肌红蛋白快速检测方法及相应的检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及体外诊断技术领域，特别涉及免疫测定，具体是指一种肌红蛋白快速 检测方法及相应的检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 肌红蛋白（Myoglobin, Myo)是一种氧结合血红素蛋白，主要分布于心肌和骨豁肌 组织。在急性心肌损伤时，Myo最先被释放入血液中，在症状出现约2-3小时后，血中Myo可 超出正常上限，9-12小时达到峰值，24-36小时后恢复正常。对于怀疑ACS的病人建议连续 采样测定，因为症状出现和蛋白标志物释放到血液之间有一段延迟。在ACS早期诊断和监 测的临床效用已有大量文献报告。Myo阴性有助于排除心梗。
[0003] Myo在临床应用领域较为广泛。其在医学上的价值正得到广泛验正和承认。现将 其临床意义综述如下：
[0004] 测定血清肌红蛋白肌红蛋白可作为急性心肌梗死（AMI)诊断的早期最灵敏的指 标。但特异性差，骨骼肌损伤、创伤、肾功能衰竭等疾病，都可导致其升高。Myo阳性虽不 能确诊AMI，但可用于早期排除AMI诊断的重要指标，如Myo阴性，则基本排除心肌梗死， 还可用于再梗死的诊断，结合临床，如Myo重新升高，应考虑为再梗死或者梗死延展。
[0005] 增高：见于急性心肌梗死早期、急性肌损伤、肌营养不良、肌萎缩、多发性肌炎、急 性或慢性肾功能衰竭、严重充血性心力衰竭和长期休克等。在心肌梗死后I. 5h即可增高， 但1?2d内即恢复正常。
[0006] (1)血中升高：甲状腺功能减低症、高醛固酮血症、肾功能不全、恶性高热以及剧 烈运动后等。
[0007] (2)尿中升高：卟啉病、血红蛋白尿症、血尿等。
[0008] (3)血、尿中肌红蛋白均升高：见于急性心肌梗死、心绞痛、心源性休克、心肌病、 肌疾病（进行性肌营养不良、多发性肌炎、重症肌无力）等。
[0009] 正常参考值：
[0010] 男性 2〇 ?8〇yg/L;
[0011] 女性 10 ?70yg/L;
[0012] 诊断限：>100yg/L。
[0013] 血清Myo水平随年龄、性别及种族的不同而异，黑人的Myo水平要高于白人。
[0014] 肌红蛋白灵敏度高但特异性低，临床上需结合其他心肌标志物联合检测，南京基 蛋生物的CK-Myo/cTnI/Myo心梗三项检测试纸，结合肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶等检测指 标，更好地避免了肌红蛋白单项检测造成的漏诊和误诊。
[0015] Myo的检测由于过去Myo的检测方法较为落后，假阳性和假阴性很高，影响了它在 临床上的价值，近几年来，由于检测技术的更新，测定Myo的快速、简便和可靠的方法已迅 速建立。
[0016] Myo的检测方法市面上常见为免疫投射比浊，免疫散射比浊，胶体金免疫层析法， 近些年已有部分厂商引入了部分更为先进的检测方法，现有的方法存在着检测灵敏度低、 精密性差等局限性。
[0017] 所以需要提供一种新的Myo检测方法和试剂盒，以解决现有技术中的存在的问 题。
【发明内容】
[0018] 本发明的目的是为了克服上述现有技术中的缺点，提供一种检测结果稳定，准确 率高、成本低，灵敏度高，精密性好，检测范围宽、适用临床推广的肌红蛋白快速检测方法及 相应的检测试剂盒。
[0019] 为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种肌红蛋白快速检测方法，其特点 在于，包括以下步骤：
[0020] 步骤（1):将内部带有染料的纳米级的感光微球、包被有活性分子的发光微球以 及已标记生物素的活性分子以及待测样本混合，得到混合物；
[0021] 步骤（2):对所述的混合物进行温育培养，具有免疫特性的各组分反应得到结合 物；
[0022] 步骤（3):采用激发光对所述的结合物进行照射后，所述的结合物发光，使用光子 计数器进行测定，得到检测数值。
[0023] 较佳地，所述的活性分子为Myo抗体。
[0024] 较佳地，所述的感光微球为填充了光敏氰基化合物的醛基感光微球。
[0025] 较佳地，所述的发光微球为填充了稀土螯合物的醛基发光微球。
[0026] 本发明第二方面提供了一种肌红蛋白快速检测的试剂盒，包括连接了活性分子发 光微球的第一试剂、主要成份为已标记生物素活性分子的第二试剂以及主要成份为感光微 球的第三试剂。
[0027] 采用本发明的肌红蛋白快速检测方法及相应的检测试剂盒，在均相条件下，将内 部带有染料的感光微球（纳米级）、标记生物素的活性分子以及包被有活性分子并且内部 带有发光化合物的发光微球（纳米级）的混合物作为试剂和检测样品混合。此时纳米感光 微球与标记生物素的活性分子形成连接物再和包被有活性分子的纳米发光微球可迅速有 效地捕捉待测样本中的靶分子，在近距离内，三者形成免疫夹心复合物。激发光照射后，纳 米感光微球中的染料（光敏氰基化合物）被诱导激活，并释放高能态的活性氧离子（单线 态氧）。该高能态的活性氧离子被近距离的纳米发光微球俘获，从而传递能量以激活所述发 光微球中的发光化合物（稀土螯合物）。数微秒后，发光微球中的发光化合物将释放出高能 级红光。用光子计数器测定这些高能级光子，并通过电脑将光子数换算为目标分子浓度，光 子数的多少即精确地反映了目标分子的浓度。而当样本不含靶分子时，无法在近距离形成 免疫夹心复合物，活性氧离子也无法传递至发光微球表面。活性氧离子在液相中迅速衰减， 检测时则无光能级红光产生。其采用全液相的反应模式，液态均相的模式使各测试间的一 致性更好，使产品具有更好的重复性与一致性。且免冲洗，避免反应中引入不必要的干扰物 及其它不确定因素，使得检测结果更为稳定。可以快速诊断领域引入独特的化学发光技术， 使整体检测性能更优。
【附图说明】
[0028] 图1为本发明肌红蛋白检测方法微球结合形成二聚体的原理图。
[0029] 图2为本发明肌红蛋白检测方法微球微粒未结合时的原理图。
[0030] 图3为本发明单线态氧随微粒距离衰减时的曲线图。
[0031] 图4为本发明实施例的检测结果与进口肌红蛋白试剂盒检测结果的平行比较图。
[0032] 图5为本发明实施例的肌红蛋白快速检测的试剂盒的结构图。
【具体实施方式】
[0033] 为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，下面对本发明的具体实施方法作进一 步说明。
[0034] 本实施例的检测方法的原理如图1?2所示，单线态氧随微粒距离衰减时的曲线 图如图3所示。
[0035] 在下述实施例中使用的原料、试剂、仪器来源如下：
[0036] 原料及试剂 厂家 发光微粒 PERKINELMER
[0037] 感光微粒 PERKINELMER Myo 抗体 HyTest 生物素 SIGMA NaBH3CN 国药 Gly 国药 碳酸钠 国药 碳酸氢钠 国药 Tris 国药 Proclin-300 国药 Twcen20 国药 BSA SlGMA HEPES 国药 NaCl 国药 EDTA-Na-2H20 囯药 Dcxlran 国药 TritronX-405 国药 MES 国药 仪器 型号 厂家 高速冷冻离心机 GL-20B 上海安亭 分析天平 BT224S Sartorius 超声波细胞粉碎仪 JY92-IIDN 宁波新芝 PH计 PHS-3E 上海精密仪器 全自动化学发光快速检测系统 Q-TEST-OOl 上海丰汇 缓冲液
[0038] NaHCO3溶液的配方：
[0039]
[0040] CB (pH9· 6)缓冲液（0· ΟδΜ)
【主权项】
1. 一种肌红蛋白快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤（1):将内部带有染料的纳米级的感光微球、包被有活性分子的发光微球以及已 标记生物素的活性分子以及待测样本混合，得到混合物； 步骤（2):对所述的混合物进行温育培养，具有免疫特性的各组分反应得到结合物； 步骤（3):采用激发光对所述的结合物进行照射后，所述的结合物发光，使用光子计数 器进行测定，得到检测数值。
2. 根据权利1所述的肌红蛋白快速检测方法，其特征在于，所述的活性分子为Myo抗
3. 根据权利1所述的肌红蛋白快速检测方法，其特征在于，所述的感光微球为填充了 光敏氰基化合物的醛基感光微球。
4. 根据权利1所述的肌红蛋白快速检测方法，其特征在于，所述的发光微球为填充了 稀土螯合物的醛基发光微球。
5. -种肌红蛋白快速检测的试剂盒，其特征在于，包括连接了活性分子发光微球的第 一试剂、主要成份为已标记生物素活性分子的第二试剂以及主要成份为感光微球的第三试 剂。
【专利摘要】本发明涉及一种肌红蛋白快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)：将内部带有染料的纳米级的感光微球、包被有活性分子的发光微球以及已标记生物素的活性分子以及待测样本混合，得到混合物；步骤(2)：对所述的混合物进行温育培养，具有免疫特性的各组分反应得到结合物；步骤(3)：采用激发光对所述的结合物进行照射后，所述的结合物发光，使用光子计数器进行测定，得到检测数值。本发明还提供了一种肌红蛋白快速检测试剂盒。采用本发明的肌红蛋白快速检测方法及相应的检测试剂盒，检测结果稳定，准确率高、成本低，灵敏度高，精密性好，检测范围宽、适用临床推广。
【IPC分类】G01N33-72, G01N33-542
【公开号】CN104597257
【申请号】CN201510057329
【发明人】张伟, 卫君超, 葛望舒, 郑东
【申请人】上海丰汇医学科技股份有限公司
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年2月4日