一种肌红蛋白检测试剂及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种肌红蛋白检测试剂，其由试剂一和试剂二配合而成，其中，所述试剂一和试剂二的体积比为5∶1；所述试剂一中包括：20～50mmol/L的缓冲液、2％w/v的促凝剂、2％w/v的BSA、0.1％～0.5％w/v的防腐剂；所述试剂二中包括：0.1％～0.5％w/v标记有抗人MYO抗体的胶体金颗粒、2％～5％w/v的稳定剂、20～50mmol/L的缓冲液、0.1％～0.5％w/v的防腐剂；所述标记有抗人MYO抗体的胶体金颗粒的直径为60nm～90nm。本发明具有分析灵敏度高，检测线性范围大，使用方便且检测快速等诸多优点。
【专利说明】-种肌红蛋白检测试剂及其制备方法 【【技术领域】】
[0001] 本发明涉及一种肌红蛋白检测试剂及其制备方法，具体涉及一种用于检测血清或 血浆中MYO的匀相溶胶颗粒型MYO免疫测定试剂及其制备方法，属于医疗器械体外诊断试 剂领域。 【【背景技术】】
[0002] 肌红蛋白（Myoglobin，MY0)是一种氧结合血红素蛋白，主要分布于心肌和骨骼肌 组织。1960年由Kendrew用X线衍射法阐明，这是世界上第一个被描述的蛋白质三级结构。 在急性心肌损伤时，MYO最先被释放入血液中，在症状出现约2?3小时后，血中MYO可超 出正常上限，9?12小时达到峰值，24?36小时后恢复正常。对于怀疑ACS的病人建议连 续采样测定，因为症状出现和蛋白标志物释放到血液之间有一段延迟。在ACS早期诊断和 监测的临床效用已有大量文献报告，MYO阴性有助于排除心梗。
[0003] 测定血清肌红蛋白肌红蛋白可作为急性心肌梗死（AMI)诊断的早期最灵敏的指 标。但特异性差，骨骼肌损伤、创伤、肾功能衰竭等疾病，都可导致其升高。MYO阳性虽不能 确诊AMI，但可用于早期排除AMI诊断的重要指标，如MYO阴性，则基本排除心肌梗死，还可 用于再梗死的诊断，结合临床，如MYO重新升高，应考虑为再梗死或者梗死延展。 【
【发明内容】
】
[0004] 为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种分析灵敏度高，检测线性范围大，使 用方便且检测快速的基于胶体金匀相免疫法的肌红蛋白检测试剂。
[0005] 本发明的第二目的在于提供一种肌红蛋白检测试剂的制备方法。
[0006] 为实现上述第一目的，本发明采取的技术方案为：一种肌红蛋白检测试剂，其由试 剂一和试剂二配合而成，其中，所述试剂一和试剂二的体积比为5 : 1;所述试剂一中包括： 20?50mmol/L的缓冲液、2% w/v的促凝剂、2% w/v的BSA、0. 1%?0? 5% w/v的防腐剂； 所述试剂二中包括：〇. 1 %?〇. 5% w/v标记有抗人MYO抗体的胶体金颗粒、2%?5% w/v 的稳定剂、20?50mmol/L的缓冲液、0. 1%?0. 5% w/v的防腐剂；所述标记有抗人MYO抗 体的胶体金颗粒的直径为60nm?90nm。
[0007] 本发明的肌红蛋白检测试剂进一步为：所述试剂一和试剂二中的缓冲液具体为含 有0. 5%?5. 0% w/vBSA的Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸盐缓冲液或甘氨酸缓冲 液中的一种或几种。
[0008] 本发明的肌红蛋白检测试剂进一步为：所述试剂一、试剂二的pH值为7. 0?9. 0。
[0009] 本发明的肌红蛋白检测试剂进一步为：所述BSA浓度为1% w/v，试剂一、试剂二的 pH 值为 8. 0±0. 2。
[0010] 本发明的肌红蛋白检测试剂进一步为：所述试剂一中的促凝剂为PEG6000或 Brij-35中的至少任一种。
[0011] 本发明的肌红蛋白检测试剂进一步为：所述试剂二中的胶体金颗粒直径为 75nm ?85nm，颗粒含量为 0? 08 ?0? 8mg/mL。
[0012] 本发明的肌红蛋白检测试剂进一步为：所述胶体金颗粒含量为0. 4mg/mL。
[0013] 本发明的肌红蛋白检测试剂还为：所述标记有抗人MYO抗体为具有不同免疫活性 位点多个克隆株单抗的混合物。
[0014] 为实现上述第二目的，本发明采取的技术方案为：一种肌红蛋白检测试剂的制备 方法，其包括如下步骤：
[0015] 1)，将促凝剂、BSA和防腐剂加入到缓冲液，制得试剂一；
[0016] 2)，将氯金酸与柠檬酸三钠按照质量比I : 1加热煮沸制得胶体金溶液；将MYO抗 体加入到胶体金溶液中，并加入稳定剂、缓冲液、防腐剂，制得试剂二；其中，配置氯金酸与 柠檬酸三钠溶液时，使用〇. 2 ii m滤膜过滤；
[0017] 3)，将试剂一和试剂二按照5 : 1的体积比配合使用，即得肌红蛋白检测试剂。
[0018] 为实现上述第二目的，本发明采取的另一技术方案为：一种肌红蛋白检测试剂的 制备方法，其包括如下步骤：
[0019] (一），胶体金颗粒的制备
[0020] 1)将玻璃容器先用洗洁剂洗涤并用流水冲洗干净，然后用硅化试剂浸泡过夜，对 所用金属器皿的内表面做硅化处理，再用蒸馏水冲洗干净，备用；
[0021] 2)配制1 % (w/v)氯金酸和1 % (w/v)柠檬酸三钠溶液，使用0. 2 i! m滤膜过滤；
[0022] 3)在清洗干净的IOOOml圆底烧瓶中放入磁力搅拌子1枚，加入IOOOml超纯水；
[0023] 4)加入浓度为1 % (w/v)氯金酸，600rpm高速搅拌，并加热至溶液沸腾，然后将浓 度为1 %柠檬酸钠溶液快速加入到烧瓶中，保持加热和搅拌l〇min，溶液颜色先变黑色，然 后逐渐变紫红色；
[0024] 5)冷却：关闭加热开关并继续搅拌lOmin，然后停止搅拌冷却至室温，用超纯水恢 复到原体积；
[0025] (二），试剂一的制备
[0026] 将 Tris-HCl 缓冲液、0? 9 % NaCl (w/v)、2 % BSA(w/v)、0? 1 % NaN3 (w/v)、0? 05 % Tween20(w/v)混合，并根据Tris的质量控制缓冲液的浓度，根据HCl的使用量来调整缓冲 液的pH值；
[0027](三），标记有抗人MYO抗体的胶体金颗粒的制备
[0028] 取1毫升制备好的胶体金液体加入到1. 5毫升的离心管内；
[0029] 用10%的碳酸钾溶液将离心管内的胶体金溶液调至pH9?10之间；
[0030] 将抗体加到上述的离心管中，震荡30分钟；
[0031] 向上述溶液中加入IOOuL 10%的NaCl溶液，混匀，静置2h后观察各管是否有颜 色改变或者沉淀析出，当无颜色改变和无沉淀析出表明加入的抗体分子小于蛋白最大需求 量；
[0032] 将500ml胶体金溶液加入三角瓶中，边搅拌边用10 %的碳酸钾调整溶液的pH值至 9?10,并用pH试纸检测调整过程；
[0033] 将确定的抗体用量加入到上述溶液中，继续搅拌30分钟，超滤收集标记物；
[0034](四），试剂二的制备
[0035]将 Tris-HCl 缓冲液、0? 9 % (w/v)NaCl、2 % (w/v)BSA、0. 1 % (w/v)NaN3、0. 05 % (w/v)Tween20,5% (w/v)鹿糖或海藻糖，2% (w/v)甘氨酸，2% (w/v)PEG6000 以及步骤 (三）的标记物相混合制得试剂二；
[0036] (五），将试剂一和试剂二按照5 : 1的体积比配合使用，即得肌红蛋白检测试剂。
[0037] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0038] 1.本发明利用胶体金匀相颗粒特性，将特定的MYO抗体标记于胶体金颗粒表面， 当检测系统或检测环境中存在MYO时，胶体金颗粒表面的抗体即将与之对应的抗原捕获， 并形成抗原-抗体复合物，进而造成局部胶体金颗粒的聚合或堆积，使胶体金匀相试剂透 光光谱由红色向蓝色光谱移动，这种移动主要反应为540nm处吸光度的降低和660nm处吸 光度的升高，从而达到定量检测检体中MYO抗原的目的，同时避免了同类检测项目乳胶增 强免疫比浊法试剂在反应后产生胶乳微球交联物吸附比色杯不易清洗的缺点。
[0039] 2.本发明可用于检测血清或血浆中MO含量，适用于临床检测过程中使用的分光 光度计、半自动生化分析仪和全自动生化分析仪等仪器。
[0040] 3.本发明检测MO的灵敏度可以达到5ng/mL，检测线性范围达5?300ng/mL，具 有高分析灵敏度，高特异性等特点。 【【专利附图】
【附图说明】】
[0041] 图1是为不同颗粒大小的胶体金标记物校准曲线图。
[0042] 图2是本发明试剂与市售相关试剂分析线性比较图。 【【具体实施方式】】
[0043] 首先，需要说明的是，本发明中涉及的重量体积比记为"w/v"，单位为"g/mL"。
[0044] 本发明为一种肌红蛋白检测试剂，其由试剂I和试剂II混合而成，其中，所述试剂 I和试剂II的体积比为5 : 1。
[0045] 所述试剂I中包括：20?50mmol/L的缓冲液、2% w/v的促凝剂、2% w/v的BSA、 0. 1 %?0. 5% w/v的防腐剂。其中，所述试剂I的缓冲液具体为含有0. 5%?5. 0% w/vBSA 的Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸盐缓冲液或甘氨酸缓冲液中的一种或几种。所述 试剂I的pH值为7. O?9.0,优选的pH值为8. 0±0. 2。所述BSA浓度为1 % w/v。所述促 凝剂为PEG6000或Brij-35中的至少任一种。
[0046] 所述试剂II中包括：0. 1%?0. 5% w/v标记有抗人MYO抗体的胶体金颗粒、2%? 5% w/v的稳定剂、20?50mm01/L的缓冲液、0. 1%?0. 5% w/v的防腐剂。其中，所述标记 有抗人MYO抗体的胶体金颗粒的直径为60nm?90nm。所述试剂II的缓冲液具体为含有 0. 5%?5. O% w/vBSA的Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸盐缓冲液或甘氨酸缓冲液 中的一种或几种。所述试剂II的pH值为7. O?9.0,优选的pH值为8. 0±0. 2。优先的胶 体金颗粒直径为75nm?85nm，颗粒不宜过小，否则会造成反应速度变慢；颗粒也不宜过大， 会造成标记物聚集沉降进一步影响测定结果。所述胶体金颗粒颗粒含量为〇. 08?0. 8mg/ mL，优先的颗粒含量为0. 4mg/mL。所述标记有抗人MYO抗体为多抗或具有不同免疫活性位 点多个克隆株单抗的混合物。
[0047] 所述肌红蛋白检测试剂的制备方法如下：
[0048] 1)，将促凝剂、BSA和防腐剂加入到缓冲液，制得试剂I ;
[0049] 2)，将氯金酸与柠檬酸三钠按照质量比I : 1加热煮沸制得胶体金溶液；将MYO抗 体加入到胶体金溶液中，并加入稳定剂、缓冲液、防腐剂，制得试剂II ;其中，配置氯金酸与 柠檬酸三钠溶液时，使用〇. 2 ii m滤膜过滤；
[0050] 3)，将试剂I和试剂II按照5 : 1的体积比配合使用，即得肌红蛋白检测试剂。
[0051] 以下为本发明的肌红蛋白检测试剂的具体实施例。
[0052] 实施例一
[0053] 胶体金颗粒的制备（以下所有操作需在高洁净度无尘空间内完成）
[0054] 1)准备工作：所有用到的玻璃容器先用洗洁剂洗涤并用流水冲洗干净，然后用硅 化试剂浸泡过夜，对所以制金器皿的内表面做硅化处理，再用蒸馏水冲洗干净，备用；
[0055] 2)配制1 % (w/v)氯金酸和1 % (w/v)柠檬酸钠溶液，使用0. 2 m滤膜过滤；
[0056] 3)在清洗干净的IOOOml圆底烧瓶中放入磁力搅拌子1枚，加入IOOOml超纯水；
[0057] 4)加入一定体积浓度为1% (w/v)氯金酸，600rpm左右高速搅拌，并加热至溶液沸 腾，然后迅速将一定体积浓度为1 %柠檬酸钠溶液快速加入到烧瓶中，保持加热和剧烈搅拌 lOmin，溶液颜色先变黑色，然后逐渐变紫红色；
[0058] 5)冷却：关闭加热开关并继续搅拌lOmin，然后停止搅拌冷却至室温，用超纯水恢 复到原体积；
[0059] 6)不同粒径的胶体金颗粒可根据加入氯金酸和柠檬酸钠的比例进行控制，最终以 电子粒度仪检测IOmL胶体金溶液，以粒度仪显示结果为金颗粒的粒径结果使用。
[0060] 实施例二
[0061] 试剂一的制备
[0062] 试剂一的配方如下：!'1^-11(：1缓冲液、0.9%恥(：1^八）、2%85六^八）、0.1% NaN3(w/v)、0. 05% Tween20(w/v)，可根据Tris的质量控制缓冲液的浓度，根据HCl的使用 量来调整缓冲液的pH值。
[0063] 实施例三
[0064] 标记物的制备
[0065] 取1毫升制备好的胶体金液体加入到1. 5毫升的离心管内；
[0066] 用10%的碳酸钾溶液将离心管内的胶体金溶液调至pH8. O?10. O之间；
[0067] 将一定量抗体到上述的离心管中，震荡30分钟；
[0068] 向上述溶液中加入IOOuL 10%的NaCl溶液，混匀，静置2h后观察各管是否有颜 色改变或者沉淀析出，当无颜色改变和无沉淀析出表明加入的抗体分子小于蛋白最大需求 量；
[0069] 将500ml胶体金溶液加入三角瓶中，边搅拌边用10 %的碳酸钾调整溶液的pH值至 8. 0?10. 0,并用精密pH试纸检测调整过程；
[0070] 按所述的方法将确定的抗体用量加入到上述溶液中，继续搅拌30分钟，超滤收集 标记物。
[0071] 实施例四
[0072] 试剂二的制备
[0073] 试剂二缓冲液中溶解的生物大分子和化学物质为Tris-HCl缓冲液、0? 9% (w/v) NaCl、2% (w/^BSA'O.l% (w/^NaNS'O.OS% (w/^Tweer^CU% (w/v)鹿糖或海藻糖，2% (w/v)甘氨酸，2% (w/v)PEG6000,本部分缓冲液配制同试剂一保持一致，再次不再赘述。
[0074] 将配制好的试剂儿缓冲溶液同超滤收集得到的标记物相混合，最终控制标记物金 颗粒浓度为〇. 4mg/mL即可。
[0075] 实施例五
[0076] 校准品的制备
[0077] 将市售的人源MYO蛋白纯品用2% (w/v)BSA溶液溶解或稀释，制得1200ng/mL校 准品，使用时根据所需要浓度梯度用〇. 9% (w/v)NaCl稀释即可。
[0078] 实施例六
[0079] 不同颗粒度胶体金颗粒的选择
[0080] 根据以上实施例中胶体金颗粒的制备不同粒径的胶体金颗粒完成标记制得试剂 二，选择同一缓冲液浓度和PH进行实验。
[0081] 实验方法：
[0082] 将校准品、试剂一和试剂二按照体积比为3 : 250 : 50依次混合，37°C下充分反 应。
[0083] 在7180全自动生化分析仪上记录540 ± IOnm处吸光度值。
[0084] 比较不同颗粒大小胶体金标记物校准曲线最终确定最佳颗粒大小。
[0085] 根据校准曲线（附图1)判断选择75nm?85nm范围的金颗粒较为合适，大颗粒分 析灵敏度较好但是易产生HOOK效应不利于检测，而小颗粒在高值区的分析能力却明显不 如75nm?85nm颗粒。
[0086] 本发明试剂与市售相关项目试剂分析线性比较
[0087] 试验方法：以一临床高值样本为例，将其倍比稀释如下梯度，分别用对照试剂和本 发明试剂检测，并拟合其线性，结果如附图2所示。
[0088] 表1线性数据结果
【权利要求】
1. 一种肌红蛋白检测试剂，其特征在于：由试剂一和试剂二配合而成，其中，所述试剂 一和试剂二的体积比为5 : 1 ;所述试剂一中包括：20?50mmol/L的缓冲液、2% w/v的促 凝剂、2% w/v的BSA、0. 1 %?0? 5% w/v的防腐剂；所述试剂二中包括：0? 1 %?0? 5% w/ v标记有抗人MYO抗体的胶体金颗粒、2%?5% w/v的稳定剂、20?50mmol/L的缓冲液、 0. 1 %?0. 5 % w/v的防腐剂；所述标记有抗人MYO抗体的胶体金颗粒的直径为60nm? 90nm。
2. 如权利要求1所述的肌红蛋白检测试剂，其特征在于：所述试剂一和试剂二中的缓 冲液具体为含有〇. 5%?5. 0% w/vBSA的Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸盐缓冲液 或甘氨酸缓冲液中的一种或几种。
3. 如权利要求2所述的肌红蛋白检测试剂，其特征在于：所述试剂一、试剂二的pH值 为 7. 0 ?9. 0。
4. 如权利要求2所述的肌红蛋白检测试剂，其特征在于：所述BSA浓度为1 % w/v，试 剂一、试剂二的pH值为8. 0±0. 2。
5. 如权利要求1所述的肌红蛋白检测试剂，其特征在于：所述试剂一中的促凝剂为 PEG6000或&'ij-35中的至少任一种。
6. 如权利要求1所述的肌红蛋白检测试剂，其特征在于：所述试剂二中的胶体金颗粒 直径为75nm?85nm，颗粒含量为0? 08?0? 8mg/mL。
7. 如权利要求6所述的肌红蛋白检测试剂，其特征在于：所述胶体金颗粒含量为 0. 4mg/mT,n
8. 如权利要求1所述的肌红蛋白检测试剂，其特征在于：所述标记有抗人MYO抗体为 具有不同免疫活性位点多个克隆株单抗的混合物。
9. 一种肌红蛋白检测试剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤： 1) ，将促凝剂、BSA和防腐剂加入到缓冲液，制得试剂一； 2) ，将氯金酸与柠檬酸三钠按照质量比1 : 1加热煮沸制得胶体金溶液；将MYO抗体加 入到胶体金溶液中，并加入稳定剂、缓冲液、防腐剂，制得试剂二；其中，配置氯金酸与柠檬 酸三钠溶液时，使用0. 2 ii m滤膜过滤； 3) ，将试剂一和试剂二按照5 : 1的体积比配合使用，即得肌红蛋白检测试剂。
10. -种肌红蛋白检测试剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤： (一） ，胶体金颗粒的制备 1) 将玻璃容器先用洗洁剂洗涤并用流水冲洗干净，然后用硅化试剂浸泡过夜，对所用 金属器皿的内表面做硅化处理，再用蒸馏水冲洗干净，备用； 2) 配制1% (w/v)氯金酸和1% (w/v)柠檬酸三钠溶液，使用0. 2 滤膜过滤； 3) 在清洗干净的1000ml圆底烧瓶中放入磁力搅拌子1枚，加1000ml超纯水； 4) 加入浓度为1% (w/v)氯金酸，600rpm高速搅拌，并加热至溶液沸腾，然后将浓度为 1 %柠檬酸钠溶液快速加入到烧瓶中，保持加热和搅拌l〇min，溶液颜色先变黑色，然后逐渐 变紫红色； 5) 冷却：关闭加热开关并继续搅拌lOmin，然后停止搅拌冷却至室温，用超纯水恢复到 原体积； (二） ，试剂一的制备 将 Tris-HCl 缓冲液、0.9 % NaCl(w/v)、2 % BSA(w/v)、0. 1 % NaN3(w/v)、0.05 % Tween20(w/v)混合，并根据Tris的质量控制缓冲液的浓度，根据HC1的使用量来调整缓冲 液的pH值； (三） ，标记有抗人MYO抗体的胶体金颗粒的制备 取1毫升制备好的胶体金液体加入到1. 5毫升的离心管内； 用10%的碳酸钾溶液将离心管内的胶体金溶液调至p!19?10之间； 将抗体加到上述的离心管中，震荡30分钟； 向上述溶液中加入l〇〇uL 10 %的NaCl溶液，混匀，静置2h后观察各管是否有颜色改变 或者沉淀析出，当无颜色改变和无沉淀析出表明加入的抗体分子小于蛋白最大需求量； 将500ml胶体金溶液加入三角瓶中，边搅拌边用10 %的碳酸钾调整溶液的pH值至9? 10,并用pH试纸检测调整过程； 将确定的抗体用量加入到上述溶液中，继续搅拌30分钟，超滤收集标记物； (四） ，试剂二的制备 将 Tris-HCl 缓冲液、0.9% (w/v)NaCl、2% (w/v)BSA、0.1% (w/v)NaN3、0.05% (w/v) Tween20,5% (w/v)鹿糖或海藻糖,2% (w/v)甘氨酸,2% (w/v)PEG6000以及步骤（三）的 标记物相混合制得试剂二； (五） ，将试剂一和试剂二按照5 : 1的体积比配合使用，即得肌红蛋白检测试剂。
【文档编号】G01N33/72GK104391124SQ201410648653
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月17日 优先权日:2014年11月17日
【发明者】王会中 申请人:中国人民解放军第三0五医院