一种食品中小分子化合物elisa检测试剂盒的评价方法
【专利摘要】本发明公布一种食品中农兽药残留、添加剂等小分子化合物ELISA检测试剂盒的评价方法。其特征在于：通过线性验证、选择性验证、基体适用性试验、耐变性评价、批间变异与稳定性评价，进行实验室内实验；通过准确度验证，进行实验室间协同实验。其中，核心的基体适用性实验步骤包括：确定适用的基体范围、准确度验证、偏离计算、重复性评价、检测限和定量限确证。该方法结合室内验证与室间协同实验两个单元，能对商品化ELISA检测试剂盒进行较为准确的评价。
【专利说明】—种食品中小分子化合物ELISA检测试剂盒的评价方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种ELISA检测试剂盒的评价技术，尤其涉及一种食品中农兽药残留、添加剂等小分子化合物ELISA检测试剂盒质量评价方法。
【背景技术】
[0002]试剂盒在分析检测工作中主要是作为一种快速筛查的方法而存在，开始的时候是以传统经典方法的替代方法出现的，几乎所有的试剂盒方法在发现问题时都需要以传统的检测方法作为最终确认的依据(尤其是在食品理化及微生物检测中更是如此)，因此，人们大多认同试剂盒方法的一些方法学上的不稳定性，比如假阳性率、假阴性率、定量精密度较差等等，并接受了这种可能的结果错误。而恰恰是这种认同使得人们忽视了对试剂盒方法进行更为科学深入的方法学性能指标探讨，而这种忽视在一些敏感领域的分析中是十分危险的。
[0003]目前，商品化试剂盒比较适合企业生产控制或执法现场检测，因其操作方便，结果可快速获得。但试剂盒的生产、销售及认证认可体制尚不完善，没有相应的标准或质量评价政策。且其灵敏度，稳定性及假阴/阳性控制尚不能满足检测需要。一方面是试剂盒的发展向好，而另一方而试剂盒存在的问题也愈来愈突出，尤其是许多国产试剂盒存在的质量问题限制了其发展。实验室检测人员尤其是企业实验室人员希望国家对试剂盒生产厂家进行管理，并对其产品进行验证，使购买者有信心使用国产检测试剂盒，
[0004]正是基于目前试剂盒产品的现状，需要对试剂盒进行规范管理，以保证市场上流通的试剂盒性能指标满足相关要求。
[0005]目前我国尚未有针对试剂盒的完整评价体系，食品安全领域是当前问题最多、最受关注的领域，这个领域的检测包括了物理、化学、微生物及分子生物学基础理论，无论是按检测原理、用途还是其它分类方式，涉及食品安全检测项目的试剂盒的品种是最全最多的。因此，从该领域着手从事评价制度的研究，便于获得基础性数据结果。
[0006]国外自20世纪80年代末起就开始了对试剂盒的评价工作，取得了相当大的进展，获得了良好的效果。但出于种种原因，几乎现所有的评价体系都存在一些缺陷。最为关键的就是由于试剂盒品种繁多，事实上“试剂盒”这个术语至今没有规范的定义，在市场上销售的称之为“试剂盒”的产品各式各样，而不同的试剂盒检测原理差异悬殊，使得在构建评价体系的技术法规时存在相当大的技术难度，迄今为止，国内尚未开展对试剂盒的管理规范工作，而国外官方仅采用直接注册进行管理，国际上最为成功的评定机构之一 AFNOR仅对微生物检测用试剂盒进行评价，依据是IS016140《食品和动物饲料的微生物学替代检测方法验证准则》，而另一影响广泛的机构AOAC更多地依靠技术专家的力量，以专家小组来决定需要验证的技术指标。
[0007]鉴于目前国内外对可供借鉴的成熟的评价制度方案不多，而试剂盒本身的性质也使其不能直接照搬其他产品的评价方案和技术，同时，各种复杂的食品基质会引起诸多干扰因素，因此如何准确评价食品中小分子化合物ELISA检测试剂盒的评价有相当大的技术难度。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种食品中农兽药残留、添加剂等小分子化合物ELISA检测试剂盒的评价方法，以对待评价的商品化ELISA试剂盒作为更为准确的评价。
[0009]本发明的评价方法，其特征在于包括:通过结合室内验证与室间协同实验两个评价单元，根据待评价试剂盒说明书提取特征参数设计评价指标，构架评价单元内各评价指标的计算模型，对食品中小分子化合物ELISA商品化试剂盒进行较为准确的评价。
[0010]实验室内测试实验，包括:
[0011]线性验证，用于寻找非随机模型，消除或降低潜在的关键变异；
[0012]选择性验证，用于评价同类药物的交叉反应以及不同基体的交叉反应；
[0013]基体适用性试验，用于评价对于不同食品基质，待评价试剂盒的准确度、重现性、检测限、定量限；
[0014]耐变性试验，包括确定测试样品和数量，选择需要评价的耐变因素。用于评价可能影响检测结果的因素；
[0015]批间变异与稳定性，用于评价待评价试剂盒的产品稳定性。
[0016]其中，核心的基体适用性试验步骤包括:确定适用的基体范围、准确度验证、偏离计算、重复性评价、检测限和定量限确证。
[0017]实验室间协同实验，包括:
[0018]准确度验证，用于评价在不同实验室、不同操作人员情况下，待评价试剂盒的准确度。
[0019]采用该评价方法，能够对待评价的商品化ELISA检测试剂盒作出较为准确的评价。
【具体实施方式】
[0020]本发明的评价步骤如下:
[0021](一)室内验证单元
[0022]1、线性验证
[0023]用试剂盒提供的样品稀释液分别配制包括Oyg / L在内的6个浓度水平的标准溶液，浓度水平涵盖试剂盒说明书提供的线性范围，每个浓度水平分3天、每天2平行共检测6平行，以响应信号对浓度作图，列出回归方程，并进行回归分析。计算差值(实际信号响应值与曲线图示值之间的差)，并以差值(Y轴)对浓度(X轴)做图，寻找非随机模型；如果发现存在潜在的关键变异，需要建立模型以降低或消除，直到仅余随机噪音值。其中，测试数量:
[0024]6个浓度水平X 2平行X 3次重复(3天)=36个(0D值)
[0025]2、选择性验证
[0026]2.1同类药物的选择性
[0027]配制5个浓度水平的标准溶液，浓度水平涵盖且大于试剂盒说明书提供的线性范围。对照组为不加任何药物的空白溶液(试剂盒中提供的样品稀释液)，其信号响应值(三次测定平均值)记为B。，不同浓度的三聚氰胺所得的信号响应值(三次测定平均值)为B，以药物浓度对数为横坐标，B / BciXlOO1^为纵坐标作标准曲线，得直线回归方程和IC5(I(50%抑制浓度)值。同样方法配制至少五种同类类似物的标准溶液并按上述步骤测定其标准曲线和IC5tl值。各药物的交叉反应率计算公式如下:
[0028]交叉反应率=IC5tl (待测目标物)/ IC50 (同类类似物)X 100 %
[0029]2.2基体的选择性
[0030]配制5个浓度水平的标准溶液，浓度水平与线性验证时使用的标准溶液浓度相同(不包括Oyg / L在内)。对照组为不加任何药物的空白溶液，其信号响应值(三次测定平均值)记为B。，不同浓度的三聚氰胺所得的信号响应值(三次测定平均值)为B，以药物浓度对数为横坐标，B / BtlX 100%为纵坐标作标准曲线，得直线回归方程和IC5tl(50%抑制浓度)值。分别以不含待测目标物的的其他适用基体按说明书所述步骤进行样品前处理，所得溶液用以配制待测目标物基体标准溶液，浓度水平与线性验证时使用的标准溶液浓度相同(不包括O μ g/L在内)，并按上述步骤测定其标准曲线和IC5tl值。各基体间的交叉反应率计算公式如下:
[0031]交叉反应率=IC5tl(空白试剂配制的待测目标物溶液)/ IC5tl (各基体配制的待测目标物溶液)X100%。
[0032]3、基体试验
[0033]3.1基体适用性试 验
[0034]根据试剂盒使用说明书，任意选择2种基质。
[0035]3.2准确度/回收率试验
[0036]选择样品基体时尽可能采用本身含有分析物的样品基体，在不能获得时，可选择人工加标方式进行制备。分析物的浓度应涵盖试剂盒检测方法给出的浓度范围。在人工加标时，对于液体样品，选择在大体积样品中添加加标液后混匀；对于湿润的样品，选择在大量样品中滴加加标液，混匀并均质；对于干样，选择在基体中添加干燥的加标物，混匀。在加标过程中应保证样品基体的完好，同时须保证基体未在加标过程中被稀释。
[0037]采用基体加标进行回收率实验，对6个浓度水平进行实验，浓度水平与线性验证时使用的标准溶液浓度相同(包括阴性样品在内)。每个浓度水平8平行。
[0038]3.3 偏离
[0039]偏离指采用试剂盒方法进行检测的结果与真值之间的差异。
[0040]偏差=检测浓度平均值-真值
[0041]相对偏差=偏差/真值
[0042]3.4重复性
[0043]同一操作人员在短时间内用同样仪器在同一实验室内采用相同的方法进行独立检测所得到的数据。根据3.2实验数据进行计算。
[0044]重复性以标准偏差Sr和相对标准偏差RSDr表不。
[0045]3.5检测限LOD和定量限LOQ
[0046]对于每种基体，以&对检测结果的平均值作图，公式见下:
[0047]LOD = — + 3(-S^，其中-为未加标样品重复测定值，Sb为截距，m为斜率，
l~1.65mXoL0Q=3XLOD
[0048]上述公式计算出的LOD值属于理论值，尚需要以下方式进行实际样品验证:
[0049](I)LOD的试验验证
[0050]以理论LOD值浓度为基础，制备20个标准物质或加标样品，当检出概率为95%时(即有19个样品为阳性，I个样品为阴性)，则该浓度为95%置信度时的L0D。对于禁用药物而言，一般要求LOD的置信度为99%，L0D99%=L0D95%+1.64S，式中L0D95%为95%置信度时的检出限，L0D99%为99%置信度时的检出限，S为20个样品测定浓度值的标准偏差。
[0051](2) LOQ的试验验证
[0052]对于LOQ值不用计算，直接采用试剂盒说明书标识的LOQ值进行试验验证即可，SP制备20个标准物质或加标样品，经样品分析后，按照回归方程计算出每个样品的浓度值、平均浓度值、偏差、标准偏差，若在该浓度水平的检测准确度和精密度满足试剂盒说明书的标识值即可。
[0053]4.耐变性
[0054]耐变性评价由以下步骤组成:确定可能影响检测结果的因素、对每一种因素稍作改变、采用合适的方法进行耐变性检验、若发现某种因素可显著影响检测结果，应进一步实验以确定该因素可接受的水平、在检测方法中应清楚说明可显著影响检测结果的因素。举例如表1所示:
[0055](I)测试样品和数量
[0056]选用I种测试基质，添加浓度大于等于最低检测限，每种测试条件8平行。
[0057](2)耐变因素选择
[0058]确定需要评价的变量4个(A、B、C、D)，每个变量取两个不同的水平(如A、a)。
[0059]表1耐变性试验方法
[0060]
【权利要求】
1.一种食品中农兽药残留、添加剂等小分子化合物ELISA检测试剂盒的评价方法，其特征在于:通过线性验证、选择性验证、基质适用性实验、耐变性考察、批间变异与稳定性考察，进行实验室内测试实验；通过准确度验证，进行实验室间协同实验，以评价试剂盒的技术性能。 所述基质适用性实验包括以下步骤: (1)确定适用的基质范围:任意选取两种适用基质； (2)准确度验证:采用基质加标进行准确度检验实验，配制包括阴性样品在内的6个浓度水平的标准溶液，浓度水平涵盖线性范围，每个浓度水平做8次平行测定，以响应信号对浓度作图，列出回归方程并进行回归分析； (3)偏离程度计算:用偏差表示偏离程度，计算公式为:偏差=检测浓度平均值添加浓度值，相对偏差=偏差/添加浓度值； (4)重复性:根据准确度试验数据，计算标准偏差和相对标准偏差； (5)检测限和定量限计算:以标准偏差对检测结果的平均值作图，检测限二土十3以)，其中-为未加标样品重复测定值，Sb为截距，m为斜率，定量限
I — 1.65/77X ο=3XLOD ； (6)检测限的试验验证:向阴性试样中添加如步骤(5)计算所得检测限水平的待测小分子化合物，制备大于等于20个标准物质或加标样品，检出概率=检出样品/制备样品X 100%，当检出概率大于或等于95%时，表明待评价试剂盒在95%置信度下的检测限满足要求； (7)定量限的试验验证:定量限直接采用试剂盒说明书标识的定量限进行试验验证。
【文档编号】G01N33/53GK103575873SQ201310385434
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年8月30日 优先权日:2013年8月30日
【发明者】邹明强, 王燕飞, 薛强 申请人:中国检验检疫科学研究院