专利名称：一株胸腺嘧啶营养缺陷型炭疽芽孢杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株胸腺嘧啶营养缺陷表型炭疽芽孢杆菌及其应用。
背景技术：
炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)是一种G+菌，它引起的炭疽是一种烈性传 染病，在我国列为乙类传染病，已经列入国家的计划免疫。现有炭疽疫苗A16R株仍保留有 大质粒PX01，具有一定的残留毒性。因此研究更加安全有效的新型炭疽杆菌疫苗就显得非 常有必要。菌体组分加保护性抗原的组合是目前广泛认可的一种炭疽疫苗的研究策略，而以 减毒炭疽杆菌作为宿主进行保护性抗原表达的研究也已有报道。但这种表达通常需要抗 生素提供抗性压力，不符合当今对疫苗类生物制品的要求。因此开以别的表达系统如染色 体_质粒平衡致死系统就显得很有意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株胸腺嘧啶营养缺陷菌株及其应用。本发明所提供的胸腺嘧啶营养缺陷菌株，是将炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)中的thyA基因和thyX基因灭活获得的菌株。所述thyA基因可具有自GENBANK的基因ID为2850789的5 ‘端第1_957位核苷 酸序列；所述thyX基因可具有自GENBANK的基因ID为2851295的5'端第1-774位核苷 酸序列。所述胸腺嘧啶营养缺陷菌株还经过去除构建过程中引入的抗生素标记。所述炭疽 芽孢杆菌(Bacillus anthracis)为减毒活疫苗，如减毒活疫苗B. anthracisAP422。上述技术方案使本发明的菌株具有无抗性标记的胸腺嘧啶营养缺陷型减毒炭疽 芽孢杆菌的特征。所述胸腺嘧啶营养缺陷菌株优选为炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis) AP425CGMCC Ns · 3405。炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)AP425 CGMCC Ns · 3405 是经 过同源重组对炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)负责胸腺嘧啶合成的关键酶胸腺嘧啶 合成酶基因(thyA)进行了敲除，然后再对胸腺嘧啶合成酶补充蛋白基因(thyX)进行敲除 并结合Cre-LoxP系统去除了抗性标记，通过大量筛选获得的无标记抗性，两个基因的联合 缺失胸腺嘧啶营养依赖的炭疽杆菌。所述炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis) AP425，已于2009年11月5日保藏于中 国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为中国北京市朝阳区大 屯路)，保藏号为CGMCC Na · 3405。构建上述胸腺嘧啶营养缺陷菌株的具体方法包括1.打靶质粒构建采用PCR的方法，从相应的模板中扩增得到thyA和thyX基因的上下游同源臂，以 及两端带有LoxP位点的壮观霉素抗性基因元件，这几部分DNA在T载体中连接成功得到打靶片段，该片段再与穿梭载体连接得到打靶载体。2. Cre重组酶表达质粒构建采用PCR的方法扩增得到淀粉酶启动子和Cre重组酶的编码基因，再顺次连入穿 梭载体就可以得到Cre重组酶表达载体。3. thyA基因的无痕敲除首先通过同源重组的方式，得到用壮观霉素抗性元件替代部分thyA基因序列的 重组菌。然后通过转入表达Cre重组酶的质粒，通过Cre重组酶识别spc元件两端的LoxP 位点，去除抗性标记，从而得到不含抗性标记的基因敲除菌株。4.thyX基因的敲除thyX基因的敲除与thyA基因所用的方法完全相同。本发明的胸腺嘧啶营养缺陷菌株可以用于构建蛋白表达系统，所述构建蛋白表达 系统为基于染色体-质粒平衡致死原理的外源蛋白表达系统。所述免疫制剂优选为灭活疫 苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗和基因工程疫苗。实验证明，本发明炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)AP425 CGMCC Ns · 3405 无 抗生素抗性标记，是胸腺嘧啶营养缺陷型的减毒炭疽芽孢杆菌，且该菌株能够形成芽孢。本 发明构建的菌株可作为宿主，构建平衡致死表达系统，进而研究相关的炭疽杆菌疫苗，为新 型疫苗的研究打下基础。
图1为pT-l0Xp::Spc酶切鉴定结果。图2为打靶质粒构建过程中获得的阳性克隆的酶切鉴定结果。图3为Cre重组酶表达质粒构建酶切鉴定结果。图4为thyA基因敲除的过程示意图。图5为thyA基因敲除的PCR鉴定筛选的结果。图6为PCR的方法筛选去除抗性基因的菌株的结果。图7为得到的thyX基因敲除株进行PCR鉴定的结果。图8为缺陷菌炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)AP425表型分析结果。图9为炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)AP425的芽孢形成能力分析结果。
具体实施例方式下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例1、无抗性标记的营养缺陷型减毒炭疽芽孢杆菌的获得1、打靶质粒构建根据文献报道的LoxP序列设计两个长引物IoxpF和LoxpR直接退火合成含两个 LoxP序列及一个Sal I位点的片段，将该片段连入pEASY-Tl载体(购自北京全式金生物技 术有限公司)得到新的载体pT-loxP。其中，引物IoxpF和LoxpR序列为IoxpF :CCGCGGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGTCGACATAACTTCGTATA(序列表中序列 1)
IoxpR :GAATTCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATGTCGACATAACTTC (序列表中序列2)。pSET4s (Daisuke Takamatsu, Makoto Osaki, and Tsutomu Sekizaki. Thermosensitive Suicide Vectors for Gene Replacement in Streptococcus suis. Plasmid，200，146，140-148，中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所已保存)为 模板，以引物spcF和spcR扩增出两端均为Sal I切点的spc抗性元件。该片段用Sal I 单切后纯化回收，再与同样经Sal I单切的质粒pT-loxP连接转化E. coli DH5 α，并在含壮 观霉素的LB平板上进行筛选，得到的阳性克隆即为连接正确的克隆，质粒双酶切鉴定结果如图1。图1中，泳道1为pT-loxp:: spc酶切结果，泳道M为分子量Marker。将鉴定表明 正确的重组质粒命名为pT-loxp: :spc。其中，引物spcF和spcR的序列为spcF :ACGCGTCGACGTAACAATCACTAGCC (序列表中序列 3)；spcR :ACGCGTCGACAGCTTATTTTCCTTG (序列表中序列 4)。再根据 GenBank 登录的 Bacillus anthracis sterne 株 thyA 序列，基因 ID 为 2850789，设计两对特异性引物thyAuF和thyAuR以及thyAdF和thyAdR，它们的序列如下所 示thyAuF :cgcggatccagtgaagaagtaccc (序列 表中序 列 5), thyAuR tccccgcggattaccgaaagtatag (序列表中序列 6)；thyAdF :ccggaattccatttaacattgcaag (序列表中序列 7) , thyAdR ccgctcgagaatctcatctataaac (序列表中序列 8)。以炭疽杆菌A16R株(炭疽芽孢杆菌A16R株无菌培养滤液的蛋白质组学分析董 梅，庄汉澜，王希良军事医学科学院院刊2009年2月第33卷第1期；由中国人民解放军 军事医学科学院生物工程研究所保存)基因组DNA为模板，分别扩增thyA基因上下游各约 500bp的同源臂。上游同源臂的扩增引物为thyAuF和thyAuR;下游同源臂的扩增引物为 thyAdF 禾口 thyAdR。将扩增得到的下游同源臂用EcoR I和Xhol I双酶切与经同样酶双酶切的质粒 pT-l0Xp::Spc连接后转化E.coli DH5 α，得到的克隆过夜培养后提质粒进行酶切鉴定，得 到重组质粒，将酶切和测序鉴定的连接正确的质粒命名为pT-loxp: spc-1。将上述扩增得 到的上游同源臂用BamH I和Sac II双酶切插入到pT-loxp: spc-1的相同酶切位点之间， 得到重组载体，将该重组质粒经双酶切鉴定和测序鉴定，将经鉴定表明连接正确的质粒命 名为 pT-thyA spc ο质粒pT-thyA: spc用BamH I和Xho I双酶切后回收2800bp目标片段(其 中包括上下游同源臂和壮观霉素抗性基因元件)，再与用Sal I和BamH I双酶切的质 粒 pMAD(Arnaud Μ, Chastanet A, and De' barbouille Μ. New vector for efficient allelicreplacement in naturally nontransformable, low-GC-content, gram-positive bacteria. ApplEnviron Microb，2004，70 (11) 6887 6891，中国人民解放军军事医学科 学院生物工程研究所已保存)连接，转化E.coli DH5 α，涂布于含Spc (壮观霉素，5 μ g/ mL)和X-gal(50yg/mL)的LB平板。平板上长出的蓝色菌落即为正确连接的克隆(质 粒pMAD能编码半乳糖苷酶)，重组质粒的酶切鉴定结果如图2所示。图2中，泳道1为 pMAD，泳道2为pMAD-thyA: :spc，泳道M为分子量Marker。将得到的重组质粒再电转化Ε. coliSCSllO。从SCSllO中提取质粒得到去甲基化的打靶用质粒，将经测序表明正确的质 粒命名为 pMAD-thyA: :spc。2、Cre重组酶表达质粒构建以枯草芽孢杆菌No. 168 (购自美国典型培养物保藏中心，简称ATCC，保藏编号 为ATCC No. 23857)为模板，利用引物amyrF和amyrR扩增得到淀粉酶启动子AmyRl,并 在两端分别引入BamH I和Hind III位点。将扩增回收的片段用BamH I和HindIII 酶双酶切处理后与经同样的内切酶双酶切的质粒PHY304连接后转化E. coli ToplO, 得到的重组质粒，酶切和测序鉴定，将鉴定正确的质粒命名为pHY-AmyR。然后以质粒 pBS185(购自GibcoBRL公司)为模板，以creF和creR为引物，扩增Cre重组酶基因， 通过引物序列在两端分别引入HindIII和Xho I位点。将PCR扩增得到的Cre重组酶 基因片段用HindIII和Xho I双酶切后与经过同样双酶切的质粒pHY-AmyR连接转化 E. coli ToplO，得到的重组质粒，酶切和测序鉴定，结果如图3所示，将鉴定正确质粒命名 为pHY-Cre。图3中，泳道1为pHY-AmyR，泳道2为pHY-Cre，泳道M为分子量Marker。 质粒pHY-Cre再转化E.C0li SCS110，最终得到可用于转化炭疽杆菌的去甲基化的质粒 pHY-Cre。上述引物序列为amyrF :GCGGATCCGACGACAGGGGGATTC(序列表中序列 9)，amyrR CCCAAGCTTTCTTGACTCCTTAT(序列表中序列 10) ； creF :CCCAAGCTTATGTCCAATTTACTG (序列表 中序列 11)，creR :CCGCTCGAGCTAATCGCCATCTTCC (序列表中序列 12)。3、thyA基因的无痕敲除thyA基因(具有自GENBANK的ID号为2850789的5 ‘端第1-957位核苷酸)敲 除的大致过程如图4所示。具体方法如下所述1)感受态的制备从_70°C保存的B. anthracis AP422 (CGMCC Na . 1569，专利菌株，发明人为本专利 发明人之一)(保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC Na . 1569 ；专利号为ZL200610007229. 3，授权公告号为CN 100362094C)菌种中划线分离单 菌落，接种于5mL BHIG(HBI培养基加0.5%甘油)培养基中，37°C过夜培养。将过夜培养物 按的比例接种到IOOmL新的BHIG培养基(3. 7%的脑心浸出物BHI加0.5%甘油)中， 37°C剧烈振荡培养。当0D_值达到0. 5-0. 6时(约2小时)，从摇床中取出，离心收集菌 体，用10%甘油洗三次，最后用1/10体积10%甘油重悬菌体，分装得到电转化感受态细胞。2)感受态细胞的转化每80 μ L感受态细胞加5 μ L (约1. 5 μ g)质粒pMAD-thyA: spc，混合后于0. 2cm 电击杯中冰浴5分钟，然后用Bio-Rad电转仪进行电转化，条件为2. 5kV、200Q和25 μ F。 电击完毕后立即加入ImL冰冷的LB培养基，30度孵育2. 5小时。分别取100和200 μ L涂 布于含红霉素(5 μ g/mL)和X-gal (50 μ g/mL)的LB平板上，30°C过夜培养。3)重组转化子的筛选挑取步骤2)获得的单个蓝色菌落，接种到5mL LB培养基中，30°C培养2小时，然后转到42°C培养2个小时.取5 μ L培养物梯度稀释，取10_2、10_3和10_4稀释液各100 μ L 涂布于含壮观霉素(50 μ g/mL)和X-gal (50 μ g/mL)的LB平板上，42 °C过夜培养。取于42°C培养生长出的白色菌落，取50个单菌落接种到含壮观霉素(100μ g/ml) 的LB培养基中，37°C培养过夜。
取过夜培养物5 μ L进行全菌PCR鉴定筛选，引物用thyAiF (位于thyA基因上游同源臂外侧和spcmR(位于壮观霉素基因内部)(thyAiF TAAGCGCTTATAAACCAACCAA ；spcmR GTCGTCGTATCTGAACCATTGA)，同时以正常B. anthracis AP422菌株做对照。结果如图5所 示，图5中，泳道M为分子量Marker，泳道1为正常菌株对照，泳道2_10为用于鉴定的可能 的重组菌。因为用上述引物进行扩增时，只有发生重组的菌株才能扩增出相应的目标条带， 所以第7泳道对应的菌株中打靶质粒与基因组发生了重组，即spc表达元件取代了基因组 中部分thyA的序列。将上述鉴定表明发生重组的菌在无抗生素的LB培养基上传代培养5 代，筛选得到失去红霉素抗性的菌株，通过抗生素抗性分析证明其不再有红霉素抗性，按照 前述方法制备感受态，然后转入质粒pHY-Cre，方法同样采用电转化，条件同前述。电击完毕 后立即加入ImL冰冷的BHIG培养基，30度孵育2. 5小时.取50 μ L涂布于含红霉素(5 μ g/ mL)的LB平板上，30°C过夜培养，得到阳性克隆。将上述筛选得到的阳性克隆在含红霉素(5yg/mL)的LB液体培养基 中30°C传两代后，再在无抗生素的LB培养基上37 °C传代培养三代，取过夜培养物 5μ L 进行全菌 PCR 鉴定(弓I 物用 thyAuF cgcggatccagtgaagaagtaccc 禾口 thyAdR ccgctcgagaatctcatctataaac)，筛选去除抗性基因的菌株，结果如图6。图6中，泳道M为分 子量Marker。理论上来讲，去除抗性标记后，PCR产物的大小约1. 6kb，而对照正常菌株扩 增出的从的片段应为2. Okb (泳道1)。从PCR结果看，所取的四个克隆均已经去除壮观霉素 抗性基因(泳道2-5)。最终通过上述一系列实验，筛选得到不含质粒的thyA基因敲除的菌 株,命名为 Bacillus anthracis AP422AthyA。4、thyX基因(具有自GENBANK的基因ID为2851295的5'端第1-774位核苷酸 序列)的敲除与thyA基因敲除类似，再根据GenBank登录的Bacillus anthracis sterne株 thyX基因的序列，基因ID为2851295，设计两对特异性引物(引物对thyXuF和thyXAuR ； 引物对 thyXdF 和 thyXdR)，它们的序列如下所示thyXuF :CGCGGATCCCCTTAGTTTTGTTC (序 列表中序列 13)，thyXuR :TCCCCGCGGTGGAAAGTAACAGAAG (序列表中序列 14) ； thyXdF CCGGAATTCAGACAAGTTTTTATAT (序列表中序列 15)，thyXdR CCGCTCGAGGGAGTTCAATCAAAA (序 列表中序列16)。以A16R株基因组DNA为模板，分别扩增thyX基因上下游各约500bp的同源臂。上 游同源臂的扩增引物为thyXuF和thyXuR ；下游同源臂的扩增引物为thyXdF和thyXdR。将扩增得到的下游同源臂用EcoR I和Xho I双酶切后，插入到pT-loxp spc的 EcoR I和Xho I酶切位点之间，得到重组载体，然后将上游同源臂用BamH I和SacII双酶 切后，插入到获得的插入了下游同源臂的重组载体的BamH I和SacII酶切位点之间，得到 重组载体，将获得的重组载体进行酶切和测序鉴定，将酶切和测序鉴定表明正确的重组载 体命名为 pT-thyX: :spc。将质粒pT-thyX: spc用BamH I禾Π Xho I双酶切后与用Sal I和BamH I双 酶切的质粒PMAD连接，转化Ε. coli DH5a.得到的重组质粒酶切鉴定正确后再电转化 E. coliSCSllO。从SCSllO中提取质粒得到打靶用质粒pMAD-thyX: spc。thyX基因敲除的过程按照上述thyA基因敲除的过程进行，不同的是，其中，出发 菌株是 Bacillus anthracis AP422 Δ thyA，使用的质粒为 pMAD-thyX: spc ；以及在这一部分实验中所用LB培养基中除必要的抗生素(同前一部分thyA基因的无痕敲除)外，全部添加50yg/ml的胸腺嘧啶。将获得的阳性菌落培养物进行PCR鉴定筛选，引物用thyXiF和thyXiR(thyXiF TAGGATTATTTTATTAAGTTTCT(序列表中序列 17) ；thyXiR :AAGAAGAAAACTACTCGACAA (序列表 中序列18))，同时以正常B.anthraciSAP422菌株做对照。结果如图7所示。图7中，泳道M 为分子量Marker。去除thyX基因后，PCR产物的大小约1. 6kb (泳道2_3)，而对照正常菌株 扩增出的从的片段应为2. 4kb (泳道1)。PCR结果表明，通过上述一系列基因水平的操作，我 们最终得到了一株thyA和thyX两个基因都缺失的突变株，命名为炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)AP425。所述炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis) AP425，已于2009年11月5日保藏于中 国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为中国北京市朝阳区大 屯路)，保藏号为CGMCC Na · 3405。实施例2、无抗性标记的营养缺陷型减毒炭疽芽孢杆菌的功能验证一、缺陷菌表型分析分别用两份液体LB和两份固体LB培养缺陷菌株炭疽芽孢杆菌 (Bacillusanthracis) AP425，其中一份液体LB或固体LB添加胸腺嘧啶，另一份液体LB或 固体LB不添加胸腺嘧啶，37°C培养14小时后，观察其生长状况。结果表明，在添加胸腺嘧 啶的情况下，无论是液体培养还是固体培养，菌体均生长良好，而不添加胸腺嘧啶菌体生 长极为缓慢(如图8)。图8中A为添加胸腺嘧啶的液体LB(左)和未添加胸腺嘧啶的液 体LB(右)培养炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)AP425的照片，图8中B为添加胸 腺嘧啶的固体LB(左)和未添加胸腺嘧啶的固体LB(右)培养炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)AP425 的照片。二、芽孢形成能力分析缺陷菌株炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis) AP425接种于添加50 μ g/ml的胸 腺嘧啶的LB培养基中，37度培养3天后取样涂片进行芽孢染色，观察芽孢形成情况。结果 如图9所示，结果表明营养缺陷菌株炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis) AP425仍具有芽 孢形成能力。图9中，A为AP422培养16小时后染色结果，B为AP425培养16小时后染色 结果，C为AP422培养120小时后染色结果。
权利要求
一株胸腺嘧啶营养缺陷菌株，是将炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)中的thyA基因和thyX基因灭活获得的菌株。
2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于thyA基因是自GENBANK基因ID为 2850789的5'端第1-957位核苷酸序列；所述thyX基因是自GENBANK基因ID为2851295 的5'端第1-774位核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的菌株，其特征在于所述胸腺嘧啶营养缺陷菌株还经过 去除构建过程中引入的抗生素标记。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的菌株，其特征在于所述炭疽芽孢杆菌 (Bacillus anthracis)
5.根据权利要求4所述的菌株，其特征在于胸腺嘧啶营养缺陷菌株为炭疽芽孢杆菌 (Bacillus anthracis)CGMCC Ns·3405。
6.一种构建权利要求1所述的胸腺嘧啶营养缺陷菌株的方法，是将炭疽芽孢杆菌 (Bacillus anthracis)中的 thyA 基因和 thyX 基因灭活。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述灭活thyA基因和thyX基因的方法 是通过利用同源重组的方法将thyA基因和thyX基因敲除；thyA基因是自GENBANK的基因 ID为2850789的5'端第1-957位核苷酸序列；所述thyX基因是自GENBANK的基因ID为 2851595的5'端第1-774位核苷酸序列。
8.权利要求1-5中任意一项所述的胸腺嘧啶营养缺陷菌株在构建蛋白表达系统中的 应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述构建蛋白表达系统是构建平衡致死 外源蛋白表达系统。
10.权利要求1-5中任意一项所述的胸腺嘧啶营养缺陷菌株在制备免疫制剂中的应 用；所述免疫制剂优选为灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗或基因工程疫苗。
全文摘要
本发明公开了一株胸腺嘧啶营养缺陷菌株及其应用。该菌株，是将炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)中的thyA基因和thyX基因灭活获得的菌株，具体可为炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)CGMCC №.3405。该菌株可作为宿主，构建平衡致死表达系统，进而研究相关的炭疽杆菌疫苗，为新型疫苗的研究打下基础。
文档编号C12N1/20GK101812424SQ20101011560
公开日2010年8月25日 申请日期2010年2月26日 优先权日2010年2月26日
发明者刘纯杰, 展德文, 王令春, 王艳春, 王芃, 袁盛凌, 陶好霞 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所