专利名称：抗炭疽芽孢杆菌保护性抗原单克隆抗体轻、重链可变区基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗炭疽芽孢杆菌保护性抗原单克隆抗体轻、重链可变区基因和基因编码的多肽，以及所述基因和多肽在制备炭疽的新型诊断试剂和治疗药物中的应用。
背景技术：
炭疽是一种人畜共患的烈性传染病。该病由炭疽芽孢杆菌所致，传播迅速，潜伏期短，病死率高。自从美国发生了炭疽芽孢杆菌生物恐怖事件之后，炭疽的有效治疗方法和方便、快捷的检测手段日益受到重视。炭疽芽孢杆菌的外毒素包括保护性抗原(PA)、致死因子(LF)和水肿因子(EF)三种组分。其中PA是炭疽疫苗最主要的免疫原成分，抗PA的多抗血清可以使动物免受炭疽芽孢的感染。本发明以重组PA为免疫原，克隆3株抗PA单克隆抗体，获得了3株单抗的重链和轻链的可变区基因。
发明内容
本发明的一个目的在于提供3株抗炭疽芽孢杆菌保护性抗原(PA)的单克隆抗体4B2、5E1和2A8重链和轻链可变区基因，以便两者重组后可表达出特异性识别和结合PA的抗体活性片段。
本发明的另一目的在于以所述基因和多肽为原料，可以发展新型诊断试剂和治疗药物。
根据本发明的一个方面，本发明涉及3株抗PA的单克隆抗体4B2、5E1和2A8重链和轻链可变区基因。本发明的抗PA单抗4B2、5E1和2A8重链和轻链可变区基因是从能够分泌较高活性的鼠源性抗PA单抗的杂交瘤细胞株4B2、5E1和2A8中克隆的。其中所述的4B2重链可变区基因全长为414bp，5E1重链可变区基因全长为426bp，2A8重链可变区基因全长为342bp，其核苷酸序列如表3、7、11所示，其编码的氨基酸序列如表4、8、12所示。所述4B2轻链可变区基因全长为378bp，5E1轻链可变区基因全长为420bp，2A8轻链可变区基因全长为384bp，其核苷酸序列如表1、5、9所示，其编码的氨基酸序列如表2、6、10所示，轻重链基因重组后可用于表达特异性识别和结合PA的抗体活性片段。
根据本发明的另一个方面，本发明还涉及所述基因和多肽在制备炭疽的新型诊断试剂和治疗药物中的应用。本发明人应用一套设计的引物成功地从培养的抗PA特异性单抗4B2、5E1和2A8杂交瘤细胞中克隆了抗体轻、重链可变区基因。序列分析表明，所得VH和VL基因可编码正确的小鼠抗体可变区。基于上述所得到的抗PA单抗4B2、5E1和2A8轻、重链可变区基因，可构建和表达多种形式的基因工程抗体，用于炭疽的诊断和治疗。
图1为RT-PCR扩增的抗PA单抗4B2、5E1和2A8轻、重链可变区基因的琼脂糖凝胶电泳图，图中M为DL-2000Marker，1为4B2重链可变区基因，2为4B2轻链可变区基因，3为5E1重链可变区基因，4为5E1轻链可变区基因，5为2A8重链可变区基因，6为2A8轻链可变区基因。
具体实施例方式
抗PA单抗4B2、5E1和2A8轻、重链可变区基因的克隆。
所用细胞株是以本发明申请人已公开的专利(公开号CN1746313)所述的重组炭疽保护性抗原为免疫原，采用常规单克隆抗体制备方法获得的3株高亲和力、高特异性的鼠源性抗PA单抗4B2、5E1和2A8杂交瘤细胞株，其中4B2、5E1分泌的抗体分子亚型为IgG1，2A8分泌的抗体分子亚型为IgG2b。
抗PA的单抗可变区基因的克隆取处于对数生长期的4B2、5E1和2A8杂交瘤细胞(5×106)，采用Trizol一步法提取总RNA，取少量进行紫外分光光度计定量及1％琼脂糖凝胶电泳检测。随后以Oligo dT为引物，反转录合成cDNA第一链。然后，利用设计的一套通用引物成功扩增出PA单抗4B2、5E1和2A8的轻、重链可变区基因(VH，VL)。扩增产物VH和VL经琼脂糖凝胶(1％)电泳后，切胶分离靶片段。通过凝胶纯化试剂盒(BIO BASIC INC)回收纯化后，凝胶电泳鉴定(见附图1)。之后将目的片段克隆至T载体，测序分析。
Oligo dT为引物的反转录方案如下50μL反应体系中依次加入2μL2×mRNA Selective PCR BufferI；10μL MgCL2(25mM)；5μL dNTP Mixture；1μL RNase Inhibitor(40U/μL)；1μL AMV RTase XL(5U/μL)；1μL Oligo dT Primer(50μM)；1μg总RNA(1μL)；6μL RNase Free dH2O，混匀，30℃10min，50℃60min，5℃5min。反应产物置于-20℃备用。
PCR扩增反应按常规方法进行以上述产物为模板，分别用轻链引物和重链引物扩增抗体轻、重链可变区基因。反应体系为Ex Taq聚合酶(5U/μL)0.25μL；10×Ex Taq Buffer 5μL；dNTP Mixture(各2.5mM)4μL；模板cDNA2.5μL；5′端和3′端引物(25μM)各1μL，加灭菌蒸馏水至50μL，混匀，瞬时离心后，置PCR仪上反应。反应条件94℃30s，52℃30s，72℃1min，35个循环，最后72℃延伸7min。
目的片段T载体克隆测序方案如下将PCR产物凝胶电泳分离后回收，连入pMD18-T载体。连接反应体系为pMD18-T载体1ul，PCR产物凝胶纯化重链(或轻链)3ul，去离子水1ul，连接缓冲液5ul，混匀后16℃过夜，转化大肠杆菌DH5α，筛选重组克隆，然后采用通用测序引物测序。
设计的单抗可变区基因PCR扩增引物序列如下小鼠重链V区5′端引物HL15′-GGGGCTAGCCACCATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT-3′；HL25′-GGGGCTAGCCACCATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT-3′；HL35′GGGGCTAGCCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT 3′；HL45′-GGGGCTAGCCACCATGATRGTGTTRAGTCTTYTGTRCCTG-3′；mFR1-15′-GAGGTGAAGCTTCTCGAGTCTGG-3′；mFR1-25′-SAGGTSCAGCTGMAGGAGTCWGG-3′；mFR1-35′-GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGG-3′；mFR1-45′-SAGTGYCARCTKCAGCAGYCTGG-3′；mFR1-55′-GARGTGAAGCTTGWGGAGTCTGG-3′；小鼠重链恒定区3′端引物mIgG1 Hcl5′-GATGGGGGTGTCGTTTTGGC-3′；mIgG2ab Hcl5′-CAGGGGCCAGTGGATAGAC-3′；小鼠轻链V区5′端引物LL15′-GGGGCTAGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3′；LL25′-GGGGCTAGCCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG-3′；LL35′-GGGGCTAGCCACCATGGAGWCACAKWCTCAGGTCTTTRT-3′；LL45′-GGGGCTAGCACCATGKCCCCWRCTCAGYTYCTTKGT-3′；LL5 5′-GGGGCTAGCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG-3′；小鼠轻链恒定区3′端引物Outer mKcl5′-TTGACGATGGGTGAAGTTGATG-3′；mKcl5′-CAGTTGGTGCAGCATCAGC-3′；
其中划线处为限制性酶切位点。
抗PA单抗4B2、5E1和2A8的轻、重链可变区基因在制备炭疽的新型诊断试剂和治疗炭疽药物中的应用。
以本发明所述的轻、重链可变区基因重构成一定形式的蛋白药物，可直接用于有关疾病的诊断及导向治疗。另外，以本发明所述的轻、重链可变区基因编码的多肽及其衍生物作为载体，也可用于有关疾病的诊断及治疗。
从本发明所述的轻、重链可变区基因编码的多肽出发，可重组成的基因工程抗体主要有下列几种形式(1)嵌合抗体。是用鼠MAb的V区与人Ig的C区连接而成为人一鼠嵌合抗体。由于其完整地保留了鼠MAb的特异性和亲和力，同时降低了HAMA等不良反应，故在疾病的治疗中显示出良好的效果。(2)人源化抗体。针对可变区基因结构的人源化改造，包括CDR移植、表面氨基酸残基镶饰、骨架区交换、定位保留和表位导向选择等，从而不但降低了可变区的鼠源性同时又保持了鼠MAb的特异性和亲和力。(3)小分子抗体。主要有由VH-CH1和VL-CL组成Fab抗体、用一多肽(GLy4Ser)，接头连接VH基因和VL基因而成的单链抗体、由VH和VL以非共价键结合而成Fv片段抗体、由VH或VL一个功能结构域组成的单域抗体、由单个CDR构成的最小识别单位等。(4)多价微型抗体。主要有双链抗体、(ScFv)2、Flex微型抗体、LD微型抗体、F(ab′)2、F(ab′)3、(ScFv)4等。由于有多价抗原结合位点，亲和力高，分子大小适中，既能穿透组织，亦在肾脏中的清除率较慢的特点而具有较高的临床应用价值。(5)双特异性抗体。是一类具有双重特异性和双重功能的抗体，又称双功能抗体。(6)重组抗体融合蛋白。把Fab或Fv等基因片段，与非抗体的毒素或酶等其它蛋白基因连接形成的具有把特定的生物活性导向靶部位的一种重组蛋白。(7)噬菌体抗体。把Ig的V区基因与丝状噬菌体DNA上基因HI或基因Vm连接经转染宿主菌后，使其在膜表面外壳蛋白表达Fab或ScFv的融合蛋白产物。通过对此产物多轮相关抗原的亲和吸附，从中淘筛出所需的特异性抗体。
序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所<120>抗炭疽芽孢杆菌保护性抗原(PA)单克隆抗体<130>
<160>12<210>1<211>378<212>DNA<213>PA单抗4B2轻链可变区<400>1atgtcccctg ctcagttcct tggtctcctg ttgctctgtt ttcaaggtac cagatgtgat 60atccagatga cacagactac atcctccctg tctgcgactc tgggagacag agtcaccatc 120agttgcaggg caagtcagga cattagcaat tatttaaact ggtatcagca gaaaccagat 180ggaactgtta aactcctgat ctactacaga tcaagattat attcaggagt cccatcaagg 240ttcagtggca gtgggtctgg aacagattat tctctcacca ttagtaacct ggaacaagaa 300gatattgcca cttacttttg ccaacagggt aatacgcttc cgtggacgtt cggtggaggc 360accaagctgg aaatcaaa 378<210>2<211>126<212>PRT<213>PA单抗4B2轻链可变区<400>2Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln1 5 10 15Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu20 25 30Ser Ala Thr Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser35 40 45Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp50 55 60Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Arg Ser Arg Leu Tyr Ser65 70 75Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr80 85 90Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr95 100 105
Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly110 115 120Thr Lys Leu Glu Ile Lys125<210>3<211>414<212>DNA<213>PA单抗4B2重链可变区<400>1atgggatgga gctgggtcat gctcttcctc ctgtcaataa ctgcaggtgt ccattgccag 60gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcctcagt gaagatttcc 120tgcaaagctt ctggctacgc attcagtagc tcttggatga actgggtgaa gcagaggcct 180ggacaaggtc ttgagtggat tggacggatt tatcctggag atggagatac taactacaat 240gggaagttca agggcaaggc cacactgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg 300cagctcagca gcctgacctc tgtggactct gcggtctatt tctgtgcgag aacgattacg 360accccctatg ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc atca 414<210>4<211>138<212>PRT<213>PA单抗4B2重链可变区<400>2Met Gly Trp Ser Trp Val Met Leu Phe Leu Leu Ser Ile Thr Ala1 5 10 15Gly Val His Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu20 25 30Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly35 40 45Tyr Ala Phe Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro50 55 60Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly65 70 75Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr80 85 90Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu95 100 105Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Thr Ile Thr
110 115 120Thr Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr125 130 135Val Ser Ser138<210>5<211>384<212>DNA<213>PA单抗2A8轻链可变区<400>1atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatgtcc 60agaggagaaa atgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatctcc cgggggaaag 120gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt gtaaattaca tgcactggta ccagcagaag 180tcaagcacct cccccaaact ctggatttat gacacatcca aactggcttc tggagtccca 240ggtcgcttca gtggcagtgg gtctggagcc tctttctctc tcacgatcaa cagtatggag 300gctgaagatg ttgccactta ttactgtttt caggggagtg ggaacccact cacgttcggc 360ccggggacaa agttggaaat aaaa384<210>6<211>128<212>PRT<213>PA单抗2A8轻链可变区<400>2Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala1 5 10 15Ser Val Ile Met Ser Arg Gly Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro20 25 30Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Gly Lys Val Thr Met Thr Cys35 40 45Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys50 55 60Ser Ser Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu65 70 75Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala80 85 90Ser Phe Ser Leu Thr Ile Asn Ser Met Glu Ala Glu Asp Val Ala95 100 105Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Asn Pro Leu Thr Phe Gly110 115 120
Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys125<210>7<211>342<212>DNA<213>PA单抗2A8重链可变区<400>1cagtgtcagc ttcagcagtc tgggggctct ctgagactct cctgtgctac ctctgggttc 60accttcactg aatactacat gagctgggtc cgccagcctc caggaaaggc acttgagtgg 120ttgggtttta atagaaacaa agcttatggt tacacaacag aatacagtgc atctgtgaag 180ggtcggttca ccatctccag agataattcc caaaccatcc tctatcttca aatgaacacc 240ctgagaactg aggacagtgc cacttattac tgtgcaagag cccctaaggg ggcgtattat 300tttgactact ggggccaagg caccactctc acagtctcct ca342<210>8<211>114<212>PRT<213>PA单抗2A8重链可变区<400>2Gln Cys Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys1 5 10 15Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Glu Tyr Tyr Met Ser Trp Val20 25 30Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Asn Arg35 40 45Asn Lys Ala Tyr Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys50 55 60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Thr Ile Leu Tyr65 70 75Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Thr Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr80 85 90Cys Ala Arg Ala Pro Lys Gly Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly95 100 105Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser110<210>9<211>420<212>DNA
<213>PA单抗5E1轻链可变区<400>1atggagacac aatctcaggt ctttatgggg ctagccacca tggagtcaca tactcaggtc 60tttatattcg tgtttctctg gttgtctggt gttggcggag acactgtgat gacccagtct 120cacaaattca tgtccacatc agtaggagac aggatcacct tctcctgcaa ggccagtcag 180gatgtaaata ctgctgtagc ctggcttcaa cagaaaccag gacaatctcc taaactactg 240atttactcgg catcctcccg gtacactgga gtccctgatc gcttcactgg cagtggatct 300gggacggatt tcactttcac catcagcagt gtgcaggctg aagacctggc agtttattac 360tgtcagcaac attatagtat tccgtacacg ttcggtgctg ggaccaagct ggagctgaat 420<210>10<211>140<212>PRT<213>PA单抗5E1轻链可变区<400>2Met Glu Thr Gln Ser Gln Val Phe Met Gly Leu Ala Thr Met Glu1 5 10 15Ser His Thr Gln Val Phe Ile Phe Val Phe Leu Trp Leu Ser Gly20 25 30Val Gly Gly Asp Thr Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser35 40 45Thr Ser Val Gly Asp Arg Ile Thr Phe Ser Cys Lys Ala Ser Gln50 55 60Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln65 70 75Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Thr Gly80 85 90Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr95 100 105Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr110 115 120Cys Gln Gln His Tyr Ser Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr125 130 135Lys Leu Glu Leu Asn140<210>11<211>426<212>DNA<213>PA单抗5E1重链可变区<400>1
atgggatgca gctgtgtaat tctcttcctg atggcagtgg ttataggaat caattcagag 60gttcagctgc agcagtctgg ggcagagctt gtgaggtcag gggcctcagt caagttgtcc 120tgcatagctt ctggcctcaa cattaaagac ttctatatgc actgggtgaa gcagaggcct 180gaacagggcc tggaatggat tggatggatt gatcctgaga atggtaatac tgaaaatgcc 240ccgaagttcc aggacaaggc cactatgact gcagacacat cctccaacac agcctacctg 300cacctcagca gcctgacatt tgaggacact gccgtctatt actgtaatgc aaatttctac 360ggccattact tcggctctta ctactttgac tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc 420tcctca426<210>12<211>142<212>PRT<213>PA单抗5E1重链可变区<400>2Met Gly Cys Ser Cys Val Ile Leu Phe Leu Met Ala Val Val Ile1 5 10 15Gly Ile Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu20 25 30Val Arg Ser Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Ile Ala Ser Gly35 40 45Leu Asn Ile Lys Asp Phe Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro50 55 60Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly65 70 75Asn Thr Glu Asn Ala Pro Lys Phe Gln Asp Lys Ala Thr Met Thr80 85 90Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu His Leu Ser Ser Leu95 100 105Thr Phe Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Asn Phe Tyr110 115 120Gly His Tyr Phe Gly Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly125 130 135Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser140
权利要求
1.一种抗炭疽芽孢杆菌保护性抗原(PA)单克隆抗体4B2轻链可变区基因，其具有序列表1的序列。
2.由权利要求1基因编码的多肽，其具有序列表7的序列。
3.一种抗炭疽芽孢杆菌保护性抗原(PA)单克隆抗体4B2重链可变区基因，其具有序列表2的序列。
4.由权利要求3基因编码的多肽，其具有序列表8的序列。
5.一种抗炭疽芽孢杆菌保护性抗原(PA)单克隆抗体5E1轻链可变区基因，其具有序列表3的序列。
6.由权利要求5基因编码的多肽，其具有序列表9的序列。
7.一种抗炭疽芽孢杆菌保护性抗原(PA)单克隆抗体5E1重链可变区基因，其具有序列表4的序列。
8.由权利要求7基因编码的多肽，其具有序列表10的序列。
9.一种抗炭疽芽孢杆菌保护性抗原(PA)单克隆抗体2A8轻链可变区基因，其具有序列表5的序列。
10.由权利要求9基因编码的多肽，其具有序列表11的序列。
11.一种抗炭疽芽孢杆菌保护性抗原(PA)单克隆抗体2A8重链可变区基因，其具有序列表6的序列。
12.由权利要求11基因编码的多肽，其具有序列表12的序列。
13.权利要求1、3、5、7、9、11所述的基因在制备炭疽的新型诊断试剂和治疗药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及抗炭疽芽孢杆菌保护性抗原(PA)单克隆抗体轻、重链可变区基因和基因编码的多肽，以及所述基因和多肽在制备炭疽的新型诊断试剂和治疗药物中的应用。本发明人制备了抗PA特异性单克隆抗体4B2、5E1和2A8杂交瘤细胞株，从上述3株单克隆抗体杂交瘤细胞中分别克隆了抗体轻、重链可变区基因。所获得的重链和轻链可变区基因可用于构建和表达多种形式的基因工程抗体，用于炭疽的诊断和治疗。
文档编号A61K48/00GK1986794SQ20061016584
公开日2007年6月27日 申请日期2006年12月14日 优先权日2006年12月14日
发明者陈薇, 李冰, 徐俊杰, 李建民, 刘树玲, 侯利华, 付玲 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所