一种基于ddPCR定量检测ctDNA的方法与流程

本发明涉及血液循环dna测定技术领域，具体涉及一种基于ddpcr定量检测ctdna的方法。

背景技术：

血液循环dna(circulatingdna，ctdna)，又称游离dna或无细胞dna(cell-freedna)，主要来源于细胞的凋亡和死亡。是肿瘤细胞体细胞dna经脱落或者当细胞凋亡后释放进入循环系统，可以被定性、定量和追踪。对于这类ctdna的成功捕获，携带信息的准确解读为癌症早期基因信息的获取，癌症的早期诊断、预后检测、耐药评估提供了一条准确的途径。

但是，这类技术目前仍未得到有效解决和广泛应用。原因之一在于：ctdna在外周血中的含量非常低，尤其是与正常dna(normaldna，ndna)相比，其相对含量极低，每10ml全血平均只能提取到50ng左右的游离dna，目前的检测技术还难以达到直接检测外周血中ctdna的水平。而且，目前的检测方法均需要先从血清或血浆中提取dna，然后扩增基因组中某个基因的方式，计算ctdna的浓度或基因组拷贝数。由于个体间、不同病理状态间ctdna含量及片段完整程度存在较大差异，即便不考虑操作者的因素，所用提取方法和试剂的不同就会造成提取效率存在巨大差别。在此基础上的ctdna测定结果误差会更大。但直接用血浆或血清扩增，血清或血浆中含有的蛋白质等会严重干扰pcr，使标本间的扩增效率不一致。

1999年vogelstein首次提出了“数字pcr”的概念，“数字pcr”以其极高的敏感性、绝对计算能力和无需定标等特性疾病诊断工作中得到了广泛应用。数字pcr是通过对样本进行微小单元化处理，可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目，且数字pcr不依靠任何校准物或外标便可直接计数目标分子数，为绝对定量pcr技术。因此数字pcr(digitalpcr)特别适用于依靠ct值不能很好分辨的应用领域：拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、mirna表达分析、单细胞基因表达分析等。

技术实现要素：

本发明为了克服现有技术的上述不足，提供了一种基于数字pcr检测ctdna的方法，大大提高了检测的精确性和灵敏度。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种基于数字pcr检测ctdna的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)使用循环游离dna提取试剂盒提取血浆循环游离dna；

(2)循环游离dna的富集：将水相和油相混合、振荡配成pcr反应体系并进行乳液pcr扩增，分离水相和油相，得到水相的pcr扩增产物，使用特异性结合循环肿瘤dna的探针序列捕获所述水相的pcr扩增产物中的循环肿瘤dna；

(3)配置pcr数字pcr反应体系

配制pcr水相，pcr水相包括上游引物、下游引物、pcr模板、pcrmix以及双蒸水，上述配合的比例关系为0.5-0.7:0.5-0.7:0.5-0.7：0.1-0.2:13-16:41-45，所述pcr模板为步骤(2)中pcr扩增产物；

配制pcr油相，将65％-68％的甘油、5％-10.5％的tritionx-100、5％-10.5％的司盘60、5％-8％的壬基苯基醚igelco520依次均匀混合，获得的溶液作为反应油相备用；

取1体积水相加到3体积的油相中，涡旋搅拌并反应后，得到油包水微滴pcr反应体系；

(4)pcr扩增反应：将上述充分乳化的油水体系分装，手动转移到96孔pcr板上，孔板用锡箱热封后设定pcr反应条件进行pcr扩增，扩增后将96孔pcr板置于qx100a微滴分析仪中，有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阴性。

进一步地，所述步骤(2)中的水相中含有循环游离dna模板、正反向引物、dntps、pcr缓冲液和dna聚合酶。

进一步地，所述dna聚合酶为高保真dna聚合酶，所述高保真dna聚合酶为高保真的klenowfragment、kapahifi家族高保真dna聚合酶、phusion家族高保真dna聚合酶、q5家族高保真dna聚合酶中的任一种。

进一步地，所述水相dna模板总量1-10ng、正反向引物终浓度为0.1-1μm、dntps终浓度为0.5-2mm、pcr缓冲液终浓度为1倍、dna聚合酶终浓度为0.1-1u。

进一步地，所述步骤(2)中所述探针序列与所述循环肿瘤dna特异性结合以后，通过链霉亲和素磁珠特异性结合生物素而捕获所述循环肿瘤dna。

进一步地，所述步骤(3)中还包括illumina测序仪中使用的测序接头序列，所述测序接头序列对应的正反向引物序列分别为：

5’-tccctacacgacgctcttccgatct-3’和

5’-tgaacctgaaccgctcttccgatct-3’。

进一步地，所述的步骤(3)中得到的油包水微滴的粒径为100nm～1μm。

本发明的有益效果：(1)本发明公开的一种基于数字pcr检测ctdna的方法，针对ctdna在外周血中的含量非常低的特点，采用pcr方法对ctdna进行富集以及有效的捕获，以捕获的ctdna为模板进行数字pcr检测，大大提高了检测的灵敏度，从而提高了诊断的准确性，在癌症检测方面，为早期诊断提供了依据。(2)本发明公开的基于数字pcr定量检测病毒的方法，操作简单，大大降低了检测成本。

具体实施方式

展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。

实施例1：血浆游离循环肿瘤dna提取流程(dna提取试剂盒，qiaampcirculatingnucleicacidkit)

1、用edta抗凝采血管收集患者血液，3000rpm，离心10分钟后，分离上清，将上清再离心，20000×g，离心10分钟后，将上清分离备用。

2、吸取100ulproteinasek至50ml离心管中。

3、吸取1ml血浆加至50ml离心管中。

4、吸取0.8mlbufferacl(含有1.0ugcarrierrna)至50ml离心管后，将离心管帽扣紧，脉冲涡旋30秒。

5、60度孵育30分钟

6、打开离心管帽，加入1.8mlbufferacb，再将离心管帽扣紧，脉冲涡旋15-30秒。

7、将装有混合液体的50ml离心管冰浴5分钟。

8、将qiaampminicolumn安置于qiavac24plus的vacconnector上，在qiaampminicolumn上再安置一个20ml的拓展管。

9、将50ml离心管内的混合液体加入至带有拓展管的qiaampminicolumn内，利用真空泵将混合液体过滤，然后弃掉拓展管。

10、向qiaampminicolumn内加入600ulbufferacw1，利用真空泵将液体过滤。

11、向qiaampminicolumn内加入750ulbufferacw2，利用真空本将液体过滤。

12、向qiaampminicolumn内加入750ul的无水乙醇，利用真空泵将液体过滤。

13、将qiaampminicolumn的帽扣紧后，置于一个干净的2ml收集管内，高速离心(20000×g)3分钟。

14、将qiaampminicolumn置于另一新的收集管中，打开帽，56度孵育10分钟。

15、将qiaampminicolumn置于新的1.5ml离心管中，向qiaampminicolumn的膜上加入30ulbufferave，扣紧帽后，室温孵育3分钟。

16、将带有qiaampminicolumn的1.5ml离心管高速离心(20000×g)1分钟，洗脱血浆游离循环肿瘤dna(ctdna)。

实施例2：ctdna富集、分离

1、pcr扩增富集ctdna

利用油包水乳液体系中的微液滴作为反应器进行pcr扩增，从而富集ctdna，pcr体系包括油相和水相的反应体系。油相作为载体，本发明中使用的油相可以不作限定；水相中反应体系中包括：ctdna模板总量1-10ng、dntps(包括datp、dttp、dctp、dgtp)终浓度为0.5-2mm、pcr缓冲液、dna聚合酶终浓度为0.1-1u和双蒸水(ddh2o)。其中，dna模板为血浆游离循环肿瘤dna。在进行pcr之前，dna双链进行两步修饰，第一步，对双链dna末端进行修复；第二步将“a”加入到dna片段的3’末端；设计pcr引物，包括两部分：基因互补配对部分和接头(adapter)部分，其中pcr引物无需末端修饰，基因互补配对部分位于3’端，pcr扩增时与单链ctdna发生碱基配对；接头部分位于5’端，在后续的基因测序中发挥作用；所述dna聚合酶为高保真dna聚合酶，所述高保真dna聚合酶为高保真的klenowfragment、kapahifi家族高保真dna聚合酶、phusion家族高保真dna聚合酶、q5家族高保真dna聚合酶中的任一种。

本实施例中探针序列与所述循环肿瘤dna特异性结合以后，通过链霉亲和素磁珠特异性结合生物素而捕获所述循环肿瘤dna。为提高捕获ctdna效率，基因互补配对部分的长短可根据具体情况调整，一般25bp左右，不低于20bp；在接头部分设计时，结合具体的测序设备选择序列，长度一般不低于20bp。

pcr扩增富集ctdna的具体操作方法为：水相和油相依次加入到1.5ml不沾壁(non-stick)的反应管中。两相混合后，将装有反应体系的反应管放在组织破碎仪(qiagentissuelyserii)中震荡90秒，参数设为13hz。取下反应试管，将油水体系分装至pcr反应管，根据以下设置参数进行pcr反应：

反转录：温度50℃，10min，1个循环；

预变性：温度95℃，10min，1个循环；

变性：温度94℃，30s，退火；温度58℃，60s，共40个循环；

结束反应：温度98℃，10min，1个循环。

2、分离ctdna

收集反应管中的水相和油相，9000g离心5min，去掉油相，此时水相仍然呈乳球状沉淀在反应管底部，加入400μl(两倍体积)的饱和乙醚，混合物充分涡旋，15000rpm离心2min，去掉上层的乙醚；乙醚重复洗涤一次，得到水相的pcr反应产物。

实施例3：数字pcr检测ctdna

1.配置数字pcr反应体系

配制pcr水相，在超净台中往试管中加入5.22μl，102μm的上游引物和下游引物和pcrmix49.42μl，然后将试管转移到pcr模板加入区加1.66fmol的模板，在超净台中滴加双蒸水足至260μl，充分混匀；

配制pcr油相，一次性往试管中加入1.95ml甘油、0.3ml的tritionx-100、0.3ml的司盘60、0.45ml的辛癸酸甘油酯依次均匀混合，获得的溶液作为反应油相备用；

分别取水相pcr和油相pcr油相按流量比为1:3的比例在线混合，混合的同时在摇床上涡旋搅拌并反应，得到油包水微滴。

2.数字pcr扩增反应

将上述充分乳化的油水体系分装，手动转移到96孔pcr板上，孔板用锡箱热封后设定pcr反应条件进行pcr扩增；扩增条件为：(1)反转录：温度50℃，10min，1个循环；(2)预变性：温度95℃，10min，1个循环；(3)变性：温度94℃，30s，退火；温度58℃，60s，共40个循环；(4)结束反应：温度98℃，10min，1个循环。

3.检测微滴

pcr反应后，将96孔pcr板置于qx100液滴分析仪中，依次吸取每个样本中的微滴并逐一通过检测器，有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阳性；

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。