含有0.4mg/ml邻苯二胺(OPD，Sigma，P-9029)和0.015-0.03％过氧化氢溶液的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH5.0)室温下反应显色。
然后，向反应混合物中加入1N H2SO4溶液以停止反应，在测定波长490nm，参考波长650nm下进行测定，通过这种筛选，不识别活性36kDa HGFA和甲磺酸萘莫司他复合物的单克隆抗体被选出。产生选择的单克隆抗体的杂交瘤克隆命名为AHGA-D。得到的每种杂交瘤经过有限稀释法进行4次克隆操作，然后收集上清液，进行利用蛋白A的亲合层析来纯化单克隆抗体。
实施例7分析特异性识别活性HGFA并且不识别活性HGFA与蛋白酶抑制剂复合物的单克隆抗体的特异性反应分析来源于实施例6中选出的杂交瘤克隆AHGA-D单克隆抗体的反应性。向实施例2中制备的筛选活性36kDa HGFA ELISA板每孔中加入20μl含有甲磺酸萘莫司他的PBS(-)，浓度分别为0，0.820，7.40，22.20或2000μM，室温下反应1小时以形成活性HGFA和甲磺酸萘莫司他的复合物，然后，每孔中以不同的浓度(0，0.820，7.40，22.20和2000μM)加入100μl含有约1μg/ml来源于杂交瘤克隆AHGA-D的单克隆抗体，1％BSA和甲磺酸萘莫司他的PBS(-)，在4℃反应2小时或更长。
然后，用含有0.05％吐温20的PBS(-)溶液(以下简写为“PBST溶液”)充分洗涤该板，再向每孔中加入100μl含有1μg/ml HRP结合的羊抗鼠IgG多克隆抗体(DAKO)以及1％BSA的PBS(-)，室温下进一步反应1小时，再用PBST溶液充分清洗该板，加入含有0.4mg/ml邻苯二胺(OPD，Sigma，P-9029)和0.015-0.03％过氧化氢溶液的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH5.0)室温下反应显色。
然后，向反应混合物中加入1N H2SO4溶液以停止反应，在测定波长490nm，参考波长650nm下进行测定，测定结果如图2所示。来源于杂交瘤克隆AHGA-D单克隆抗体与蛋白酶抑制剂甲磺酸萘莫司他结合HGFA的反应性明显的降低。
实施例8针对于HGFA多克隆抗体的制备及其标记型式将各100μg的实施例1中制备的每种活性36kDa HGFA，活性98kDaHGFA和无活性HGFA的复合物对兔进行皮下给药，每次给药间隔2周，共给药7次，得到针对于HGFA的多克隆抗体。当确定血清中已产生抗体后，10μg每种抗原进一步静脉给药，5天后得到抗血清。进一步，硫酸铵沉淀后，使用蛋白酶A柱纯化得到抗-HGFA的多克隆抗体。然后，得到的HGFA多克隆抗体用生物素标记，来制备生物素-标记的抗-HGFA多克隆抗体。
实施例9构建活性HGFA特异性测定系统实施例4中使用杂交瘤克隆AHGA-A来源的多克隆抗体作为初级抗体。该多克隆抗体以30μg/ml的浓度溶解于0.05M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)中，再以100μl/孔的量加入到96孔板中，4℃反应1天(约12小时或更长)。去除该初级抗体-覆盖板上的初级抗体溶液，再以250-300μl/孔量加入含有1％BSA的PBS(-)液，4℃过夜(约12小时)或37℃反应2小时或更长。去除该板上的封闭液，溶解于100μl含有0.15M NaCl，0.1％CHAPS，0.05％吐温20，0.05％Az(叠氮化钠)，0.1％BSA，20mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)中的活性36kDaHGFA或无活性98kDaHGFA以不同的浓度(0，0.69，2.1，6.2，18.5，55.6，167和500ng/ml)加入到板孔中，4℃反应2小时或更长。
然后，用含有500mM NaCl，0.05％ 吐温20和20mM Tris-HCl(pH7.5)的洗液充分洗涤该板，再向每孔中加入100μl含有1μg/ml实施例8中制得生物素-标记抗-HGFA多克隆抗体的PBS(-)，培养箱中37℃反应2小时。
然后，用上述洗液充分洗涤该板，向每孔中加入100μl含有1％BSA的PBS(-)，该PBS(-)中含有按1∶2000的比率稀释的HRP-结合链霉抗生物素(Amersham Pharmacia Biotech，Code RPN1231)，再在室温下反应1小时。洗液充分洗涤该板，以100μl/孔量加入含有0.4mg/ml邻苯二胺(OPD，Sigma，P-9029)和0.015-0.03％过氧化氢溶液的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH5.0)，室温下反应显色。
然后，向反应混合物中加入100μl/孔1N H2SO4溶液以停止反应，在测定波长490nm，参考波长650nm下进行测定，测定结果如图3所示。图3A显示HGFA的浓度范围为0-500ng/ml。图3B中，详述了图3A中0-55.6ng/ml浓度范围。
实施例10健康受验者血中活性HGFA数量的测定利用实施例9中制备的活性HGFA特异性测定系统测定144名健康受验者的血浆。收集每个健康受验者的血浆，冷冻，保存，在本实验前迅速解冻。首先，向实施例9中制得覆盖了初级抗体并被阻断的96孔板的每孔中预先加入50μl含有0.15M NaCl，0.1％CHAPS，0.05％吐温20，0.05％Az，0.1％BSA的20mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)，再加入50μl健康受验者血清或标准36kDa活性HGFA(0，0.69，2.1，6.2，18.5，55.6，167或500ng/ml)，4℃反应2小时或更长。然后，用含有500mM NaCl，0.05％吐温20和20mMTris-HCl(pH7.5)的洗液洗涤该板，再向每孔中加入100μl含有1μg/ml实施例8中制得生物素-标记抗-HGFA多克隆抗体和1％BSA的PBS(-)，培养箱中37℃反应2小时。接下来，用上述洗液充分洗涤该板，向每孔中加入100μl含有1％BSA的PBS(-)，该PBS(-)中含有按1∶2000的比率稀释的HRP-结合链霉抗生物素(Amersham Pharmacia Biotech，Code RPN1231)，再在室温下反应1小时。
用洗液充分洗涤该板，加入100μl/孔含有0.4mg/ml邻苯二胺(OPD，Sigma，P-9029)和0.015-0.03％过氧化氢溶液的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH5.0)，室温下反应显色。然后，向反应混合物中加入100μl/孔1N H2SO4溶液以停止反应，在测定波长490nm，参考波长650nm下进行测定。根据标准36kDa活性HGFA的浓度与颜色生成量之间的关系来绘制校正曲线，计算健康受验者血清中的浓度。结果如图4所示。正常受验者血清中浓度范围为0到58.5ng/ml，平均为19ng/ml。
实施例11不同人类疾病患者血中活性HGFA的测定根据实施例10中所用方法利用实施例9中制得活性HGFA特异性测定系统对不同人类疾病患者的血浆进行测定。每种疾病患者5人，收集每种血清，冷冻，保存，在进行本实验前迅速解冻，实验结果见表1。可以看出，与健康受验者(样品数9，平均值19ng/lm)相比，肾小球肾炎，胰腺炎，癌症，心肌梗塞，心绞痛，和大脑梗塞患者血中活性HGFA的浓度高。
表1
实施例12收集测定活性HGFA血样以及检测稳定性的方法。
收集正常受验者的血清，柠檬酸血浆，肝素血浆或EDTA血浆，或制备含有终浓度为40μM阿戈托班的血清，柠檬酸血浆，肝素血浆，或EDTA血浆。每种均保存于4℃或37℃12小时。然后，实施例10中所述的方法测定活性HGFA的量。结果如图5所示。可看出，由于血浆或血清的保存带来的血浆中活性HGFA数量的增加少于血清中活性HGFA的增加，而且阿戈托班的加入抑制了这种增加。
序列表<110>化学公司<120>抗活性肝细胞生长因子激活剂的特异性抗体及其使用方法<130>OP1261<140><141>2000-12-05<150>JP2000-370435<151>2000-12-05<160>3<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>13<212>PRT<213>人<400>1Gly Arg Arg His Lys Lys Arg Thr Phe Leu Arg Pro Arg1 5 10<210>2<211>13<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Ile Ile Gly Gly Ser Ser Ser Leu Pro Gly Ser His Pro15 10<210>3<211>26<212>PRT<213>人<400>3Gly Arg Arg His Lys Lys Arg Thr Phe Leu Arg Pro Arg Ile Ile Gly1 5 10 15Gly Ser Ser Ser Leu Pro Gly Ser His Pro20 2权利要求
1.一种抗体，该抗体可识别活性肝细胞生长因子激活剂(HGFA)并且基本上不识别无活性HGFA。
2.根据权利要求1所述抗体，其中活性HGFA的离解常数为1×10-8M或更低。
3.根据权利要求1或2所述抗体，它是单克隆抗体。
4.根据权利要求3中所述的抗体，该抗体可识别SDS-PAGE方法测定分子量为34,000-98,000的活性HGFA并且基本上不识别无活性HGFA。
5.根据权利要求4中所述的抗体，该抗体可识别SDS-PAGE方法测定分子量为34,000-98,000的活性HGFA。
6.根据权利要求4中所述的单克隆抗体，该抗体由保藏号为FERM BP-7779的杂交瘤产生。
7.一种单克隆抗体，该抗体可识别由无活性HGFA有限蛋白水解作用激活的活性HGFA并且基本上不识别无活性HGFA，该无活性HGFA是活性HGFA的前体，该水解作用是在无活性HGFA翻译起始氨基酸处计算，407位的精氨酸和408位的异亮氨酸之间的水解作用。
8.一种单克隆抗体，该抗体可识别活性HGFA，但基本上不识别无活性HGFA，也不识别活性HGFA与蛋白酶抑制剂复合物。
9.一种杂交瘤细胞系，该细胞系可产生如权利要求3到8中所述的任一单克隆抗体。
10.一种测定活性HGFA的方法，包括使用一种或几种权利要求1到8中所述任一抗体进行免疫方法特异性测定活性HGFA的步骤。
11.根据权利要求10所述方法，其中用于测定活性HGFA的样品是从涉嫌患病实验动物或受验者收集的生物组份。
12.根据权利要求11所述方法，其中疾病是器官炎症，肾小球肾炎，癌症，心肌梗塞，心绞痛，大脑梗塞或血栓形成。
13.一种疾病的测定方法，包括检测或测定收集自涉嫌患病的受验者生物组份中活性HGFA的步骤。
14.根据权利要求13所述方法，其中疾病是选自器官炎症，肾小球肾炎，癌症，心肌梗塞，心绞痛，大脑梗塞和血栓形成。
15.根据权利要求13或14中所述方法，其中，生物组份是血液或其成分或其加工产物。
16.根据权利要求15所述方法，其中生物组份是血浆。
17.根据权利要求16所述方法，其中血浆是柠檬酸血浆。
18.根据权利要求13到17所述方法任一种，其中生物组份中加入阿戈托班。
19.一种检测或测定活性HGFA的试剂盒，该试剂盒包括一种或几种权利要求1到8所述任一抗体。
20.根据权利要求19所述试剂盒，该试剂盒用于诊断一种选自器官炎症，肾小球肾炎，癌症，心肌梗塞，心绞痛，大脑梗塞和血栓形成的疾病。
21.根据权利要求19或20所述试剂盒，该试剂盒用于测定收集自涉嫌患病的受验者生物组份中活性HGFA。
22.根据权利要求19到21任一所述试剂盒，其中活性HGFA通过免疫染色测定。
23.一种用于收集血清，血浆或全血的血液收集试管，其中加入阿戈托班。
24.根据权利要求23中所述血液收集试管，用于收集测定活性HGFA所用血清，血浆或全血。
全文摘要
将利用编码无活生HGFA前体的HGFA cDNA得到的重组无活性HGFA,以及蛋白酶处理无活性HGFA得到活性HGFA,用于筛选产生单克隆抗体的杂交瘤,该单克隆抗体与活性HGFA具有反应性,与无活性HGFA不具有反应性,从获得的杂交瘤培养上清液制备靶单克隆抗体。
文档编号C07K16/40GK1384120SQ0114575
公开日2002年12月11日 申请日期2001年12月5日 优先权日2000年12月5日
发明者仲大地, 长池一博 申请人:三菱化学株式会社