专利名称：白氏文昌鱼热休克蛋白70基因启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及文昌鱼热休克蛋白，特别涉及白氏文昌鱼热休克蛋白70基因启动子及其应用。
背景技术：
文昌鱼(Amphioxus)隶属脊索动物门(Chordate)头索动物亚门 (Cephalochordate)，它处于无脊椎动物进化到脊椎动物一个重要的过渡阶段，是现存生物中最类似于脊椎动物亚门直接祖先的类群之一。因其独特的进化地位，且结构简单，身体半透明，基因组仅为人类的1/6，呈现出基因倍增前脊椎动物祖先的基因组的特征(1、 Balczarek, K. A.，Lai, Z. C.，Kumar，S.，Evolution of functional diversification of the pair box (Pax)DNA-binding domains. Molecular. Biology and Evolution[J]. 1997. (14)，拟9-842.)。随着对文昌鱼的研究日益深入，佛罗里达文昌鱼(Brmchiostoma flloridae)全基因组测序完成，尤其是文昌鱼实验室连续繁殖的成功(2、Zhmg，Q. J.， Sun，Y.，Zhong，J.，Li，G.，Lii, Χ. Μ.，Wang, Y. Q，Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generation in laboratory. Journal of Experimental Zoology(Molecular and Developmental Evolution)[J]. 2007，308(4)， 464-47 ，极大地推动了文昌鱼的模式化进程。在其他模式生物中成功应用的生物技术，如 RNA干扰技术，显微注射和细胞培养技术等同样在文昌鱼中逐步建立。作为一种新型的模式生物，研究其调控目的基因表达的分子工具是必不可少的，到目前为止，文昌鱼中只有 ^οχ D基因启动子(3、Yu，J· K. ,Holland,N. D.，Holland，L Ζ. ,Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos.Development Biology. 2004. (274)， 452-461)，Vent, Goosecoid and Chord 基因启动子(4、Kozmikova, I.，Smolikova, J.， Vlcek, C. , Kozmik,Ζ. ,. Conservation and diversification of an ancestral chordate gene regulation network for dorsoventral patterning. Public Library of Scicence One. 2011.6(2))被报道。在现有的几种模式生物中，已建立了一些调控基因表达系统，如四环素诱导系统(5、 Gossen, M. ， and Bujard， H. ， Anhydrotetracycline, a novel effector for the tetracycline controlled gene expression systems in eukaryotic cells. Nucleic Acids Research,1993. 21，4411—4412)，Gal/UAS 系统(6、Lewandoski, Μ.，Conditional control of gene expression in the mouse. Nature Reviews Genetics. 2001. 2(10), 743-755)，或是开发一些组织特异性的启动子或是增强子，如vasa基因启动子能使下游目 ^ ^^ ^ ^^ O、Tanaka, M. ，Kinoshita, M. ，Kobayashi, D. ，Nagahama, Y.， Establishment of medaka(Oryzias latipes)transgenic lines with the expression of green fluorescent protein fluorescence exclusively in germ cells :a useful model to monitor germ cells in a live vertebrate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2001. 98 (5)，2544-2549)，肾细胞特异的钙粘着蛋白基因的启动子能引导报告基因在肾脏和生殖泌尿道中特异表达(8、Shao, X.L.，Johson, J. E.，Richardson, J. Α. , Hiesberger, Τ. , Igarashi, P. , Aminimal Ksp-Cadhe—rin promoter linked to a green fluorescent protein reporter gene exhibits tissue-specific expression in the developing kidney and genitourinary tract.Journal of American. Sociology. 2002. 13,1824-1836)。然而以上所提到两种方法存在不可克服的弊端，一是需要开发数目众多的组织特异性的启动子或是增强子，同时不易调控靶基因的表达(9、 Rome, C. , Couillaud, F. , Moonen,C. Τ. W. ,Spatial and temporal control of expression of therapeutic genes using heat shock protein promoters. Methods[J]. 2005.35, 188-198)，二是化学药物诱导，对机体有害或有潜在的副作用(10、Oda, S.，Mikami, S.， Urushihara,Y. ,Murata,Y. ,Kamei,Y. ,Deguchi,Τ. ,Kitano,Τ. ,Fujimori,K. Ε. ,, Yuba,S., Todo,Τ. ,Mitani,H. ,Identification of a functional medaka heat shock promoter and characterization of its ability to induce exogenous gene expression in medaka in vitro and in vivo. Zoological Science. 2010. 27 (5)，410-415)。因而，在新型模式生物文昌鱼中需要建立更好的表达调控系统。 近年来，热休克蛋白基因启动子被广泛用于调控外源基因表达(ll、aioji，W. ,and Sato-Madda,M. ,2008. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development Growth & Differentiation. 50，401-406)。在医疗中，人的 Hsp70B 启动子被用于肿瘤细胞的靶向治疗。正常条件下，下游基因在热休克蛋白基因控制下不表达或表达量很低，应激后表达急剧上调。该启动子不仅受热诱导，还受所处环境的重金属盐，氨基酸类似物，渗透压等刺激。热休克蛋白基因启动子在在果蝇，斑马鱼，小鼠等都得到了很好的研究和应用，但不清楚这些报道的热休克蛋白基因启动子是否也能在文昌鱼中很好的发挥作用。除此之外，自身启动子应该比其他物种来源的要更合适文昌鱼的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供白氏文昌鱼热休克蛋白70基因启动子。本发明的第二目的在于提供白氏文昌鱼热休克蛋白70基因启动子在调控白氏文昌鱼基因表达中的应用。所述白氏文昌鱼热休克蛋白70基因启动子的核苷酸序列为caatggctaacacgacatcacattatttcattattagatgctgttatcatagtattcata60
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ttcggaaaaa ttgtagatct tgggagaagg ttcttccgag tggtttataa gcgccgcaga 720agcgaactct ggtcattcag tttccagaga agcgaagcaa agttatccag agtgagaacg 780tagagcgatt g791。所述白氏文昌鱼热休克蛋白70基因启动子可有效调控下游基因表达。其受热诱导的特性对研究某些对生物机体产生毒性的基因非常重要，可避免毒性基因持续表达导致的对生物体造成的有害影响。也可以白氏文昌鱼热休克蛋白70基因启动子对感兴趣的基因功能展开不同时间上，不同空间上(即不同组织器官)的研究。将该启动子介导的目的基因整合到文昌鱼基因组中，建立转基因文昌鱼，即可对文昌鱼的不同发育时期或是不同部位的目的基因进行研究。由此可见，白氏文昌鱼热休克蛋白70基因启动子可用于调控白氏文昌鱼基因的表达。白氏文昌鱼热休克蛋白70基因启动子热诱导效果明显，基础性表达活力低。且因生物机体都有一定程度的耐热能力，不会对对机体造成损伤，热处理操作简单，使得白氏文昌鱼热休克蛋白70基因启动子的应用广泛。本发明成功克隆了文昌鱼热休克蛋白70基因的上游791bp序列，并将该片段载入带有绿色荧光蛋白(GFP)的报告载体，在斑马鱼胚胎及鲤鱼上皮瘤细胞系(EPC细胞系)进行功能检验，已证明该片段确实是热诱导的启动子，可作为调控文昌鱼基因时空表达的分子开关。
图1为转染重组质粒的鲤鱼上皮瘤细胞在不同温度刺激后的GFP表达情况电镜图。在图1中，上方为白光下的电镜图，下方为荧光下的电镜图，温度分别为25°C，31°C， 34°C，37°C。
具体实施例方式实施例1白氏文昌鱼热休克蛋白70(Hsp70)基因启动子序列获取1、分离含有Hsp70的BAC克隆通过人(GenebankID :NM_005345),小鼠(Genebank ID :ΝΜ_010479)，斑马鱼(Genebank ID :NM_131397)，及佛罗里达文昌鱼 Hsp70 (JGI protein ID :277443)序列比对后，在保守位点设计一对特异引物，Hsp70-F CGGCTTACTTCAACGACT，Hsp70_R GACGACAGCGTCCTCTT。该引物首先在白氏文昌鱼基因组水平上进行PCR(聚合酶链式反应) 扩增，能有效扩增到391b的序列，经测序验证为目的基因片段。因此采用这对引物到白氏文昌鱼基因组 BAC 文库(Wang，W. ,Xu,H. L.，Lin，L. P. ,Su B. ,Wang, Y. Q. ,Construction of a BAC library for Chinese amphioxus Branchiostoma belcheri and identification of clone containing Amphi-Pax genes. Genes & Genetic Systems.2005. 80(3), 233-236.)筛选包含有Hsp70的BAC克隆，共筛选了 94块384孔板，其中在69，77号板上筛选到阳性克隆。选取69号板进一步筛选，21B位置的克隆为阳性克隆。2、Hsp 70上游区域序列分析将筛选到的含有Hsp 70的BAC克隆69-21B (所在文库的编号)质粒进行测序(由深圳华大基因完成)。序列注释采用Genscan Qittp://genes, mit. edu/GENSCAN. html)和 Genwise (http://www. ebi. ac. uk/Tools/ffise2/index. html)在线软件。截取 Hsp70 基因
5起始密码子ATG上游1200bp序列进行在线软件(http://www. fruitfly. org/seq_tools/ promoter, html)预测潜在的启动子及其转录元件搜寻(http://www. cbil. upenn. edu/ cgi-bin/tess/tess)。预测结果发现起始密码上游的非编码区预测出一个核心启动子，最重要的是，该区域包含了三个热休克元件(heat shock element HSE)，针对这些重要的调控元件所在的区域设计一对特异引物，引物序列为Hsp70-pro-F -.CTCGAG CAATGGCTAACACGACATCAC,下划线斜体部分为 Β ο I 酶切位点；Hsp70-pro-R GAATTC CAATCGCTCTACGTTCTCACT,下划线斜体部分为 EcoR I 酶切位点，对潜在的启动子区域(791bp)进行PCR扩增，获得白氏文昌鱼热休克蛋白70基因
启动子。所得白氏文昌鱼热休克蛋白70基因启动子的核苷酸序列为caatggctaacacgacatcacattatttcattattagatgctgttatcatagtattcata60
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tagagcgattg791。实施例2白氏文昌鱼热休克蛋白70基因启动子1、构建重组表达质粒将扩增启动子区域的PCR经Xho IjEcoR I双酶切处理，载入经过同样双酶切处理的pAcGFPl-l(该载体无启动子，Clontech)载体中，转化DH5a菌株，经PCR及酶切鉴定后得到阳性克隆进行测序，证明插入片段无误，然而进行功能验证。2、显微注射斑马鱼胚胎因文昌鱼胚胎显微注射技术暂时还不够稳定，申请人将所构建好的重组质粒注射到斑马鱼胚胎中进行验证。注射的斑马鱼胚胎处于单细胞时期，从胚胎的动物级注入，每个胚胎注射量约为1 2nl，注射的重组质粒浓度约为lOOng/μ 1，显微操作仪为Narishige IM-30型。200枚胚胎用于注射组，分为2组，一组用于热激，一组不热激，作为对照，每组 100枚。24h后，由于机械损伤，热激的胚胎剩下95枚存活，对照的胚胎剩下94枚。将热机组的胚胎置于预热好的37°C水浴中，处理0.证，对照组不处理，一直处于培养箱中。热激4h后，检测各胚胎荧光表达情况。最后热激组一共观察到39条鱼出现荧光，对照组出现 12条，即热激组有41. (39/95)的胚胎检测到报告基因的表达，没有经过热激处理的有12.8% (12/94)的胚胎检测到GFP的表达。经过热诱导的胚胎，检测到发荧光的胚胎比率明显上调，证实了克隆的序列为诱导型的启动子。2. 3转染细胞鲤鱼上皮瘤细胞EPC培养于含5%胎牛血清的L15培养基(Gibco)中，25°C生化培养箱中传代培养。转染前，细胞更换无血清的新鲜培养基中，本实验采取脂质体转染。分别将Iyg 质粒DNA及5 μ L的脂质体Lipofectamine 2000 (Invitrogen)稀释到250 μ L的无血清培养基中，各自混勻静止5min后，再将两种溶液混合均勻，室温静置20min。待DNA-脂质体复合物形成后，缓慢均与加入到各细胞培养皿中。轻轻来回晃动，然后置于25°C培养箱中培养。他后，跟换新鲜含有5%胎牛血清的培养基。为考察不同温度，31°C，34°C，37°C对对启动子Pl的诱导效果，细胞更换培养基4h 后，开始热激处理，将细胞培养皿置于31°C，34°C，37°C温度的水浴锅中，各处理0. 5h，然后放回培养箱中培养，阴性对照组转染无启动子的pAcGFPl-Ι质粒，持续25°C培养。24h后观在倒置荧光显微镜(Nikon TE-2000S)观察荧光表达情况，转染含启动子的重组质粒在不同温度刺激后，报告基因得到了不同程度的表达，对照组没有观察到GFP，正常温度(25°C ) 培养的EPC细胞中也观察不到GFP的表达，31°C处理的细胞开始有较弱的报告基因的表达， MO热激的EPC细胞可以观察到较强的GFP表达，37°C表达最强烈(参见图1)。再将细胞消化下来，悬浮于冰冷的PBS中，采用流式细胞仪EPICS XL (Beckman Coulter)检测GFP的表达量。通过流式细胞仪检测GFP的表达情况，结果见表1。37°C刺激后表达GFP的细胞约为10. 90%，相比较25°C培养细胞(2. 20% )，GFP表达上调约5倍，同时看出温度对启动子有十分显著的热诱导效果(AN0VA，P < 0. 01)。表1不同温度刺激后流式细胞仪检测GFP阳性细胞的表达
刺激温度(°c ) GFP阳性细胞比例(％ )
25 (对照)2.20±0.26
313.76±0.23344.55±0.213710.88±0.39 数据充分说明这段791bp的序列具有启动子的功能，并且是热诱导的启动子。可利用其与其它基因建立转基因文昌鱼，开展发育过程中的过表达研究，探讨其功能及其发挥作用的时期，为研究文昌鱼基因功能提供一个有力的工具。
权利要求
1.白氏文昌鱼热休克蛋白70基因启动子，其特征在于其核苷酸序列为caatggctaacacgacatcacattatttcattattagatgctgttatcatagtattcata60cggtattaacgttatatcaaggactgtgttacctaggcttgagatactgtgttttagatt120atttagctagacatgtcctcgattacatgtatatatagctgaagcaggctctttccagat180tgacacacatagtattatagactaattacaacgcaatattcatatcatgtgcatatgata240tcacaggaataattcttggtacgatttcaggacaacagacgcagacgtctgcacgtgttt300gaaaacacccccctccccctctggactttttacacgctcataatgctacatatgaatggc360tagatactatcacataacgcccaatcgtgcacatgatatt3.3.3.3.3. C 3. 3.aagaaccttt420gtcgccggagaagggacatcttgaaatcggaggacactggagactttctacatctttcca480gaagaaactttccgccatcttgaatgtttacattctcccatggaccagcccattttgcgg540caggtatttacgacacgacgtgacgtcctactgcacgggcggttccagaaagctctggaa600ggtgcgcgcaagttctcgtgttatcctggatgttgtagaagcctagattgttcctgaatg660ttcggaaaaattgtagatcttgggagaaggttcttccgagtggtttataagcgccgcaga720agcgaactctggtcattcagtttccagagaagcgaagcaaagttatccagagtgagaacg780tagagcgattg791。
2.如权利要求1所述的白氏文昌鱼热休克蛋白70基因启动子在调控白氏文昌鱼基因表达中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述基因是下游基因。
全文摘要
白氏文昌鱼热休克蛋白70基因启动子及其应用。涉及文昌鱼热休克蛋白，提供白氏文昌鱼热休克蛋白70基因启动子及其在调控白氏文昌鱼基因表达中的应用。所述白氏文昌鱼热休克蛋白70基因启动子可有效调控下游基因表达。其受热诱导的特性对研究某些对生物机体产生毒性的基因非常重要，可避免毒性基因持续表达导致的对生物体造成的有害影响。也可以白氏文昌鱼热休克蛋白70基因启动子对感兴趣的基因功能展开不同时间上，不同空间上的研究。将该启动子介导的目的基因整合到文昌鱼基因组中，建立转基因文昌鱼，即可对文昌鱼的不同发育时期或是不同部位的目的基因进行研究。
文档编号C12N15/113GK102199604SQ20111006886
公开日2011年9月28日 申请日期2011年3月21日 优先权日2011年3月21日
发明者李光, 李定亮, 王义权 申请人:厦门大学