Epsps基因启动子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及来源于牛筋草EPSPS基因的启动子及其应 用。
【背景技术】
[0002]目前，转基因抗草甘麟作物的培育主要是通过转入外源EPSPS基因来实现的，各 国科学家们已从植物及微生物中获得大量抗草甘麟EPSPS基因用于转基因抗草甘麟作物 的研究，其中从上壤细菌Agrobacterium中分离出来的CP4-EPSPS基因是最有效的，而其他 EPSPS基因用于研究抗草甘麟转基因作物的效果却不佳，普遍存在外源基因表达量不高的 现象，其原因尚不明确。植物基因转录水平的表达受上游启动子中的顺式作用元件和细胞 内转录因子共同调控，EPSPS基因启动子目前尚未见报道。获得EPSI^基因启动子，将EPSPS 基因启动子和EPSPS基因共同应用于抗草甘麟转基因作物的研究具有较强的应用意义。
【发明内容】
[0003] 本发明的首要目的在于提供EPSPS基因的启动子。
[0004] 本发明的另一目的在于提供上述启动子的用途。 阳〇化]本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0006]EPSPS基因的启动子，为如下的一种：
[0007] (1)沈QIDNo. 1 或沈QIDNo. 2;
[0008] 似与沈Q IDNo.1或沈Q IDNo.2互补的DNA片段；
[0009] 做高严谨条件下能够与（1)或似中的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA 片段；
[0010] 所述的高严谨条件是指在0. 5XSSC的溶液中杂交并洗膜； W11] (4)与（1)或似中的DNA序列具有90%W上同源性且具有相同功能的DNA片段。
[0012] 扩增上述启动子全长或任意片段的引物也属于本发明保护的范围，优选的引物 序列如沈QIDNo. 7、沈QIDNo. 8、沈QIDNo. 9、沈QIDNo. 10、沈QIDNo. 11、沈QID No. 12、沈QIDNo. 13、沈QIDNo. 14、沈QIDNo. 15、沈QIDNo. 16、沈QIDNo. 17 或沈Q IDNo. 18 所示。
[0013] 含有上述启动子的重组载体、重组菌、转基因细胞系和表达盒也属于本发明的保 护范围。
[0014] 上述启动子可W应用在植物遗传育种中，用于培育抗草甘麟转基因作物。
[0015] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0016] 功能实验证明，本发明的两种DNA片段SEQIDNo.1和SEQIDNo. 2是启动子片 段，两种片段的核巧酸序列有15个碱基的差异，都能有效地启动下游基因的表达，但含有 SEQIDNo. 2的重组表达载体转入植物细胞后，能提高受体植物对草甘麟的抗药性，在抗草 甘麟转基因植物育种中具有重要应用意义。
【附图说明】
[0017] 图1为牛筋草EPSPS基因组序列扩增产物电泳分析图。
[0018] 图2为EPSPS基因组上游序列扩增产物电泳分析图。
[0019] 图3为沈QIDNo. 1和沈QIDNo. 2核巧酸序列分析及差异比对图。
[0020] 图4为启动子化ro-S和化ro-R片段扩增产物电泳分析图。
[0021] 图5为不同浓度草甘麟对牛筋草EPSPS基因启动子活性影响结果图。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0023] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0024] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 阳〇2引 实施例1 阳〇%] 启动子序列的克隆，包括W下步骤：
[0027] 1)、牛筋草基因组DNA的提取
[0028] 取敏感型牛筋草叶片，加入液氮后充分研磨，将研磨后的粉末倒入1. 5mL离屯、管 中，然后按照植物基因组DNA提取试剂盒（购自TaKaRa公司，产品编号D9194)的操作说明 提取基因组DNA。
[0029] 2)、^il-PCR扩增
[0030] 根据牛筋草EPSPS基因CDNA序列（基因登录号：册403647)设计上下游引物EGF 和EGR，W敏感型牛筋草植物基因组DNA为模板扩增出牛筋草EPSPS基因组片段，命名为 EP-曲NA,测序获得2415bpEPSPS基因组序列（SEQIDNo. 3)，其电泳图片如图1所示。
[0031] 然后根据该基因组核巧酸序列，用引物设计软件primerpremier5.0设计S个特 异性下游引物SPUSP2和SP3,对其上游序列进行化il-PCR扩增，获得片段1后，根据片段 1序列设计下游引物SP4、SP5和SP6继续进行第二次化il-PCR扩增，得到片段2。两次扩 增中用简并引物LADl-I、LAD1-3和ACl作为PCR反应的上游引物。 阳0巧 引物序列如下：
[0033]
[0034] W敏感型基因组DM为模板，利用化il-PCR技术进行EPSPS基因上游调控序列扩 增。 阳03引 ^il-PCR预扩增体系如下：
[0037] 第一轮^il-PCR扩增体系下：
[0039] 第二轮^il-PCR扩增体系如下：
[0041] ^il-PCR反应程序：
[0043] 反应结束后，1 %琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图2所示，回收目的条带。将回 收产物与载体祀337-1'载体连接测序。片段1(126%9)的序列如56〇10齡.4所示，片段 2 (108化P)的序列如沈QIDNo. 5所示。 W44] 利用DNAStar软件将EPSPS基因组序列（SEQIDNo. 3)、启动子片段1(沈QID No. 4)和片段2(SEQIDNo. 5)拼接后显示共获得4244bp核巧酸片段（SEQIDNo. 6)。
[0045] 利用NCBI的BLAST程序对该序列进行比对，结果显示5'端885bp核酸序列未找 到同源序列，剩下的3359bp核酸序列与基因库中牛筋草的EPSPS基因同源性达到99%，表 明该序列片段为牛筋草的EPSPS基因组序列，而5'端885bp核酸序列则为该基因的启动子 序列。
[0046] 根据该启动子序列设计上下游引物Pfull-F:5'--GAATTCGTGACGTGAACGAACTGC AAC-3'6EQIDNo.l5)，Pfull-R:5'-GGTACCGTAGTGGACGTCCTCACTGTT-3'6EQID No. 16)，分别W敏感型和抗型牛筋草基因组DM为模板，克隆牛筋草EPSPS基因上游启动子 片段化ro-S和化ro-R，结果如图3所示，将回收产物与载体祀asy-T载体连接（详细见 pEASY-BluntZeroCloningKit说明书）获得祀asy-邱ro-S和祀asy-邱ro-R，分别转化大 肠杆菌D册a感受态细胞，挑选阳性克隆测序。化ro-S和化ro-R测序结果分别如SEQID No. 1和沈QIDNo. 2所示。 W47]Pfull-F和Pfull-R引物的5'端分别添加限制性内切酶EcoRI(5' -GAATTC-3') 和化nU5' -GGTACC-3')的识别序列。
[0048] PCR反应程序为：95°C预变性 3min;95°C变性 30sec，58°C复性 30sec，72°C延伸 2min，32个循环；最后72°C延伸lOmin。 W例实施例2
[0050] 启动子片段化ro-S和Elpro-R序列分析
[0051] 利用DNAStar软件中的MegAlign模块对Elpro-R/S进行序列比对显示，结果 显示两段序列相似度达到99 %。但与敏感型相比，抗型牛筋草EPSPS基因上游序列 在-427~-