远红外温度跃升显微镜的制作方法

专利名称：远红外温度跃升显微镜的制作方法
技术领域：
本发明涉及对生物细胞组织进行观察或成像的荧光显微镜，尤其是指可以对细胞组织进行加热的荧光显微镜。
背景技术：
用加热的方式控制外源基因表达和离子通道开关，在生物医学中有着非常广泛的应用。热激蛋白启动子是一组在结构上高度保守的多肽，当外部温度较高(大于35度)时，该启动子被激活并调控其下流基因的表达。该方法是发育生物学中一个非常重要的实验手段。在离子通道大家族中，最近有许多对温度敏感的离子通道被发现，但对它们的生物学功能的研究还相当匮乏。通过局部加热的方式控制离子通道的开关是研究其功能最有效、直接的实验方法。传统的加热的方式主要用水浴(37度水浴箱)或者电子元件(电阻)对活体生物或者活体组织、细胞进行加热。中国专利200680038229. 8中揭示了一种显微镜加热装置，其也是利用电子元件对水进行加热，形成恒温水浴对细胞组织进行加热。这种传统的通过载物台上的加热装置的加热方式有以下四个缺点
(1)无法微区域加热。无论是用水浴还是电加热，只能对生物标本整体或者大面积局部加热，无法对感兴趣的微区域(十到几十微米)或者单细胞(十微米)进行精确定点加热；
(2)加热效率低，加热耗时长。用水浴激活热激蛋，通常需要对生物标本或者组织持续加热I到2小时。长时间加热对生物个体有较大的损伤，影响其生物活性；
(3)无法精确控制温度。不同组织对热的传导性不一样，导热模型复杂，理论上很难计算加热区域的实际温度梯度分布。同时，传统方法无法实时监控不同区域的温度并进行相应调控；
(4)无法深度加热。由于生物组织不良导热性，使得部分内部组织无法得到有效的加热。由于传统加热方式存在上述缺陷,对于试样标本的微区域加热成为生物医学界急需解决的问题。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可对生物组织进行微区域加热的显微镜，其可以实现微区域加热并精确控制温度。本发明提供的技术方案是远红外温度跃升显微镜，其包括激光光源部、荧光滤光片组合、显微镜成像系统、物镜光学系统、载物台，突光滤光片组合位于激光光源部与物镜光学系统之间；其特征在于在荧光滤光片组合与物镜光学系统之间还设置有远红外激光系统，激发产生远红外激光并将远红外激光聚光于试样上。远红外温度跃升显微镜,其包括激光光源部、突光滤光片组合、物镜光学系统、载物台，所述荧光滤光片组合位于所述激光光源部与所述物镜光学系统之间，其包括发射滤光片、二向色镜及激发滤光片；所述物镜光学系统包括物镜转盘及固定安装在其上的物镜；其特征在于在所述荧光滤光片组合与所述物镜光学系统之间还设置有远红外激光系统，其激发产生远红外激光并将远红外激光聚光于试样上。所述远红外激光系统包括远红外激光光源部、透镜组合及双色镜；其中所述远红外激光光源部用于激发远红外激光及控制远红外激光激发光路的开闭；所述透镜组合用于调节经所述远红外激光光源部激发的远红外激光光斑大小及矫正色差；所述双色镜用于反射改变经所述透镜组合调节后的远红外激光光路和透射可见光，经其反射改变光路的远红外激光透射过所述物镜后聚焦于所述试样上。所述远红外激光光源部包括远红外激光激发装置及与之连接的光路开闭控制装置；所述远红外激光激发装置用于激发远红外激光及调节远红外激光为平行光；所述光路开闭控制装置控制调节为平行光的远红外激光光路的开启和关闭。所述远红外激光激发装置包括远红外激光器、耦合器、光纤和准直器；所述远红外激光器激发远红外激光，经所述耦合器耦合至所述光纤内，经所述光纤输出的远红外激光经所述准直器调节为平行光。所述光路开闭控制装置包括电子光学快门和与之连接的快门控制装置，所述快门控制装置控制电子光学快门的开关。实现加热时间的控制。所述透镜组合包括共 轴设置的正透镜和负透镜，所述负透镜靠近所述远红外激光光源部一侧，所述正透镜靠近所述双色镜一侧，所述正透镜与所述负透镜之间距离可调。所述正透镜与所述负透镜初始距离D满足D=f2-fl，其中Π为所述负透镜焦距的绝对值，f2为所述正透镜焦距。所述正透镜为平凸透镜，所述负透镜平凹透镜，其中fl介于75毫米与125毫米之间，f2介于125毫米与175毫米之间。正透镜与负透镜的焦距的绝对值的比值R= f2/fl。根据不同的实验需求，选择不同R值的透镜组合，可改变加热光斑大小。R值越大，光斑越小；R值越小，光斑越大。微调正透镜和负透镜之间的距离，可改变红外激光辐射发散角矫正系统中的色差，使得远红外激光和可见光在物镜后能聚焦在同一个平面，保证加热位置的精确性。所述双色镜位于所述荧光滤光片组合与所述物镜光学系统之间，且其位于所述激发滤光片的正后方，经所述双色镜改变的远红外激光光路与经所述激发滤光片的荧光激发光路重叠，所述两光路透射过所述物镜聚焦在所述试样上。远红外激光相对于所述双色镜的入射角为45度。所述激光光源部的激发光源为金属卤素灯。所述物镜为干系物镜，其对于远红外激光通透率大于50%。所述载物台为自动平台，其具有外接控制装置的外接接口，通过可编程的所述外接控制装置控制所述自动平台的位移。本发明的显微镜还包括矫正载玻片，其由载玻片、热敏纸、盖玻片依次层叠封装组成，用于对试样提供远红外激光光斑位置坐标。物镜选择远红外激光通透率高的，可使远红外激光最大程度透射过物镜聚光至试样，提高加热效率。自动平台在外接控制装置控制下，根据编制的控制软件，进行自动精确控制，控制自动平台精确移动至至所设定的坐标位。本发明的远红外温度跃升显微镜，是在现有的荧光显微镜基础上通过增加远红外激光系统，产生远红外激光波长在1400nm到1500nm之间。选择对远红外激光波长具有高反射率及对可见光具有高透射率的双色镜改变远红外激光光路使其透射过物镜后聚光与试样上，对试样进行加热。远红外激光在试样上的光斑大小由透镜组合的正透镜和负透镜的焦距绝对值的比值R值进行调节，调节正透镜与负透镜之间的距离改变红外激光辐射发散角矫正系统中的色差。由于远红外激光和激发荧光光路重叠，在荧光显微镜的作用下，可以根据试样各个组织细胞表现出的不同荧光特质，选择需加热的微区域，移动载物台至远红外激光光斑所在坐标，远红外激光路开闭控制装置打开远红外激光光路对其进行加热，加热时间长短由远红外激光路开闭控制装置控制。由于生物组织里面的水分对远红外激光波长吸收效率高，而蛋白质和脂类对远红外激光波长的吸收效率低。生物组织主要由水、蛋白质、脂类和核酸组成，其中水分占到了80%以上。在1450nm-1500nm附近，水对远红外激光(1450nm-1500nm)的吸收系数远高于水对可见光(400-700nm)的吸收系数，高达10000倍以上。而其它成分，如蛋白质和脂类，对远红外激光的吸收很低。因此在远红外激光对生物组织进行加热时，由于水对远红外激光的吸收系数和蛋白质、脂类、核酸等对远红外的吸收系数的巨大差异，生物组织中的水分能有效快速的被加热，被加热的水进而对其周围的蛋白质、脂类、核酸等进行加热，相当于微区域的水浴加热，由于吸收系数不同，则不会损坏其余重要成分，从而保持生物活性。显微镜物镜对激光具有精确汇聚能力，市场上通用的显微镜物镜对激光有非常好的汇聚作用，焦点处光斑大小在I微米左右。本发明的显微镜具有的优点如下a微区域加热。通过明场或荧光显微镜找到感兴趣的单细胞、细胞群或小面积组织，然后用远红外激光进行精确的定点加热。根据不同的实验需求，可以一次加热几个微米的区域(单细胞水平)或者几十微米的组织；b快速加热。在远红外激光的刺激下，组织温度在几微妙内就能升高十几度，并稳定在平台期。根据本发明人的初期实验结果，I秒就可以激活斑马鱼中的热激蛋白启动子，远优于传统水浴方法的几十分钟；c实时监控加热温度。在对生物标本进行远红外激光加热同时可以进行荧光成像。一些荧光团的荧光强度和温度成线性关系，通过测量荧光强度的变化实时监控微环境的温度。d深部加热。由于远红外激光对生物组织(脂肪类等)有较高的穿透性，可以无创伤加热深部组织。


图1，本发明的结构原理示意图。
具体实施例方式本发明的远红外温度跃升显微镜，可以实现对生物试样的微区域加热，，且加热时间短，加热效率高。发明要点即是在现有荧光显微镜的基础上增加远红外激光系统，通过远红外激光对试样实现微区域精确加热。由于荧光显微镜为现有技术，因此，在本实施例中涉及到的荧光显微镜的的具体结构部分(本实施例揭示或未揭示的)请参看现有技术中的荧光显微镜结构。现针对本发明举一较佳实施例并结合图式进行具体说明。本发明的远红外温度跃升显微镜，参看图1，主要包括安装在镜体上的激光光源部1、荧光滤光片组合、物镜光学系统、载物台，远红外激光系统；物镜光学系统包括物镜转盘(未图示)及物镜3。
激光光源部1，其部件及其构成可以参看现有荧光显微镜的激光光源部，由于该激光光源部为现有技术，在此不再对其结构及具体组成进行赘述。激发光光源可以是汞灯或金属卤素灯，在本实施例中采取寿命比较长的金属卤素灯，提供荧光成像的激发光光源。突光滤光片组合，包括括发射滤光片21、二向色镜22、激发滤光片23。发射滤光片、激发滤光片分别固定设置在滤光立方体上，二相色镜呈45度角设置于滤光立方体内的荧光转盘上。来自金属卤素灯的发射光经过发射滤光片的滤光，再经二向色镜的反射及激发滤光片的滤光，使满足试样荧光吸收光谱的荧光激发光透过激发滤光片并透过物镜3使其聚焦于物镜3后的试样S上，试样S吸收激发光后发出特有的荧光。生物组织的各组织之间所具有的荧光特质不同，其吸收激发光后所发出的荧光特质也不同，根据组织荧光发光特质不同，很容易对组织进行观察辨识。物镜转盘安装在镜体上，物镜3固定在物镜转盘上。物镜3与激发滤光片23处于同一光路中。物镜3选择干系物镜，放大倍数介于40x到63x之间，数值孔径大于O. 6，对远红外激光的通透率大于50%。物镜对远红外激光的通透率越高，加热效率越高，加热时间越短。载物台安装在镜体上，位于物镜光学系统一侧。由于荧光显微镜放大倍数高，测试过程中试样的移动距离都很微小，通过手动控制移动距离很难操作。因此，在本实施里中，载物台选择可以自动移动的自动平台。该自动平台可以选择二维自动移动平台或三维自动移动平台。自动平台具有外接可编程控制器的外接接口，比如RS232接口或其他标准接口。通过该外接接口与外部控制器连接，比如外接外部计算机，通过控制程序对其坐标位移进行精准控制。该自动平台目前在市面上也有售，比如Applied ScientificInstrumentation公司生产的MS-2000三维移动平台。远红外激光系统5，安装在荧光滤光片组合和物镜光学系统之间的镜体上。主要包括远红外激光光源部、透镜组合53及双色镜54。远红外激光光源部包括远红外激光激发装置51及与之连接的光路开闭控制装置52。远红外激光激发装置51包括远红外激光器51a,稱合器51b,光纤51c,准直器51d。光纤经稱合器与远红外激光器连通,光纤与准直器连接。远红外激光器激发远红外激光，通过调节耦合器内部的非球面透镜将激光光束耦合至光纤内径通道，远红外激光经过光纤传输至准直器，调节准直器内的非球面透镜使经准直器输出的远红外激光为平行光束，即高斯光束。远红外激光器采用可以激发波长为1400nm至1500nm范围之间的远红外激光器，本实施例采用高功率低功耗远红外半导体激光器，可选择激发波长为1450nm或1470nm，输出功率大于150mw的远红外半导体激光器。光纤选择内径为100至200微米、光纤波段(1300-1600nm)的光纤；准直器的输出激光光束功率不低于lOOmw。光路开闭控制装置52包括电子光学快门和快门控制装置。电子光学快门通过适配器与准直器连接。快门控制装置包括快门控制器及进行控制的控制软件。快门控制器与电子光学快门连接对其进行控制。快门控制器配备有TTL输入接口，其与电子光学快门连接，通过控制软件控制TTL输入接口的电平高低，实现对电子光学快门的开关的精确控制。电子光学快门的光圈大于15毫米，快门的响应时间低于10微妙。控制器为电子光学快门提供驱动电源，控制电子光学快门的开关。当TTL为高电平时，电子光学快门被打开，远红外激光可通过电子光学快门对试样进行加热；当TTL为低电平时，电子光学快门关闭，阻断远红外激光的传输光路，停止加热。由于电子光学快门的响应时间低于10微妙，因此可以精确控制加热时间。而且，该快门控制器具有外接的RS232接口，其可以通过与外部计算机连接，自行编制控制软件，根据自身需要通过控制软件来实现控制电子光学快门的开关。电子光学快门和控制器可选用Vincent Associates公司生产的VCM-Dl单通道控制器和LS6光学快门。透镜组合53，由安装在透镜套管(未图示)中的正透镜53a和负透镜53b组合而成，负透镜53b靠近电子光学快门一侧，且正透镜和负透镜的光轴同轴。透镜套管一端与光学快门连接，其另一端与安装有双色镜54的滤光立方体连接。透镜套管具有一固定部和相对于该固定部可前后移动的移动部。移动部的一端通过螺纹套设在固定部的外端上，移动部的另一端通过螺纹套设在一套筒上，该套筒与电子光学快门固定连接。固定部、移动部、套筒均具可供光线穿过的中空部。正透镜和负透镜分别安装在固定部和移动部上，旋转移动部，即可调节正透镜和负透镜之间的距离。本实施例中，正透镜53a为抗反射增透膜的平凸透镜，负透镜53b为抗反射增透膜的平凹透镜，平凸透镜和平凹透镜相对于普通透镜来说，其色差较小。平凹透镜的焦距(-Π)在75毫米到125毫米之间，平凸的焦距(f2)在125毫米到175毫米之间，两个透镜的初始距离D满足D=f2-fl。小范围调节D (小于5毫米)，可改变红外激光辐射发散角矫正系统中的色差，使得远红外激光和可见光在物镜后能聚焦在同一个平面。正透镜与负透镜的焦距的绝对值的比值R= f2/fl。根据不同的实验需求，选择不同R值的透镜组合，可改变加热光斑大小。R值越大，光斑越小；R值越小，光斑越大。透镜套管两端分别通过卡紧螺丝卡紧连接在光学快门和安装双色镜54的滤光立方体上。通过卡紧螺丝的拧紧与松开，可以方便实现透镜套管的更换。双色镜54，以45度角固定安装在标准显微镜滤光立方体内的显微镜荧光转盘上。双色镜54位于荧光滤光片组合2与物镜光学系统的物镜3之间，具体地说，双色镜54位于荧光滤光片组合2的激发滤光片的正后方，处于荧光光路中。双色镜54对45度角入射的远红外激光反射率大于70%，对于以45度角入射的波长为1450和1470nm远红外激光的反射率大于90% ;对入射的可见光`(400-700nm)透射率大于80%。通过透镜组合的远红外激光以45度角入射双色镜，经双色镜反射后的远红外激光改变其原有光路，其改变后光路与荧光光路重叠，透射过物镜并聚焦在物镜后的试样上，形成加热光斑。经双色镜反射后形成的远红外激光光路重叠在荧光光路中，并和荧光激发光、可见光聚焦于物镜后的同一个平面上，该平面即为试样所在位置，即聚焦于试样上。在本发明中设置有显微镜成像系统，即用于荧光显微镜成像记录的光学相机，用于记录观察试样标本的荧光成像。显微镜成像系统属于现有技术，在市面上有成套成像系统，在此则不再赘述其结构。由于双色镜对于可见光透射率高，对远红外激光反射率高，因此，试样吸收激发光后激发的荧光、可见光可透射过双色镜、二向色镜后进入光学相机方便记录。在加热的过程中，不能用目镜观察。光学系统中的部分反射红外激光对眼睛有较大危险，需要用相机记录观察加热过程和荧光强度变化，计算加热温度，而不会因为双色镜的存在影响影响记录荧光强度变化和观察样本对远红外激光的加热反应。双色镜可选用Semrock公司生产的45度角低通双色镜(FF746_SDi01);显微镜滤光立方体可选用Throlabs 公司生产的 MDFM-MF2。在本实施例中，本发明的的显微镜还配备有矫正载玻片。在厚度Imm的载玻片表面平放一层热敏纸，施压一定压力后用厚度为O. 17mm盖玻片覆盖，封片做成矫正载玻片。为了确定远红外激光光斑的大小和相对位置坐标，先将矫正载玻片放在载物台上，热敏纸接收到远红外激光后，会在其上记录远红外激光通过物镜后聚焦在试样S上的光斑大小和相对位置，为加热试样标本提供位置坐标。这样节省试样S放置到正确加热位置的时间及避免对试样标本不需要加热的位置的不必要加热。盖玻片的厚度和干系物镜匹配即可，载玻片可以依据实际需求进行选择。本发明的原理荧光激光激光器发射出激发光，经荧光滤光片组合滤光反射滤光，改变激发光光路使其透过物镜聚焦于试样上，试样吸收荧光激发光并发出特有的荧光，试样的组织区域由于其组分不同，显示的荧光特质也不同，可以清晰有效的观察试样组织及其结构。在荧光显微镜作用下选择所需加热的组织区域，经远红外激光系统激发的远红外激光经电子光学快门再经过透镜组合以45度角入射双色镜后经双色镜反射进入荧光光路中，并透射过物镜后聚焦于试样上。根据试样标本显示出的荧光特质，选择要加热的区域，通过控制装置控制自动平台带着试样移动至正确坐标位置，对试样标本进行加热。为了精确直接对试样标本的微区域加热，需先将矫正载玻片放置在自动平台上，开启远红外激光光路，矫正载玻片上热敏纸可以捕获远红外激光的光斑坐标位置。然后将试样标本放置在自动平台上，观察确定所需要加热的微区域，通过移动自动平台，使试样待加热的微区域移动至热敏纸测定的远红外激光光斑所在坐标位置。然后开启远红外激光光路，对其进行加热。试样标本的精确加热位置可通过调节自动平台的位移来实现。对试样的加热时间长短由荧光温度曲线来判断。本发明的远红外温度跃升显微镜，其通过在荧光显微镜基础上增加远红外激光系统，实现在荧光显微镜观察下对微区域的组织结构进行加热。在进行加热的同时进行荧光成像，由于一些荧光团的荧光强度和温度成线性关系，通过测量荧光强度的变化实时监控试样微区域的加热温度。常用的荧光蛋白的强度和温度成线性关系；如果是非线性的荧光蛋白，可以事先矫正温度曲线后即可进行加热温度控制。通过电子光学快门及控制器，可以精确控制远红外激光的光路的开启和关闭，实现精确控制加热时间。
权利要求
1.远红外温度跃升显微镜，其包括激光光源部、荧光滤光片组合、显微镜成像系统、物镜光学系统、载物台，所述荧光滤光片组合位于所述激光光源部与所述物镜光学系统之间，其包括发射滤光片、二向色镜及激发滤光片；所述物镜光学系统包括物镜转盘及固定安装在其上的物镜；其特征在于在所述荧光滤光片组合与所述物镜光学系统之间还设置有远红外激光系统，其激发产生远红外激光并将远红外激光聚焦于试样上。
2.根据权利要求1所述的远红外温度跃升显微镜，其特征在于所述远红外激光系统包括远红外激光光源部、透镜组合及双色镜；其中所述远红外激光光源部用于激发远红外激光及控制远红外激光激发光路的开闭；所述透镜组合用于调节经所述远红外激光光源部激发的远红外激光光斑大小及矫正色差；所述双色镜用于反射改变经所述透镜组合调节后的远红外激光光路和透射可见光，经其反射改变光路的远红外激光透射过所述物镜后聚焦于所述试样上。
3.根据权利要求2所述的远红外温度跃升显微镜，其特征在于所述远红外激光光源部包括远红外激光激发装置及与之连接的光路开闭控制装置；所述远红外激光激发装置用于激发远红外激光及调节远红外激光为平行光；所述光路开闭控制装置控制调节为平行光的远红外激光光路的开启和关闭。
4.根据权利要求3所述的远红外温度跃升显微镜，其特征在于所述远红外激光激发装置包括远红外激光器、耦合器、光纤和准直器；所述远红外激光器激发远红外激光，经所述耦合器耦合至所述光纤内，经所述光纤输出的远红外激光经所述准直器调节为平行光。
5.根据权利要求3所述的远红外温度跃升显微镜，其特征在于所述光路开闭控制装置包括电子光学快门和与之连接的快门控制装置，所述快门控制装置控制电子光学快门的开关。
6.根据权利要求2所述的远红外温度跃升显微镜，其特征在于所述透镜组合包括共轴设置的正透镜和负透镜，所述负透镜靠近所述远红外激光光源部一侧，所述正透镜靠近所述双色镜一侧，所述正透镜与所述负透镜之间距离可调。
7.根据权利要求6所述的远红外温度跃升显微镜，其特征在于所述正透镜与所述负透镜初始距离D满足D=f2-fl，其中Π为所述负透镜焦距的绝对值，f2为所述正透镜焦距。
8.根据权利要求7所述的远红外温度跃升显微镜，其特征在于所述Π介于75毫米与125毫米之间，所述f2介于125毫米与175毫米之间。
9.根据权利要求6、7、8任一所述的远红外温度跃升显微镜，其特征在于所述正透镜为平凸透镜，所述负透镜平凹透镜。
10.根据权利要求2所述的远红外温度跃升显微镜，其特征在于所述双色镜位于所述荧光滤光片组合与所述物镜光学系统之间，且其位于所述激发滤光片的正后方，经所述双色镜改变的远红外激光光路与经所述激发滤光片的荧光激发光路重叠，所述两光路透射过所述物镜聚焦在所述试样上。
11.根据权利要求10所述的远红外温度跃升显微镜，其特征在于远红外激光相对于所述双色镜的入射角为45度。
12.根据权利要求1所述的远红外温度跃升显微镜，其特征在于所述激光光源部的激发光源为金属齒素灯。
13.根据权利要求1所述的远红外温度跃升显微镜，其特征在于所述物镜为干系物镜，其对于远红外激光通透率大于50%。
14.根据权利要求1所述的远红外温度跃升显微镜，其特征在于所述载物台为自动平台，其具有外接控制装置的外接接口，通过所述外接控制装置控制所述自动平台的位移。
15.根据权利要求1所述的远红外温度跃升显微镜，其特征在于还包括矫正载玻片，其由载玻片、热敏纸、盖玻片依次层叠封装组成，用于对试样提供远红外激光光斑位置坐标。
全文摘要
远红外温度跃升显微镜，其包括激光光源部、荧光滤光片组合、显微镜成像系统、物镜光学系统、载物台，所述荧光滤光片组合位于所述激光光源部与所述物镜光学系统之间，其包括发射滤光片、二向色镜及激发滤光片；所述物镜光学系统包括物镜转盘及固定安装在其上的物镜；在所述荧光滤光片组合与所述物镜光学系统之间还设置有远红外激光系统，其激发产生远红外激光并将远红外激光聚光于试样上。该显微镜可以对生物试样标本的微区域进行精确加热，且加热效率高。
文档编号G02B21/30GK103033920SQ20121050790
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月3日 优先权日2012年12月3日
发明者秦培武, 于冬梅 申请人:苏州大猫单分子仪器研发有限公司