专利名称：用于检测和/或定量人类dna的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学、诊断学领域，更具体来说属于分析和法医学领域。本发明还属于核酸扩增和定量领域，更具体来说属于DNA定量领域。
背景技术：
在所有DNA分型方法中，以及各种其他科学领域的DNA检测中，测定从法医样品以及其他样品回收的DNA的量是一个关键步骤。例如对于多重DNA分型试剂盒来说，为了产生最优结果，通常需要输入的DNA在0.5至2ng的狭窄范围内。因此，为了确保阳性结果是阳性结果和/或阴性结果是由不存在DNA造成的阴性结果，DNA的定量是绝对重要的。此夕卜，法医DNA测试实验室的质量标准要求人类特异性的DNA定量。这是由于分离技术可能将人类DNA与细菌和其他外源DNA —起回收而造成的。已经开发了允许对人类特异性DNA进行定量的许多方法步骤，包括初始印迹(start-blot)技术、基于液体的杂交测定法和实时PCR (聚合酶链反应)。目前，由于实时PCR的动态范围宽并且易于自动化，实时PCR是主导技术。现代的STR试剂盒已变得灵敏得多，并且即使使用少量DNA也能获得良好结果。因此，对于允许精确和准确定量甚至低浓度样品中的人类DNA的方法、试剂盒和核酸区域存在着需求。已经有某些定量和检测试剂盒可用，然而它们具有严重的缺点。一种这样的试剂盒是 Quantifiler Human 试剂盒(Applied Biosystems),另一种试剂盒是 QuantifilerDuo试剂盒(Applied Biosystems),另一种试剂盒是Plexor HY实时PCR定量试剂盒(Promega)0 Quantifiler Duo试剂盒和Plexor HY试剂盒两者都祀向基因组上的常染色体和性染色体(Y染色体)靶标。所述试剂盒的缺点:根据LaSalle等，(Forensic ScienceInternational:Genetics, “通过实时聚合酶链反应进行DNA定量的单拷贝和多拷贝方法的分析，’ (Analysis of Single and Mult1-copy Methods for DNA Quantification byReal-Time Polymerase Chain Reaction)),与 Plexor HY 相t匕，Quantifiler 试齐[J盒在定量中更准确，但是具有较低的动态范围。Plexor HY由于扩增多拷贝靶标而提供较高的动态范围，但是准确性较低。这种较低的准确性可以归因于多拷贝靶标。如果由于例如靶标拷贝数的不稳定性，扩增少于基因组上全套20个拷贝，那么常染色体与性染色体(Y)靶标之间的扩增比率可能发生变化。Plexor HY试剂盒的动态范围略好于其他试剂盒(LaSalle等，Forensic Science International:Genetics, “通过实时聚合酶链反应进行DNA定量的单拷贝和多拷贝方法的分析”(Analysis of Single and Mult1-copy Methods for DNAQuantification by Real-Time Polymerase Chain Reaction))。在统计学t匕较中，LaSalle等证实了这两种试剂盒之间的显著差异。法医学中的另一个重要参数是必须进行分析的DNA的降解等级。由于Quantifiler Human和PlexoHY试剂盒的扩增子的大小从62至133个碱基对(bp)不等，因此当将试剂盒应用于降解的DNA时， 预期可能存在显著差异。
发明概述本发明解决了上面指出的问题，并提供了如下所概述的以下解决方案。一方面，本发明涉及用于定量和/或检测样品中基因组的一个或多个核酸的方法，其中a.对所述核酸进行扩增，并且被扩增的基因座是基因组中的多拷贝基因座，b.所述多拷贝基因座在至少两个不同的染色体上具有拷贝，c.并且对扩增产物进行检测和/或定量。这种新方法与现有方法相比的一个显著优点是更高的灵敏度和被检测靶标的更高稳定性。其他以前已知的靶标在不同个体之间可能存在变化，这是由于重复元件倾向于在数目上变化(Pavelitz等，人类U2snRNA基因在分裂中期表现出永久性开放的转录状态和启动子角军体(Human U2snRNA Genes Exhibit a Persistently Open TranscriptionalState and Promoter Disassembly at Metaphase), Molecular and CellularBiology, 20081, p.3573-3588 ;Liao等，编码人类U2snRNA的串联重复基因(RNU2基因座)的协同进化参与快速染色体内均勻化和稀有的染色体间基因转变(Concerted evolution ofthe tandemly repeated genes encoding human U2snRNA(the RNU21ocus)involves rapidintrachromosomal homogenization and rare interchromosomal gene conversion),The EMBO Journal, Vol.16, N0.3, pp.588, 598, 1997 ； Jasinska 等，塑造人类转录组的重复序列(Repetitive sequences that shape the human transcriptome), FEBS Letters567(2004) 136-141)。理想情况下，所述基因座不是重复元件例如短的串联重复序列，或本身不是具有下式的元件:(AwCxGyTz) 2-1_，其中W、X、y和z可以在O至10之间变化,并表示该单元中存在的核苷酸数目。所述单元可以被重复2至1000次。另一种重复元件是通常在端粒内的卫星DNA。其他也不适合的重复元件是短散在核元件(SINE)和长散在核元件(LINE)。此外，本发明涉及基因组中的多拷贝基因座用于检测和/或定量所述基因组的核酸的用途，其中所述多拷贝基因座不是重复元件并在至少两个不同的染色体上具有拷贝。此外，本发明涉及用于检测和/或定量人类核酸的试剂盒，其中所述试剂盒包含引物，所述引物在严紧的条件下与在80个碱基对的区段上与SEQ ID N0.1或52的序列具有至少80%序列同一性的序列结合。在本文中使用下列缩写:(1)HDA (解链酶依赖性扩增)，(2) PAGE (聚丙烯酰胺凝胶电泳)，(3)gDNA (基因组DNA)，(4)FAM (6-羧基荧光素)，(5) SNP (单核苷酸多态性)，(6)NTC (无模板对照)，(7) BHQ (黑洞淬灭剂)，(8) qPCR (定量PCR)，(9) HEX (6-羧基-4，7，2’，4’，5’，7’ -六氯荧光素)。发明详述用于定量和/或检测样品中基因组的一个或多个核酸的方法，其中a.对所述核酸进行扩增，并且被扩增的基因座是基因组中的多拷贝基因座，b.所述多拷贝基因座在至少两个不同的染色体上具有拷贝，c.并且对扩 增产物进行检测和/或定量。令人惊讶的是，本发明人发现，当用于核酸的检测和/或定量时，不是重复元件的多拷贝基因座优于其他基因座。众所周知，在不同个体之间重复元件的拷贝数可能不同。因此，本发明优选涉及本文中引述的方法，其中所述多拷贝基因座不是重复元件。总的来说，这些核酸可以具有原核或真核等任何来源。优选情况下，它们是哺乳动物的，更优选为人类的。这是因为本发明的一个极大优点是其在法医学领域中的应用。一个这样的序列被显示在SEQ ID N0.1中，另一个序列显示在SEQ ID N0.52中。事实上，SEQ ID N0.1是SEQ ID N0.52的一部分。本发明人已令人吃惊地发现，该序列和/或与其具有序列相似性的序列可以在人类基因组中被多次找到。因此，理想情况下使用与这些序列结合的引物和/或探针。
权利要求
1.用于定量和/或检测样品中基因组的一个或多个核酸和/或用于分析人类DNA的可能的降解状态和/或用于分析拷贝数变异(CNV)的方法，其中 a.对所述核酸进行扩增，并且被扩增的基因座是基因组中的多拷贝基因座， b.所述多拷贝基因座在至少两个不同的染色体上具有拷贝， c.并且对扩增产物进行检测和/或定量，并且 d.所述多拷贝基因座不是重复元件。
2.权利要求1的方法，其中所述基因座与SEQID N0.1或SEQ ID N0.52的序列在80个碱基对的区段上具有至少80%的序列同一性。
3.权利要求1或2的方法，其中所述多拷贝基因座的至少4个不同拷贝被扩增。
4.权利要求1至3的方法，其中扩增方法是非等温法或等温法。
5.权利要求4的方法，其中所述扩增方法选自定量实时PCR(rtPCR)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增(MDA)、滚环扩增(RCA)、环介导的等温扩增(LAMP)、转录介导的扩增(TMA)、解链酶依赖性扩增(HDA)、SMART扩增法(SMAP)、单引物等温扩增(SPIA)、切口酶扩增反应(NEAR)、指数扩增反应(EXPAR)、重组酶聚合酶扩增(RPA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。
6.权利要求5的方法，其中所述扩增方法是解链酶依赖性扩增(HDA)或实时PCR(rtPCR)o
7.前述权利要求任一项的方法，其中所述扩增产物的长度在60个碱基对和200个碱基对之间。
8.前述权利要求任一项的方法，其中用于扩增的引物具有在18个核苷酸的区段上与SEQ ID N0.2、3、5、6、8、9、10、11和/或12的差异不超过5个核苷酸的核苷酸序列。
9.基因组中的多拷贝基因座用于检测和/或定量所述基因组的核酸、用于分析人类DNA的可能的降解状态或作为参比基因用于拷贝数变异(CNV)分析的用途，其中所述多拷贝基因座在至少两个不同的染色体上具有拷贝。
10.权利要求9的用途，其中所述基因座与SEQID N0.1或SEQ ID N0.52的序列在80个碱基对的区段上具有至少80%的序列同一性。
11.用于检测和/或定量人类核酸的试剂盒，其中所述试剂盒包含引物，所述引物在严紧的条件下与在80个碱基对的区段上与SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.52的序列具有至少80%的序列同一性的序列结合。
12.权利要求11的试剂盒，其中所述试剂盒中至少一个引物具有在18个核苷酸的区段上与SEQ ID N0.2、3、5、6、8、9、10、11和/或12的差异不超过5个核苷酸的核苷酸序列。
全文摘要
本发明涉及用于检测和/或定量样品中基因组的一个或多个核酸的方法、试剂盒和各种核酸序列的用途。其中对所述核酸进行扩增，并且被扩增的基因座是基因组中的多拷贝基因座，所述多拷贝基因座在至少两个不同的染色体上具有拷贝，并对扩增产物进行检测和/或定量。
文档编号C12Q1/68GK103180460SQ201180045929
公开日2013年6月26日 申请日期2011年9月22日 优先权日2010年9月23日
发明者安迪·温德, 弗兰切斯卡·迪帕斯奎尔, 萨比恩·韦尔纳, 萨沙·斯特劳布 申请人:凯杰有限公司