一种定量检测卡的制作方法

本实用新型涉及微流控技术和免疫荧光技术相结合的技术领域，具体涉及一种定量检测卡。

背景技术：

近年来因自身免疫障碍而导致的不孕问题越发引起人们的重视，抗精子抗体(AsAb)是免疫性不孕最常见的一种因素。抗精子抗体(AsAb)是一个复杂的病理产物，其作用主要表现为精子凝集、精子制动，影响精子的运送，抑制精子穿透宫颈黏液，限制精子与卵透明带粘附，抑制精子顶体的活性，使精子不易穿透包绕卵细胞的放射冠和透明带，阻碍精子与卵细胞膜的融合，阻止精子与卵子结合等。

微流控(Microfluidics)指的是使用微管道(尺寸为数十到数百微米)处理或操纵微小流体(体积为纳升到阿升)的一种技术。当微通道的特征尺寸在微米甚至纳米量级时，微通道表面积与其内部空间的体积之比很大，通道的结构、形状和壁面性质都将对其中的流体流动状态产生极大的影响。流体在微流控的微通道中具有独特的流体性质，如层流和液滴等。借助这些独特的流体现象，微流控可以实现一系列常规方法所难以完成的微加工和微操作。

免疫荧光技术(Immunofluorescence technique)是免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合，使用荧光微球标记已知的抗原或抗体，再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在检测过程中，采用荧光微球最佳激发光源进行激发，发射出的荧光经过滤光片后，用CCD扫描技术或光纤技术，将发射光谱收集、聚集和倍增后，转换成数值信号，实时检测荧光变化曲线。

目前市面上抗精子抗体检测试剂盒多采用酶联免疫吸附法和浅盘凝集法，这些方法尚存在以下方面的不足：

酶联免疫吸附法是采用正常精子膜抗原包被反应板，加待测标本及酶标记二抗底物显色，阳性为明显黄色，阴性孔不显色。此方法操作复杂，且影响因素较多，检测结果易受外界因素的干扰。

浅盘凝集法是将微量正常精子与待测标本在浅盘中混合，镜下观察有无凝集。有活动的凝集精子为阳性。此方法灵敏度低，且较易受到外界因素的干扰。

以上两种传统方法均是定性或半定量的检测方法，无法检测到血液中抗精子抗体的含量水平。

技术实现要素：

针对以上现有技术问题，本实用新型的目的在于提供一种定量检测卡，使用的荧光微球不受外界环境的影响，因而荧光稳定，而且通过微流控技术控制待测血液在检测卡上的流速，为定量检测提供了良好的条件。采用微流控技术和免疫荧光技术制成包括覆有滤纸的加样区、喷涂荧光微球标记的抗精子二抗的结合区、微通道、包被有抗精子二抗并具有特殊结构的检测区和废液区的抗精子抗体定量检测卡。具体技术方案如下：

一种定量检测卡，包括底卡和面卡，其中，所述底卡上设有加样区，结合区，微通道，检测区以及废液区，所述加样区连接结合区且加样区与结合区位于微通道的一端，所述检测区连接废液区且位于微通道的另一端；所述面卡上设有加样孔和检测孔，所述底卡和面卡的背面扣合连接。

所述面卡上的加样孔所处位置对应于底卡上加样区的位置，所述面卡上的检测孔所处位置对应于底卡上检测区的位置。

所述结合区和检测区分别设置于微通道的两端并直接连接至微通道。

所述加样区覆有滤纸，所述结合区喷涂荧光微球标记的抗精子二抗，所述检测区包被有抗精子二抗并具有特殊结构微通道。

所述滤纸直径1.5cm、孔径为1-3μm，所述微通道通过软光刻技术制成，宽度为5μm。

所述面卡上的加样孔连通至底卡上加样区，所述面卡上的检测孔连通至底卡上检测区。

上述抗精子抗体定量检测卡的制作方法，包括如下步骤：

(1)制作底卡模板；

(2)制备荧光微球标记的抗精子二抗；

(3)喷涂荧光微球标记的抗精子二抗；

(4)包被抗精子二抗；

(5)粘覆滤纸粘覆；

(6)制备完成抗精子抗体定量检测卡。

进一步地，步骤(1)中，采用聚二甲基硅氧烷材质，利用光刻机设备，经过CAD制图、掩模、光刻、再铸模、软光刻工艺过程来完成底卡模板的制作，其中微通道为5μm；和/或，步骤(2)中，通过聚苯乙烯微球的合成、微球染色、荧光微球标记，将荧光微球标记在抗精子二抗上；和/或，步骤(3)中，用喷金机将荧光微球标记的抗精子二抗按照5μl的量均匀喷涂至底卡模板的结合区；和/或，步骤(4)中，用0.01M PBS调节抗精子二抗的浓度为0.6mg/ml，将所得的溶液按照2μl的量均匀喷涂在底卡模板的检测区；和/或，步骤(5)中，将直径为1.5cm、孔径为1～3μm的圆形滤纸粘覆在底卡模板的加样区；和/或，步骤(6)中，将面卡和制备好的底卡按合，压紧。

上述抗精子抗体定量检测卡的使用方法，包括如下步骤：

a.取1mg制备的荧光微球加入90μl 50mg/ml对乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺(EDC)，150μl 5mg/ml氮经基唬拍酞亚胺(NHS)，振荡混匀，室温孵育30min；

b.离心；

c.沉淀用0.01M的硼酸盐缓冲液溶解，并调节微球浓度为OD₄₅₀为0.6；

d.将0.1ml荧光微球中加入6μl抗精子二抗，充分混匀后，室温搅拌反应3h；

e.用超纯水洗涤离心3次；

f.沉淀用0.01M的PBS溶液复溶沉淀至起始体积后，即为荧光微球标记的抗精子二抗。

进一步地，步骤b中1000×g离心15min，步骤c中硼酸盐缓冲液pH为4.8，调节荧光微球的浓度为OD₄₅₀是0.6，步骤f中PBS溶液为磷酸盐缓冲液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20。

与目前现有技术相比，本实用新型检测过程中，采用荧光检测仪实时检测荧光微球在最佳激发光源的激发下所发出的荧光数值，测出荧光变化曲线，对照其标准曲线，取两点荧光值所对应的抗精子抗体的标准浓度值，通过公式即可换算出待测血清中抗精子抗体的含量。本实用新型灵敏度高、操作简便、稳定且定量准确。

具体来说：

1、本实用新型采用荧光微球标记抗精子二抗。荧光微球是一种载有荧光分子的功能性微球，有比较稳定的形态结构及发光行为，故而不易受到外界因素的干扰。

2、本实用新型采用微流控技术和免疫荧光技术，通过5μm的微通道控制待测血液在检测卡上的流速，加上荧光微球稳定高效的发光效率，定量检测待测血液中抗精子抗体的含量。

3、本实用新型采用检测卡形式，只需滴一滴待测血液即可完成检测，操作简便，灵敏度高。

附图说明

图1是抗精子抗体定量检测卡的底卡结构示意图；

图2是抗精子抗体定量检测卡的面卡结构示意图。

具体实施方式

下面根据附图对本实用新型进行详细描述，其为本实用新型多种实施方式中的一种优选实施例。

在一个优选实施例中，一种定量检测卡，包括底卡和面卡，其中，底卡上设有加样区11，结合区12，微通道13，检测区14以及废液区15，加样区11连接结合区12且加样区11与结合区12位于微通道13的一端，检测区14连接废液区15且位于微通道13的另一端；面卡上设有加样孔21和检测孔22，底卡和面卡的背面扣合连接。

面卡上的加样孔21所处位置对应于底卡上加样区11的位置，面卡上的检测孔22所处位置对应于底卡上检测区14的位置。

结合区12和检测区14分别设置于微通道13的两端并直接连接至微通道13。

加样区11覆有滤纸，结合区12喷涂荧光微球标记的抗精子二抗，检测区14包被有抗精子二抗并具有特殊结构微通道。

滤纸直径1.5cm、孔径为1-3μm，微通道13通过软光刻技术制成，宽度为5μm。

面卡上的加样孔21连通至底卡上加样区11，面卡上的检测孔22连通至底卡上检测区14。

优选地，一种抗精子抗体定量检测卡是采用聚二甲基硅氧烷(也称硅酮弹性体或硅橡胶，PDMS)材质制成，由底卡和面卡组成，底卡构造包括覆有滤纸的加样区11、喷涂荧光微球标记的抗精子二抗的结合区12、微通道13、包被有抗精子二抗并具有特殊结构微通道的检测区14和废液区15，面卡包含加样孔和检测孔，面卡构造包括加样孔21和检测孔22。

底卡构造中加样区粘覆有滤纸，滤纸直径1.5cm、孔径为1～3μm，底卡构造中包含通过软光刻技术制成的微通道，微通道为5μm，底卡中结合区喷涂荧光微球标记的抗精子二抗，底卡中检测区带有弯型通道的特殊结构。

一种抗精子抗体定量检测卡是采用一种荧光微球标记抗精子二抗的方法：取1mg制备的荧光微球加入90μl 50mg/ml对乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺(EDC)，150μl 5mg/ml氮经基唬拍酞亚胺(NHS)，振荡混匀，室温孵育30min后，1000×g离心15min，沉淀用0.01M的硼酸盐缓冲液(pH4.8)溶解，并调节微球浓度为OD₄₅₀为0.6。将0.1ml荧光微球中加入6μl抗精子二抗，充分混匀后，室温搅拌反应3h，分别用超纯水洗涤离心3次后，沉淀用0.01M的PBS溶液(磷酸盐缓冲液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)复溶沉淀至起始体积后，即为荧光微球标记的抗精子二抗。

调节荧光微球的浓度为OD₄₅₀是0.6，0.1ml荧光微球中加入6μl抗精子二抗。

在另一个优选实施例中，可以采用如下方案：一种抗精子抗体定量检测卡，通过抗精子抗体定量检测卡的底卡模板的制作、荧光微球标记的抗精子二抗的制备、包被抗精子二抗、滤纸粘覆、抗精子抗体定量检测卡的制备等步骤完成抗精子抗体定量检测卡的制作，具体包括以下步骤：

抗精子抗体定量检测卡的底卡模板的制作：采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材质，利用光刻机设备，经过CAD制图、掩模、光刻、再铸模、软光刻等工艺过程来完成底卡模板的制作，微通道为5μm。

荧光微球标记的抗精子二抗的制备：通过聚苯乙烯微球的合成、微球染色、荧光微球标记，将荧光微球标记在抗精子二抗上。

喷涂荧光微球标记的抗精子二抗：用喷金机将荧光微球标记的抗精子二抗按照5μl的量均匀喷涂至底卡模板的结合区。

包被抗精子二抗：用0.01M PBS(磷酸盐缓冲液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)调节抗精子二抗的浓度为0.6mg/ml，将所得的溶液按照2μl的量均匀喷涂在底卡模板的检测区。

滤纸粘覆：将直径为1.5cm、孔径为1～3μm的圆形滤纸粘覆在底卡模板的加样区。

抗精子抗体定量检测卡的制备：将面卡和制备好的底卡按合，压紧，再将组装好的检测卡装入铝箔袋中，加入干燥剂后封口保存，与室温干燥环境下可保存一年。

通过微通道控制待测样品的流速，再利用免疫荧光技术实时检测荧光变化曲线，再根据一定时间内荧光变化值换算待测样品中抗精子抗体的浓度水平值。

制作方法优选实施例：

一、抗精子抗体定量检测卡的底卡模板的制作

本实用新型检测卡的底卡是采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材质，利用光刻机设备，经过CAD制图、掩模、光刻、再铸模、软光刻等工艺过程来完成底卡模板的制作，微通道为5μm。

二、荧光微球标记的抗精子二抗的制备

1、聚苯乙烯微球的合成

将乙醇50ml和分散剂聚乙烯吡咯烷酮1.80g置于100ml圆底烧瓶中，搅拌成均相体系。引发剂偶氮二异丁腈0.24g和单体苯乙烯12.00g混合并超声振荡溶解，通氮气条件下加入到圆底烧瓶中，保持70℃条件聚合反应12h。得到的乳液样品用乙醇洗涤3次，除去未反应完全的单体和引发剂，置于真空干燥箱(60℃、80kPa)干燥24h。

2、微球染色

取三氯甲烷0.5ml和异丙醇4.5ml的混合溶剂、吐温-2050mg、聚苯乙烯微球0.1g、R101(罗丹明101)8mg置于25ml烧杯中，超声分散10min；将上述混合液在真空干燥箱(30℃、80kPa)放置12h，当所有溶剂都挥发后，用乙醇洗涤微球、离心，重复3次除去未反应的荧光素。

3、荧光微球标记

取1mg上述制备的荧光微球加入90μl 50mg/ml对乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺(EDC)，150μl 5mg/ml氮经基唬拍酞亚胺(NHS)，振荡混匀，室温孵育30min后，1000×g离心15min，沉淀用0.01M的硼酸盐缓冲液(pH4.8)溶解，并调节微球浓度为OD₄₅₀为0.6。将0.1ml荧光微球中加入6μl抗精子二抗，充分混匀后，室温搅拌反应3h，分别用超纯水洗涤离心3次后，沉淀用0.01M的PBS溶液(磷酸盐缓冲液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)复溶沉淀至起始体积后，即为荧光微球标记的抗精子二抗。

三、喷涂荧光微球标记的抗精子二抗

用喷金机将荧光微球标记的抗精子二抗按照5μl的量均匀喷涂至底卡模板的结合区，30℃真空干燥1～2h，放于室温干燥环境中备用。

四、包被抗精子二抗

用0.01M PBS(磷酸盐缓冲液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)调节抗精子二抗的浓度为0.6mg/ml，将所得的溶液按照2μl的量均匀喷涂在底卡模板的检测区，30℃真空干燥12h，于室温干燥环境中保存备用。

五、滤纸粘覆

将直径为1.5cm的圆形滤纸粘覆在底卡模板的加样区。

六、抗精子抗体定量检测卡的制备

将面卡和制备好的底卡按合，压紧，再将组装好的检测卡装入铝箔袋中，加入干燥剂后封口保存，与室温干燥环境下可保存一年。

如图1所示，该抗精子抗体定量检测卡的底卡构造包括覆有滤纸的加样区11、喷涂荧光微球标记的抗精子二抗的结合区12、微通道13、包被有抗精子二抗并具有特殊结构微通道的检测区14和废液区15。

如图2所示，该抗精子抗体定量检测卡的面卡构造包括加样孔21和检测孔22。检测步骤如下：

1、样品检测：平放检测卡，将待测血清平衡至室温，用已灭菌的一次性滴管吸取待测血清滴一滴至加样孔，立即将检测卡放至荧光检测仪中。荧光检测仪实时检测荧光微球在最佳激发光源的激发下所发出的荧光数值。

2、结果分析：通过荧光分析软件分析所测荧光的变化曲线，对照其标准曲线，得出A₁、A₂荧光值所对应的抗精子抗体的标准浓度值AsAb₂、AsAb₁。

AsAb₀表示待测血清中抗精子抗体的含量，AsAb₁、AsAb₂表示A₁、A₂荧光值所对应的抗精子抗体的标准浓度值，V表示在微通道中血清流体的流速，t₁、t₂表示A₁、A₂荧光值所对应的时间，根据以下公式换算出待测血清中抗精子抗体的含量：

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