一种pla2r抗体定量检测试纸条及制作、检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种PLA2R抗体定量检测试纸条及制作、检 测方法。
【背景技术】
[0002] 膜性肾病按发病原因可分为特发性和继发性膜性肾病，其诊断上要依靠临床表现 及肾脏穿刺术。肾脏穿刺术是一种侵入式的诊断方法，对病人有一定的伤害。国外研宄发 现约75%的特发性膜性肾病患者可以通过血清学检测检出抗PLA2R抗体，国内也有文献显 示在国人中检测阳性率更高，达到82%，而继发性膜性肾病及其他类型肾小球疾病患者的 检出率很低，健康人群均为阴性。血清学PLA2R抗体的定量检测可以为特发性膜性肾病的 初筛和病情监测提供辅助作用。因此，开发非创伤、低风险、安全、廉价、精确和快速的PLA2R 定量测定试剂盒有极其重要的意义。
[0003] 免疫层析技术以多种膜材组合为固定相，作为液相的样品通过毛细流原理从加样 一端泳流至标记物垫上，与固定在标记物垫上的抗原或抗体标记物（如胶体金、荧光稀土 元素等）反应形成免疫复合物，该带有标记的免疫复合物继续通过涌流到达反应膜上固定 的检测线，与检测线上的抗原或抗体发生免疫反应从而被截留富集显色，达到快速检测的 目的。免疫层析技术最常见的标记物是胶体金，应用非常广泛，也非常成功。由于胶体金标 记是通过静电吸附的原理，在流体中不稳定，标记的分子容易脱落，且只有胶体金颗粒富集 到一定肉眼可见的量的时候才能判读，同时，胶体金免疫层析技术只可对被检物定性分析。 目前，通过胶体金免疫层析技术来快速检测磷脂酶A2受体（PLA2R)抗体的只有在公布号为 CN102159951A中国专利申请中提到，但如上所述，不能定量且胶体金稳定性差。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种PLA2R抗体定量检测试纸条及制作、检测方法，能够 准确、快速、灵敏、定量的检测人血中的PLA2R抗体。
[0005] 本发明解决其技术问题，所采用的技术方案是提供一种PLA2R抗体定量检测试纸 条及制作、检测方法。具体的，包括一个检测试剂盒，所述检测试剂盒包括PLA2R抗体检测 卡及样品缓冲液，PLA2R抗体检测卡内装有PLA2R抗体检测试纸条。检测卡可由荧光分析 仪测出PLA2R抗体浓度值。所述试纸条包括在粘性底板上依次搭接的样本垫、结合物垫、硝 酸纤维素膜和吸水纸；所述的结合物垫上喷涂有抗人IgG抗体偶联的量子点，所述的硝酸 纤维素膜上包被有PLA2R抗原作为检测线，硝酸纤维素膜上还包被有抗抗体作为质控线， 所述抗抗体为抗量子点偶联抗体的抗体。检测卡是以间接法模式检测PLA2R抗体。
[0006] 所述PLA2R，可以是天然纯化的PLA2R，也可以是基因重组获得的PLA2R或PLA2R 片段；PLA2R抗体是由PLA2R免疫动物所得到的PLA2R抗体，可以是诸如兔源、羊源或其他 哺乳动物来源的多克隆抗体，也可以是鼠源单克隆抗体。
[0007] 量子点偶联的抗人IgG抗体，可以是抗人不同IgG亚型的抗体，如鼠抗人IgG4抗 体。该抗人IgG抗体可以是诸如兔源、羊源或其他哺乳动物来源的多克隆抗体，也可以是鼠 源单克隆抗体。质控线上的抗抗体是抗量子点偶联抗体的抗体。例如若量子点偶联的抗体 是鼠抗人IgG4抗体，那么该抗抗体必须是抗鼠的抗体；又如若量子点偶联的抗体是羊抗人 IgG抗体，那么该抗抗体必须是抗羊的抗体；
[0008] 所述量子点为包括IB、IIB、IIIA、IVA、VA、VIA族中的两种以上元素组成的单 个晶核结构，如CdS、CdSe、CdTe、ZnSe、InP、InAs、HgCdTe等，或是核壳结构，如CdSe/ZnS、 ZnCdS/ZnS、MnSe/ZnSe/ZnS、CuInZnS/ZnS等。
[0009] 量子点由以上元素构成外，还具有表面修饰基团，如-C00H、-NH2、-SH、-CH0等基 团，可以通过一些化学试剂如戊二醛、碳二亚胺等偶联生物大分子，如蛋白质、核酸及其他 有机分子。
[0010] 所述量子点的粒径范围为2~lOOOnm，激发光波长范围为200~600nm，发射光波 长为400~800nm。
[0011] 一种PLA2R抗体检测试纸条的制作方法，包括以下步骤：
[0012] a.用量子点偶联抗人IgG抗体得到量子点-抗人IgG抗体复合物，并将其喷涂在 结合物垫上；
[0013]b.分别将PLA2R包被到硝酸纤维素膜上作为检测线，将抗抗体包被到硝酸纤维素 膜上作为质控线，检测线和质控线间的距离为3~10mm。
[0014]c.在粘性底板上依次搭接样本垫、喷涂有量子点-抗人IgG抗体复合物的结合物 垫、设置有检测线和质控线的硝酸纤维素膜、吸水纸，并裁切成所需宽度即为PLA2R抗体检 测试纸条。
[0015] 检测线和质控线的制备方法为：分别用0. 005-0. 2M，pH6. 0-pH9. 0的包被缓冲液 稀释PLA2R和抗抗体至0.l-5mg/ml，所述包被缓冲液为磷酸盐、硼砂、碳酸盐、可含糖、醇类 中的一种；用划膜仪或喷膜仪分别将PLA2R和抗抗体包被到硝酸纤维素膜上，包被浓度为 0. 4-2y1/cm;喷涂完毕后，放置在环境湿度为30%以下，温度在16°C_45°C的环境中，烘干 lh以上，封存。
[0016] 抗人IgG抗体偶联量子点的方法：将抗人IgG抗体加入到量子点溶液中或是将量 子点加入到抗人IgG抗体溶液中偶联得到量子点-抗人IgG抗体复合物；所述量子点可在 适当的溶液中活化，活化试剂可以为EDC、NHS或戊二醛或其他交联剂等，将量子点与活化 剂结合即的量子点溶液。
[0017] 结合物垫上喷涂量子点-抗人IgG抗体复合物的条件是：将量子点-抗人IgG抗 体复合物稀释稀释5-200倍，用喷膜仪按2-100y1/cm的量喷涂到结合物垫上，在环境湿度 小于30%，温度在35-37°C的环境下烘烤l_5h，干燥后封存。
[0018] 所述PLA2R抗体检测卡，包括上壳体和下壳体，所述上壳体与下壳体间放置 有PLA2R抗体检测试纸条，所述上壳体上设置有加样孔、观察窗和信息区，所述加样孔与 PLA2R抗体检测试纸条上的样本垫对应，观察窗与硝酸纤维素膜上的检测线和质控线对应； 所述信息区上喷涂有用于识别病人ID的二维码、条形码或磁卡；所述PLA2R抗体检测卡同 样品缓冲液一起装在试剂盒内，试剂盒上设置有标定芯片。
[0019] 本发明还提供了一种PLA2R抗体的检测方法：包括以下步骤：
[0020] 1)先用试剂盒上的标定芯片标定荧光分析仪，保存标定数据；
[0021] 2)取10微升血清或血浆样品，或15微升全血样品加入样品缓冲液，混合后10秒 钟，加入检测卡加样孔；
[0022] 3)将检测卡插入荧光分析仪的检测孔，放置3-4分钟，荧光分析仪即可读出PLA2R 的浓度值。
[0023] 有益效果：将量子点和免疫层析技术相结合，可使试纸条既具有稳定性高的优点， 同时，又可对PLA2R抗体进行定量检测，且检测又灵敏度高；该检测方法还具有检测时间 短，效率高的特点。相对于传统的胶体金和有机荧光染料，量子点具有稳定、可定量的优点， 因此，可以很好的检测出PLA2R抗体的存量。本发明利用量子点免疫层析法，非创伤、低风 险、安全、廉价、精确和快速的定量检测血清、血浆和全血中的PLA2R抗体含量，可以为特发 性膜性肾病的初筛和病情监测提供辅助作用。
【具体实施方式】
[0024] -种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括PLA2R抗体检测卡及样品缓冲液，PLA2R抗 体检测卡内装有PLA2R抗体检测试纸条。所述试纸条包括在粘性底板上依次搭接的样本 垫、结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸。所述的结合物垫上喷涂有抗人IGG抗体偶联的量子 点，所述的硝酸纤维素膜上包被有PLA2R抗原作为检测线，硝酸纤维素膜上还包被有抗抗 体作为质控线，所述抗抗体为抗量子点偶联抗体的抗体。检测卡是以间接法模式检测PLA2R 抗体。。
[0025] 所述PLA2R，可以是天然纯化的PLA2R，也可以是基因重组获得的PLA2R或PLA2R 片段；PLA2R抗体是由PLA2R免疫动物所得到的PLA2R抗体，可以是诸如兔源、羊源或其他 哺乳动物来源的多克隆抗体，也可以是鼠源单克隆抗体。
[0026] 量子点偶联的抗人IgG抗体，可以是抗人不同IgG亚型的抗体，如鼠抗人IgG4抗 体。该抗人IgG抗体可以是诸如兔源、羊源或其他哺乳动物来源的多克隆抗体，也可以是鼠 源单克隆抗体。质控线上的抗抗体是抗量子点偶联抗体的抗体。例如若量子点偶联的抗体 是鼠抗人IgG4抗体，那么该抗抗体必须是抗鼠的抗体；又如若量子点偶联的抗体是羊抗人 IgG抗体，那么该抗抗体必须是抗羊的抗体。
[0027] 所述量子点为包括IB、IIB、IIIA、IVA、VA、VIA族中的两种以上元素组成的单 个晶核结构，如CdS、CdSe、CdTe、ZnSe、InP、InAs、HgCdTe等，或是核壳结构，如CdSe/ZnS、 ZnCdS/ZnS、MnSe/ZnSe/ZnS、CuInZnS/ZnS等。
[0028] 量子点由以上元素构成外，还具有表面修饰基团，如-C00H、_NH2、-SH、-CH0等基 团，可以通过一些化学试剂如戊二醛、碳二亚胺等偶联生物大分子，如蛋白质、核酸及其他 有机分子。
[0029] 所述量子点的粒径范围为2~lOOOnm，激发光波长范围为200~600nm，发射光波 长为400~800nm。
[0030] 所述PLA2R抗体检测卡，包括上壳体和下壳体，所述上壳体与下壳体间放置 有PLA2R抗体检测试纸条，所述上壳体上设置有加样孔、观察窗和信息区，所述