专利名称：食品红10检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种添加剂检测技术，具体来说，特别是涉及一种用于食品红10含量的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
食品红10，又名酸性红I或红2G，化学名称为8-乙酰氨基_2_苯偶氮基_1_萘酚基-3，6- 二磺酸二钠盐，属偶氮类着色剂，易溶于水，具有优良的匀染性和渗染性，用作工业染色剂。英国常用于海鲜酱、腊肠、年糕、辣酱、红醋、牛肉干等食品的着色，2007年欧洲食品安全局相关研究机构对食品红10色素重新进行了安全评估，发现该色素在肠内能够转化为苯胺，后者为具有遗传毒性，借此推断食品红10色素具有潜在的致癌作用，因而撤消 了日容许摄入量，禁止在食品中使用，我国、美国、加拿大、日本、澳大利亚等多国都明确禁止食品中使用食品红10 ;而且，随着化妆品中着色剂导致的皮肤病急剧增加，很多国家如美国、欧盟、日本等均对化妆品中着色剂的种类、使用范围和用量有严格的规定，我国《化妆品卫生规范》(2007版)规定食品红10为限用着色剂。因此，快速检测食品红10在食品和化妆品中的含量是非常必要的。
发明内容
基于此，本发明提供一种食品红10检测试剂盒和一种食品红10试剂盒制备方法，该试剂盒在检测食品红10时可一次连续检测多个样品，具有便捷，快速，灵敏、成本低的特点。本发明的第一个目的在于提供一种食品红10检测试剂盒,其技术方案如下一种食品红10检测试剂盒，主要包括I)包被食品红IO特异性抗原的酶标板所述酶标板的每个微孔内食品红IO特异 性抗原的浓度为1-3 μ g/mL ;2)食品红10特异性抗体溶液该食品红10特异性抗体的浓度为1-3 μ g/mL ；所述食品红10特异性抗原与食品红10特异性抗体溶液的用量比为1:1。在其中一个实施例中，所述食品红10检测试剂盒还包括有酶标二抗,所述酶标二抗是浓度按1:10000比例稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗。在其中一个实施例中，所述食品红10特异性抗原的浓度为2 μ g/mL ;所述食品红10特异性抗体的浓度为2 μ g/mL。在其中一个实施例中，所述食品红10检测试剂盒还包括食品红10标准品溶液、底物显色剂、洗涤液、终止液、封闭液和浓缩样品稀释液。在其中一个实施例中，所述特异性食品红10特异性抗体是鼠源单克隆抗体；所述食品红10特异性抗原为食品红10与载体蛋白的偶联物；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、兔血清白蛋白、甲状腺球蛋白中的一种；所述食品红10标准品溶液浓度分别为 I X IO5 μ g/L、I X IO4 μ g/L、I X IO3 μ g/L、I X IO2 μ g/L、IXlO1U g/L、I X 10° μ g/L ；所述显色剂由显色剂A和显色剂B组成，所述显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，所述显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺；所述终止液为l-2mol/L的硫酸溶液；所述洗涤液为含有
O.05%-0. 5%吐温-20的O. 01M, pH7. 4的磷酸盐缓冲液；所述封闭液为含5%脱脂奶粉的
O.01M，pH7. 4的磷酸盐缓冲液；所述浓缩样品稀释液为O. 01M，pH7. 4的磷酸盐缓冲液；所述酶标板的材料为聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯中的一种。本发明的第二个目的在于提供一种食品红10检测试剂盒制备方法，主要包括以下步骤I)制备包被食品红10特异性抗原的酶标板将食品红10和三乙胺分散于干燥二氯甲烷中，零摄氏度下加入甲磺酰氯作为活化试剂，室温搅拌，食品红10的醇羟基可转化成甲磺酯基；随后将甲磺酯化食品红10加入无水乙醇中，加入液氨，回流搅拌h，制得能够与蛋白质偶联的食品红10的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合，再与牛血 清白蛋白混合，室温搅拌，偶联制备得到食品红10特异性抗原；将食品红10特异性抗原包被于酶标板中，所述酶标板的每个微孔内食品红10特异性抗原的浓度为1-3 μ g/mL ；2)制备食品红10特异性抗体以步骤I)中合成的食品红10特异性抗原作为免疫原对小鼠进行免疫；免疫后，取血清效价高的小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；并取不完全佐剂腹腔注射进行致敏后的小鼠，将杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的食品红10单克隆抗体；所述食品红10特异性抗体的浓度为1-3 μ g/mL。在其中一个实施例中，上述步骤I)中，制备食品红10特异性抗原的方法优选为将O. 87g食品红10和I. Olg三乙胺分散于IOOmL干燥二氯甲烷中，零摄氏度下加入O. 5mL甲磺酰氯作为活化试剂，室温搅拌3. 5h，食品红10的醇羟基可转化成甲磺酯基；随后将甲磺酯化食品红10加入无水乙醇中，加入20倍量的液氨，回流搅拌5h，制得能够与蛋白质偶联的食品红10的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合，再与牛血清白蛋白混合，室温搅拌lh，偶联制备得到食品红10特异性抗原。在其中一个实施例中，上述步骤2)为以步骤I)中合成的食品红10特异性抗原作为免疫原对10周龄的Balb/c小鼠进行免疫。首次免疫使用完全弗氏佐剂与食品红10特异性抗原溶液乳化，抗原浓度为O. 4mg/mL，剂量为120 μ g/只，以后每次加强免疫使用不完全弗氏佐剂与食品红10特异性抗原溶液乳化，剂量同初次免疫。初次免疫两周后，每间隔10天加强免疫一次，共免疫5-10次，当抗体效价不再升高时，进行最后一次免疫，最后一次不加免疫佐剂直接用食品红10特异性抗原水溶液腹腔注射，剂量同初次免疫。尾部取血检测血清效价。取血清效价高的小鼠，在无菌条件下，取其脾细胞按6:1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；并取Balb/C小鼠，于一周前采用不完全佐剂腹腔注射进行致敏，剂量为O. 5mL/只；将细胞浓度为I. 5万/mL的杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，剂量为O. 5mL/只；接种杂交瘤细胞7 10天后，收集腹水，反复收集数次；存于4°C冰箱保存；经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的食品红10单克隆抗体。本发明的食品红10检测原理为将食品红10特异性抗原吸附于固相载体上，加入样品或食品红10的标准溶液及食品红10特异性抗体工作液，待测样品中食品红10和固相载体上包被的食品红10特异性抗原竞争结合食品红10特异性抗体，孵育后，加入酶标二抗进行酶活性的放大作用，孵育，显色后终止，测定样品的吸光度，该值与样品中食品红10的量呈负相关，与标准曲线比较即可得出食品红10浓度范围。下面对前述技术方案的优点进行说明本发明的食品红10检测试剂盒，利用竞争酶联免疫测定法检测食品红10，具有特异性高，结果准确且前处理简单，对仪器设备要求低、检测成本低的特点。同时，本试剂盒中的试剂以工作液形式提供，操作简单、快捷，为使用者节省了时间并减少因步骤复杂造成的误差。适合用于快速而准确得检测大批量样品中的食品红10。
具体实施方式
下面对本发明的实施例进行详细说明，但不对本发明的内容造成任何限制。实施例I本实施例所述的食品红10检测试剂盒的主要组成成份如下I)食品红10特异性抗原工作液；通过以下方法制得将O. 87g,即I. Ommol食品红10和I. Olg,即IOmmol三乙胺分散于IOOmL干燥二氯甲烷中，零摄氏度下加入O. 5mL,即6. 46mmol甲磺酰氯作为活化试齐U，室温搅拌3. 5h，食品红10的醇羟基可转化成甲磺酯基；随后将甲磺酯化食品红10加入无水乙醇中，加入20倍量的液氨，回流搅拌5h，制得能够与蛋白质偶联的食品红10的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺(NHS)和碳二亚胺(EDC)混合，再与牛血清白蛋白混合，室温搅拌lh，偶联制备得到食品红10特异性抗原，并用浓缩样品稀释液稀释至浓度为2 μ g/mL。2)食品红10特异性抗体工作液；通过以下方法制得将合成得到的食品红10特异性抗原作为免疫原对10周龄的Balb/c小鼠进行免疫。首次免疫使用完全弗氏佐剂与食品红10特异性抗原的O. 01M，pH7. 4的磷酸盐缓冲液乳化，抗原浓度为O. 4mg/mL，剂量为120 μ g/只，以后每次加强免疫使用不完全弗氏佐剂与食品红10特异性抗原的O. 01M，pH7. 4的磷酸盐缓冲液乳化，剂量同初次免疫。初次免疫两周后，每间隔10天加强免疫一次，共免疫5-10次，当抗体效价不再升高时，进行最后一次免疫，最后一次不加免疫佐剂直接用食品红10特异性抗原的O. 01M，pH7. 4的磷酸盐缓冲液腹腔注射，剂量同初次免疫。尾部取血检测血清效价。取血清效价高的小鼠，在无菌条件下，取其脾细胞按6:1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株。单克隆抗体的制备与纯化Balb/C小鼠，于一周前采用不完全佐剂腹腔注射进行致敏，剂量为O. 5mL/只。将细胞浓度为I. 5万/mL的杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，剂量为O. 5mL/只。接种杂交瘤细胞疒10天后，收集腹水，反复收集数次。存于4°C冰箱保存。经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化。具体方法每I份腹水中加入3份乙酸钠缓冲液(浓度O. 05mol/L, ρΗ4· 0)，用浓度O. lmmol/L NaOH调整pH值至4. 5，在4°C下搅拌30min,期间缓慢加入辛酸,按稀释前腹水体积计算40 μ L/mL ;在4°C静止3h,离心(10140r/min, 30min)，取上清液，保持在4°C环境中，30min内加入(NH4)2S04使其终浓度为O. 277g/mL,静止lh,4°C离心(10140r/min, 30min),弃上清液,得到单克隆抗体沉淀，并用浓缩样品稀释液稀释至浓度为2 μ g/mL。3)辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗；由商业公司提供的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗；4 )食品红IO标准品溶液6瓶；浓度分别为1X IO5 μ g/L、I X IO4 μ g/L、I X IO3 μ g/L、I X IO2 μ g/L、I X IO1 μ g/L、I X 10° μ g/L ；5)酶标板；96孔聚苯乙烯酶标板，由商业公司提供；6)底物显色剂； 由显色剂A和显色剂B组成，显色剂A为浓度为30%的过氧化氢水溶液，显色剂B为浓度为10mg/mL的四甲基联苯胺DMSO溶液；7)洗涤液；为含有重量比为O. 05%-0. 5%吐温-20的O. OlM, pH为7. 4的磷酸盐缓冲液；8)终止液；为2mol/L的硫酸溶液；9)封闭液； 为含5%脱脂奶粉的O. OlM, pH7. 4的磷酸盐缓冲液；10)浓缩样品稀释液；为O. OlM, pH7. 4的磷酸盐缓冲液(即磷酸根浓度为O. 01M/L, pH7. 4的磷酸盐缓冲液)；11)自封袋；由商业公司提供。实施例2间接竞争ELISA方法的建立。采用间接竞争ELISA法检测食品红10单克隆抗体的竞争抑制率，方法如下I)用2 μ g/mL的食品红10特异性抗原包被96孔酶标板，100 μ L/孔，放置于4°C冰箱包被过夜，用250 μ L/孔封闭液(即5%脱脂奶粉)封闭后用洗涤液洗涤，并拍干；2)加入食品红10标准品溶液(浓度分别为I X IO5 μ g/L、I X IO4 μ g/L、
1X IO3 μ g/L、I X IO2 μ g/L、IXio1U g/L、I X 10° μ g/L)或样品溶液 50 μ L，再加入浓度为
2μ g/mL的食品红10特异性抗体工作液50 μ L，混合均匀，37°C温育Ih ；3)洗涤拍干后，加入用稀释液按1:10000比例稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗工作液，100 μ L/孔，37°C温育Ih ；4)洗漆拍干，每孔加入50 μ L显色液B液、10 μ L显色液A液显色15min,加入浓度为2mol/L的硫酸溶液，50 μ L/孔，终止反应，设定酶标仪于450nm处(优选用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据)，测定OD值。以抑制率1%为纵坐标，以食品红10浓度的对数Ig [食品红10 (ng/mL)]为横坐标，绘制食品红10竞争抑制曲线。将样品的抑制率代入标准曲线回归方程，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中食品红10的实际含量。抑制率计算公式如下
权利要求
1.一种食品红10检测试剂盒，其特征在于，主要包括 1)包被食品红10特异性抗原的酶标板所述酶标板的每个微孔内食品红10特异性抗原的浓度为1-3 V- g/mL ； 2)食品红10特异性抗体溶液该食品红10特异性抗体的浓度为1-3u g/mL ； 所述食品红10特异性抗原与食品红10特异性抗体溶液的用量比为I :1。
2.根据权利要求I所述的食品红10检测试剂盒，其特征在于，还包括有酶标二抗，所述酶标二抗是浓度按1:10000比例稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗。
3.根据权利要求I或2所述的食品红10检测试剂盒，其特征在于，所述食品红10特异性抗原的浓度为2 u g/mL ;所述食品红10特异性抗体的浓度为2 u g/mL。
4.根据权利要求I所述的食品红10检测试剂盒，其特征在于，还包括食品红10标准品溶液、底物显色剂、洗涤液、终止液、封闭液和浓缩样品稀释液。
5.根据权利要求4所述的食品红10检测试剂盒，其特征在于，所述食品红10特异性抗体是鼠源单克隆抗体；所述食品红10特异性抗原为食品红10与载体蛋白的偶联物；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、兔血清白蛋白、甲状腺球蛋白中的一种；所述食品红 10 标准品溶液浓度分别% IXio5U g/L、IXlO4U g/L、IXlO3U g/L、IXlO2U g/L、IXlO1U g/L、IXlOV g/L ;所述显色剂由显色剂A和显色剂B组成，所述显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，所述显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺；所述终止液为l-2mol/L的硫酸溶液；所述洗涤液为含有0. 05%-0. 5%吐温-20的0. 01M，pH7. 4的磷酸盐缓冲液；所述封闭液为含5%脱脂奶粉的0. 01M，pH7. 4的磷酸盐缓冲液；所述浓缩样品稀释液为0. 01M，pH7. 4的磷酸盐缓冲液；所述酶标板的材料为聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯中的一种。
6.一种食品红10检测试剂盒制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤 1)制备包被食品红10特异性抗原的酶标板将食品红10和三乙胺分散于干燥二氯甲烷中，零摄氏度下加入甲磺酰氯作为活化试剂，室温搅拌，食品红10的醇羟基可转化成甲磺酯基；随后将甲磺酯化食品红10加入无水乙醇中，加入液氨，回流搅拌h，制得能够与蛋白质偶联的食品红10的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合，再与牛血清白蛋白混合，室温搅拌，偶联制备得到食品红10特异性抗原；将食品红10特异性抗原包被于酶标板中，所述酶标板的每个微孔内食品红10特异性抗原的浓度为1-3 ii g/mL ； 2)制备食品红10特异性抗体以步骤I)中合成的食品红10特异性抗原作为免疫原对小鼠进行免疫；免疫后，取血清效价高的小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；并取不完全佐剂腹腔注射进行致敏后的小鼠，将杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的食品红10单克隆抗体；所述食品红10特异性抗体的浓度为1-3 u g/mL。
7.根据权利要求6所述的食品红10检测试剂盒制备方法，其特征在于，步骤I)中，制备食品红10特异性抗原的具体方法为将0. 87g食品红10和I. Olg三乙胺分散于IOOmL干燥二氯甲烷中，零摄氏度下加入0. 5mL甲磺酰氯作为活化试剂，室温搅拌3. 5h，食品红10的醇羟基可转化成甲磺酯基；随后将甲磺酯化食品红10加入无水乙醇中，加入20倍量的液氨，回流搅拌5h，制得能够与蛋白质偶联的食品红10的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合，再与牛血清白蛋白混合，室温搅拌lh，偶联制备得到食品红10特异性抗原。
8.根据权利要求6所述的食品红10检测试剂盒制备方法，其特征在于，步骤2)为以步骤I)中合成的食品红10特异性抗原作为免疫原对10周龄的Balb/c小鼠进行免疫；首次免疫使用完全弗氏佐剂与食品红10特异性抗原溶液乳化，抗原浓度为0. 4mg/mL，剂量为120 Ug/只，以后每次加强免疫使用不完全弗氏佐剂与食品红10特异性抗原溶液乳化，剂量同初次免疫；初次免疫两周后，每间隔10天加强免疫一次,共免疫5-10次，当抗体效价不再升高时，进行最后一次免疫，最后一次不加免疫佐剂直接用食品红10特异性抗原水溶液腹腔注射，剂量同初次免疫；尾部取血检测血清效价；取血清效价高的小鼠，在无菌条件下，取其脾细胞按6:1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；并取Balb/C小鼠，于一周前采用不完全佐剂腹腔注射进行致敏，剂量为0. 5mL/只；将细胞浓度为I. 5万/mL的杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，剂量为0. 5mL/只；接种杂交瘤细胞7 10天后，收集腹水，反复收集数次；存于4°C冰箱保存；经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的食品红10单克隆抗体。
全文摘要
本发明公开了一种食品红10检测试剂盒，属于添加剂检测技术领域。该试剂盒包括每个微孔内包被浓度为1-3μg/mL食品红10特异性抗原的酶标板，浓度为1-3μg/mL的食品红10特异性抗体，且所述食品红10特异性抗原与食品红10特异性抗体溶液的用量比为11。本发明还公开了一种食品红10检测试剂盒制备方法。本发明的试剂盒在检测食品红10时可一次连续检测多个样品，具有便捷，快速，灵敏、成本低的特点。适合用于快速而准确得检测大批量样品中的食品红10。
文档编号G01N33/543GK102798713SQ20121028176
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月8日 优先权日2012年8月8日
发明者郭新东, 罗海英, 冼燕萍, 蔡玮红, 吴玉銮, 柯振华, 陈意光, 罗东辉 申请人:广州市质量监督检测研究院