专利名称：以黄颡鱼β-肌动蛋白启动子和生长激素基因为元件构建的黄颡鱼本源转基因载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及黄颡鱼β-肌动蛋白的启动子和生长激素基因以及3’-非翻译区序列的克隆、重组及启动子活性分析和应用，并以此为元件构建黄颡鱼本源的转基因载体，属于基因工程领域。
背景技术：
黄颡鱼(Pseudobagrus fulvidraco Richardson)俗称昂子鱼,黄蜡丁。隶属鲶形目，鮑科，黄颡鱼属。该鱼属温水性鱼类，营底栖生活，个体通常在30 100克左右，广泛分布于我国内陆水域中。其体表光滑无磷，肉质细嫩，无肌间刺，蛋白质含量15. 37%，氨基酸总量14. 19%,必需氨基酸指数达73. 34，赖氨酸含量较高，味道鲜美，具有很高的营养价值，且其肉味甘、平，有祛风、利尿之功效，深受消费者欢迎。从水产经济角度来说，黄颡鱼是一种优质高档鱼类，在国内外拥有成熟的消费市场。近年来，其平均价格一直稳中有升，一般在20 40元/千克，仅南京市场年销售量就达70万公斤以上，而苏锡常及上海销售量更大。在国际市场上，黄颡鱼深受东南亚各国消费者喜爱，尤其是韩国每年要从我国进口数百吨黄颡鱼商品鱼，是出口创汇的优良品种。然而，目前市场上销售的黄颡鱼主要来自于野生资源的捕捞，由于该鱼生长速度慢、个体规格偏小，通常要两年才能性成熟，加上该鱼产卵量低，市场供应的商品鱼不仅数量少且个体小(多为50克左右)，远远不能满足市场的需求。为解决这些问题，国内学者进行了许多有益的尝试，主要集中在人繁驯养、品种改良和养殖环境的优化方面，但从国内外水产动物研究的趋势来看，从分子水平对鱼类基因组进行改造，定向培育新型养殖品种是最有潜力的一种方法；更具重要意义的是转生长激素基因鱼饵料系数低，养殖周期短，当年即可上市，能显著降低鱼类养殖成本。目前转生长激素基因鱼在加速鱼体生长，增大鱼体个头，提高饵料的利用率等方面都显示了良好的效果。在鱼类基因工程育种中，采用“全鱼”技术，即所转基因全部来自于受体鱼自身品系，制作成的大规格的转基因鱼，被认为是确保转基因在生物安全，生态环境安全，食品安全及消费者认可等方面因素后的最佳选择。目前欧洲许多国家已经批准转基因鱼在饲料上的应用，我国的转基因鲤鱼也制作成功。但转基因黄颡鱼的研发尚未有文献和研究涉及，因此构建黄颡鱼本源转基因载体具有广泛的经济效益前景。
发明内容
本发明的目的在于提供黄颡鱼肌动蛋白的启动子、生长激素基因及其3’ -非翻译区序列以及以此为元件构建的黄颡鱼本源生长激素转基因载体。本发明的目的通过如下技术方案实现1.黄颡鱼β-肌动蛋白启动子的克隆(1)本发明根据GenBank上已有的鱼类β -肌动蛋白启动子序列，在同源保守区内设计一条上游引物P1，其位置在CAAT box附近。之后再将其外显子进行序列比对，在 β-肌动蛋白的3号外显子的保守区内设计一条下游引物P2，通过这对引物来克隆黄颡鱼的β-肌动蛋白启动子。(2)提取黄颡鱼脑垂体组织的基因组DNA，并以此为模板，用Ρ1，Ρ2为引物，扩增出黄颡鱼的β-肌动蛋白启动子序列。该启动子序列包含β-肌动蛋白基因表达调控序列、 外显子1以及部分外显子2的序列，全长为1756bp。(3)将PCR扩增的β -肌动蛋白启动子序列克隆进pMD 18-T载体中，命名为 pActinproexon—To(4)为了证明黄颡鱼β-肌动蛋白启动子的活性，将β-肌动蛋白启动子插入到黄色荧光蛋白载体中，看能否驱动荧光蛋白的表达。通过转基因斑马鱼的活体实验，证明了 β-肌动蛋白启动子能够有效地驱动黄色荧光蛋白在斑马鱼体内的广泛表达。2.黄颡鱼生长激素基因及其3’ -非翻译区序列的克隆(1)参照GenBank中已发表的鱼类生长激素基因cDNA序列，在同源保守区设计一对兼并引物(P3和P4)扩增该基因的开放阅读框(ORF)序列。(2)提取黄颡鱼的脑组织的总RNA并通过逆转录得到用于PCR反应的cDNA模板。 随后用P3，P4为引物，扩增出黄颡鱼生长激素基因的开放阅读框序列，即蛋白质编码序列。 该序列全长全长60;3bp，编码200个氨基酸。(3)将PCR扩增的生长激素开放阅读框序列序列克隆进pMDIS-T载体中，命名为 pGHORF-T。(4)为了通过3’ -RACE反应获得黄颡鱼生长激素基因的3’ -非翻译区序列 (3’-UTR)，在终止密码子上游IOObp处设计引物P5。另一引物为含有接头序列的通用引物 UPM。(5)提取黄颡鱼的脑组织的mRNA并通过逆转录得到用于PCR反应的cDNA模板。随后用P5，UPM为引物，扩增出黄颡鱼生长激素基因3’ -非翻译区序列。该序列全长687bp。(6)将PCR扩增的生长激素基因3’ -非翻译区序列克隆进pMDIS-T载体中，命名为 pGH3-UTR-T。(7)由于开放阅读框序列和3’ -非翻译区序列之间存在160bp的重叠区，通过 OverlappingPCR法介导黄颡鱼生长激素基因开放阅读框序列和3’-非翻译区序列的重组。 根据已获得黄颡鱼cDNA序列，设计了 2对Overlapping PCR引物P6、P7和P8、P9。(8)以重组质粒pGH ORF-T为模板，用P6和P7为引物，进行第一轮PCR扩增；以重组质粒PGH 3-UTR-T为模板，用P8和P9为引物，进行第一轮PCR扩增。之后以上述两对引物扩增得到的PCR产物为共同模板，以P6和P9为引物，进行第二轮PCR扩增，获得包含黄颡鱼生长激素基因开放阅读框和3’-非翻译区序列的生长激素cDNA。该序列全长1088bp。(9)将Overlapping PCR重组得到的黄颡鱼生长激素cDNA克隆进pMD18_T载体中,命名为pGH-cDNA-T。3.黄颡鱼本源生长激素转基因载体的构建(1)为使整个转基因表达载体从启动子到加尾信号之间的表达相关序列全部为黄颡鱼的本源序列，在通过设计引物PlO JfBamH I位点引入到β-肌动蛋白启动子序列的 5’ -端。以Ρ10、Ρ11为引物，以pActin proexon-T为模板，PCR扩增得到引入了 BamH I位点的β-肌动蛋白启动子片段，并将其克隆到PMD18-T载体中，命名为pActin Bproexon-T0(2)通过 BamH I 和 Nco I 双酶切重组质粒 pActin Bproexon-T 和 pGH-cDNA-T，分别得到黄颡鱼的β-肌动蛋白启动子片段和生长激素cDNA片段(包含开放阅读框和3’-非翻译区序列)。随后将此两个元件通过BamH I位点克隆到pBluescript-SK质粒中，通过酶切筛选正确的阳性克隆。该本源转基因元件通过黄颡鱼自身的β-肌动蛋白启动子来驱动自身的生长激素基因的表达。本发明的优点本发明从黄颡鱼基因组DNA中获得了黄颡鱼β-肌动蛋白基因启动子序列，扩充了转基因鱼类的启动子种类；本发明从黄颡鱼总RNA中获得了黄颡鱼生长激素基因开放阅读框及3’ -非翻译区序列，扩充了转基因鱼类的基因库；本发明构建了黄颡鱼β -肌动蛋白基因启动子驱动的黄色荧光蛋白表达载体，并成功在转基因斑马鱼内稳定表达，该重组载体对鱼类转基因研究具有极大的生物学和生物工程学意义；本发明得到的黄颡鱼本源转基因载体在应用于转基因黄颡鱼育种生产时不含有任何菌源核苷酸，其显微注射基因片段是一种全黄颡鱼本源基因片段。
图1.黄颡鱼β -肌动蛋白启动子的PCR电泳图。泳道1为DNA Marker,泳道2为 PCR结果，条带大小为1756bp。图2.用黄颡鱼β -肌动蛋白启动子驱动的黄色荧光表达的转基因斑马鱼幼体96 小时的荧光显微镜照片。图3.黄颡鱼生长激素基因开放阅读框的PCR电泳图。泳道1为DNA Marker,泳道 2为PCR结果，条带大小为60;3bp。图4.黄颡鱼生长激素基因3，-RACE的PCR电泳图。泳道1为DNA Marker，泳道 2为PCR结果，条带大小为687bp。图5.黄颡鱼生长激素基因overlapping PCR电泳图。图A为开放阅读框的PCR 电泳图，泳道1为DNAMarker，泳道2为PCR结果，条带大小为60;3bp ；图B为3’ -非翻译区序列PCR电泳图。泳道1为DNAMarker，泳道2为PCR结果，条带大小为687bp ；图C为 overlappingPCR电泳图，泳道1为PCR结果，条带大小为lO^bp，泳道2为DNAMarker。图6.黄颡鱼本源转基因载体pActin promoter-GH的酶切鉴定图。泳道1为DNA Marker,泳道2为pActin promoter-GH质粒的电泳条带，泳道3为BamH I和Nco I双酶切的结果电泳条带，泳道4为BamH I酶切的电泳条带。图7.黄颡鱼本源转基因载体pActin promoter-GH的示意图。
具体实施例方式实施例1黄颡鱼β -肌动蛋白启动子的克隆1.引物设计将GenBank上已发表的stingcatfish和tilapia等鱼类的β -肌动蛋白的启动子序列进行序列比对，在同源保守区内设计一条上游引物Ρ1，其位置在CAAT box附近。之后再将其外显子进行序列比对，在肌动蛋白的3号外显子的保守区内设计一条下游引物Ρ2，通过这对引物来克隆黄颡鱼的β-肌动蛋白启动子。
Pl 5 ‘-GTGWGTGACGCMGGACCAATC-3，(W = A+T, M = T+C)P2 5 ‘-CCATXTCXTCCCAGTTGGTYACAAT-3，(X = A+G, Y = G+C)2.基因组DNA提取取成体黄颡鱼脑垂体剪碎于1. 5ml已灭菌的离心管中，加入一定量(m/v = 1/10，以IOml每g组织为宜)的消化缓冲液(IOmM Tris-Cl, pH 8.0,1% SDS，100 μ g/ml蛋白酶K)后放置37°C水浴锅中不时轻微振荡消化5小时，到组织块消化完全；然后加入相等体积的苯酚氯仿异戊醇05 24 1)提取两次，将水相转移至干净的1. 5ml已灭菌的离心管中，并加入3M氯化钠至终浓度为0. 3M ；再加入2. 5倍体积的无水乙醇，轻轻摇动离心管，直至溶液完全融合，可以观察到白色絮状沉淀；将其以3000g，离心 10分钟；用70%的乙醇洗涤沉淀后在室温下干燥，并在100 μ 1 TEdOmM Tris-Cl,pH 8.0， ImM EDTA)中溶解；溶解后加入十分之一体积3M醋酸钠(pH = 5. 6)，加入(无核酸酶)RNase A至浓度100 μ g/ml ；37°C放置5分钟，加入10% SDS至最终浓度0. 2%;再加入相等体积的苯酚氯仿异戊醇05 24 1)提取两次，将水相转移至干净的1. 5ml已灭菌的离心管中，并加入3M氯化钠至终浓度为0. 3M ；再加入2. 5倍体积的无水乙醇，轻轻摇动离心管， 直至溶液完全融合，可以观察到白色絮状沉淀，1200g离心10分钟，干燥，20 μ 1 IOmM TE中溶解，并保存-80°C待用。3.PCR扩增以上述基因组DNA为模板，用P1、P2扩增黄颡鱼β-肌动蛋白基因启动子，PCR反应体系如表1 表1. PCR反应体系
MilliQ H2O12.1μ1
10 X buffer (无 Mg2+) 2μ1 25mM Mg2+2μ1
5μΜΡ1Ιμ 5^mp2叫
5mM dNTP0.8μ1
rTaq 酶0.1 μ
基因组 DNAΙμ (200ng)
Total20μ PCR扩增反应条件95°C预变性时间5分钟，每个循环包括94°C变性1分钟，58°C 复性45秒，72°C延伸2分钟，循环30次，最后一个循环结束时72°C延伸10分钟。反应结束后取5 μ 1 PCR产物，0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果(图1)。4. PCR产物的T载体连接按Takara pMD18_T载体说明书进行PCR产物和pMD_18T 载体连接，体系如表2:表2 连接体系
权利要求
1.黄颡鱼β-肌动蛋白启动子，其核苷酸序列如SEQID NO. 1所示，其特征在于所述序列表中序列1的5’ -端1至1017位碱基为启动子区域。
2.黄颡鱼的生长激素基因及其3’-非翻译区，其核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。其特征在于所述序列表中序列2的5’ -端1至603位碱基为氨基酸编码区域；604至1088位碱基为3，-非翻译区序列；1070至1075位碱基为Poly A加尾信号。
3.含有权利要求1所述启动子的真核表达载体。
4.含有权利要求2所述基因的真核表达载体。
5.含有权利要求1所述启动子的重组微生物。
6.含有权利要求2所述基因的重组微生物。
7.权利要求1所述黄颡鱼肌动蛋白启动子在黄颡鱼基因育种中的应用。
8.权利要求2所述黄颡鱼生长激素在促进鱼类生长中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种黄颡鱼的β-肌动蛋白启动子、生长激素基因及其3’-非翻译区序列以及以此为元件构建的黄颡鱼本源转基因载体。本发明获得了黄颡鱼的β-肌动蛋白启动子序列以及外显子1和部分外显子2的序列，还获得了黄颡鱼生长激素基因的氨基酸编码序列和3’-非翻译区序列，并以获得的黄颡鱼β-肌动蛋白的启动子、生长激素编码基因以及3’-非翻译区为元件构建黄颡鱼本源生长激素转基因载体。本发明用黄颡鱼自身的β-肌动蛋白的启动子驱动其自身的生长激素基因表达的方法来构建转基因载体，能有效地避免转基因鱼所面临的生物安全性问题，对黄颡鱼基因育种与人工繁殖有重大的实际意义和应用前景。
文档编号C12N15/18GK102191270SQ20101011612
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月3日 优先权日2010年3月3日
发明者宋伟, 熊熙文, 赵庆顺 申请人:南京大学