Ubxn1基因启动子区突变位点及其在检测猪肉系水力上的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及UBXNl基因启动子区突变位点及其在检测猪肉 系水力上的应用。
【背景技术】
[0002] 泛素是真核细胞中广泛存在并且序列高度保守的小蛋白，由76个氨基酸残基组 成，它的主要功能是标记需要分解的蛋白质，使其被水解。当附有泛素的蛋白质移动到桶状 的蛋白酶的时候，由泛素-蛋白酶体途径介导使该蛋白质水解。负责执行这个调控过程的 组成成分包括泛素及其启动酶系统和蛋白酶体系统。泛素启动酶系统负责活化泛素，并将 其结合到待降解的蛋白上，形成靶蛋白多聚泛素链，即泛素化。蛋白酶体系统可以识别已泛 素化的蛋白并将其降解。泛素_蛋白酶体途径是较普遍的一种内源蛋白降解方式。不过后 来又发现，并非所有泛素化修饰都会导致降解。有些泛素化会改变蛋白的活性，导致其他的 生物效应。因此，蛋白质的泛素化作为细胞内的一种重要的翻译后修饰，在蛋白质降解和质 量控制、内吞作用、膜泡运输、细胞周期、DNA损伤修复、生长因子信号通路、基因的转录和沉 默等细胞生物学过程中发挥重要作用。此外，细胞内还有另一类解离泛素链分子的去泛素 化蛋白酶形成反向调节。
[0003]在宰后过程中，蛋白质的降解对于系水力水平高低影响是复杂的。一方面，肌肉中 蛋白质的降解会产生静电作用使肌纤维将渗出细胞膜外的水分重新吸收，进而保持一定的 水分，使水分不轻易流失。另一方面，肌肉中蛋白质还能通过自身的降解为水分的储存增加 一定的空间，此时部分水分又再次进入肌原纤维内，从而提高系水力的水平，因此，探讨相 关基因对蛋白质降解的调节作用对于我们研究系水力也相当重要。
[0004]UBXNl(UBXdomain-containingprotein1)位于 2 号染色体，其包含多个数量性 状遗传位点，例如滴水损失、PH、导电性、熟肉率等。我们知道，泛素之所以能发挥如此广泛 而又特异的作用是与泛素结合蛋白家族密切相关的，泛素的结合是由多种类型的泛素结合 结构域介导的，包含UBA(ubiquitin_associateddomain)结构域的蛋白是最大的家族，其 家族成员参与多种生理过程。而我们研究的UBXN1，它的N末端就含有一个可以与泛素结合 的UBA结构域，作为NF-KB信号通路的负调控子；它的C端具有一个与泛素具有弱同源性 的UBX结构域，它能够结合泛素链，通过UBX结构域结合p97,参与泛素蛋白酶体途径的调 控，从而可以调节骨骼肌蛋白质的降解，同时还参与负调控P97依赖的内质网相关的降解， 从而影响到肌肉的系水力水平。
【发明内容】
[0005]UBXNl可以作为一个与系水力相关的候选基因，发明人经过大量创造性劳动，筛选 出影响UBXNl表达的SNP位点，分析了SNP位点与猪系水力相关性，为进一步筛选选育标记 提供理论依据。
[0006] 本发明的目的通过以下技术方案实现
[0007]I.UBXNl基因启动子区突变位点，该突变位点位于UBXNl基因启动子区的转录起 始位点上游379bp处，具有多态性SNP位点，分别为鸟嘌呤G或胸腺嘧啶T。
[0008] 2.上述1提供的突变位点在检测猪肉系水力上的应用，其中，该突变位点为鸟嘌 呤G的样品系水力低于该突变位点为胸腺嘧啶T，根据UBXNl基因启动子区的转录起始位点 上游379bp处的突变位点确定猪肉的系水力情况。
[0009] 3.上述1提供的突变位点在检测猪肉系水力上的应用，该检测方法包括如下步 骤：
[0010] 1)提取待检测猪肉样品的DNA，根据失水率筛选较高个体组和较低个体组样品各 18个，较高组失水率平均值土标准误（0. 3743±0. 0127)，较低组失水率平均值土标准误 (0? 1133±0. 0014)，分别构建DNA样品混池。
[0011] 2)以引物对：UBXNl-IF和UBXN1-1R、UBXN1-2F和UBXN1-2R、UBXN1-3F和 UBXN1-3R、UBXN1-4F和UBXN1-4R;对步骤1)获得的DNA进行PCR扩增，获得扩增片段；
[0012] 3)对扩增片段进行测序，测序由苏州金唯智生物科技有限公司进行；
[0013] 4)分析测序结果，较高组混池测序后UBXNl基因启动子区的转录起始位点上游 379bp处鸟嘌呤G占优势，较低组混池测序后胸腺嘧啶T占优势，也就是说如果位于UBXNl 基因启动子区的转录起始位点上游379bp处的位点为鸟嘌呤G，则该待检测猪肉样品具有 相对较高的失水率，则说明该样品系水力水平较低；如果379bp处的位点为胸腺嘧啶T，则 该待检测猪肉样品具有相对较低的失水率，则说明该样品系水力水平较高；
[0014]其中，UBXNl-IF序列如：5'CATGAGGmTGGGITCGAT3'，
[0015]UBXNl-IR序列如：5'GGGmGCITTCTGAGGGA3' ；
[0016]UBXN1-2F序列如：5，GGGCTAAGCAGTCAACAA3'，
[0017]UBXN1-2R序列如：5'CTCCGTGAGAAGITCCTGT3' ；
[0018]UBXN1-3F序列如：5'CCAACGGAACGGCATCT3'，
[0019]UBXN1-3R序列如：5'AGCCAGITCCCGATACGAC3' ；
[0020] UBXN1-4F序列如：5，CAGAGGATGAGCAGGTCAAAGA3'，
[0021] UBXN1-4R序列如：5'CGGAAGTGCCCGAATCTGT3'。
[0022] 4.权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤2)中PCR扩增反应50yL体系： 2XrTaq混合物 25yL、上下游引物各 2. 5yL、待检测DNA2. 5yL、ddH2017. 5yL;
[0023]PCR反应程序：94°C5min;94°C30s、58-68°C30s退火、72°C30s、35 个循环； 72°C7min；
[0024] 5.权利要求4所述的应用，其特征在于：PCR反应程序中，退火温度为：引物对 UBXNl-IF和UBXNl-IR58。(：；引物对UBXN1-2F和UBXN1-2R6(TC;UBXN1-3F和UBXN1-3R 62°C;UBXN1-4F和UBXN1-4R68°C。
[0025] 6.-种判断猪肉系水力的方法，其特征在于，该检测方法包括如下步骤：
[0026] 1)提取待检测猪肉样品的DNA;
[0027] 2)以引物对：(PU-F和PU-R对步骤1)获得的DNA进行PCR扩增，获得扩增片段；
[0028] 3)利用PCR-SSCP的方法分型，再挑选不同基因型样品进行测序鉴定。
[0029] 5)根据PCR-SSCP分型结果，分析猪肉系水力，在UBXNl基因启动子区的转录起始 位点上游379bp处基因型与失水率的关系为：GG型失水率（0. 2354±0. 02007)高于GT型 (0? 1973±0.01132)，GT型（0? 1973±0.01132)失水率高于IT型（0? 1878±0.01146)，以此 选择系水力尚的猪肉样品。
[0030]其中，PU-F的序列如：5'GGGCGGAGGATGGCTCAACT3'
[0031]PU-R的序列如：5'GCCACCGCTCCACATCCTCA3'
[0032] 7.权利要求6所述的应用，其特征在于：步骤2)中PCR扩增反应20yL体系： 2XrTaq混合物10yL、上下游引物各IyL、待检测DNAlyL、CldH2O7yL;
[0033]PCR反应程序：94°C5min;94°C30s、68°C30s退火、72°C30s、35 个循环； 72°C7min；
[0034] 8.权利要求7所述的应用，其特征在于：PCR反应程序中，退火温度为：引物对 PU-F和PU-R68 °C。
[0035] 有益效果
[0036]系水力的高低不仅会影响肉的水分含量、营养含量、肉的色泽等肉品质量，从而影 响了鲜肉的感官品质和食用品质，而且由于系水力较差的原因，在猪肉的生产、运输过程中 将会造成严重的重量损失、经济损失，所以提高系水力水平具有重要的经济意义。
[0037] 本发明通过在候选基因UBXNl启动子区筛选与失水率性状相关的SNP位点，并扩 大样本量进行基因分型验证，将各个基因型与失水率性状进行相关分析，确定基因型与失 水率性状之间关联性程度高低，从而获得与系水力性状相关的功能基因或分子遗传标记。
【附图说明】
[0038] 图1猪肉失水率分组比较图
[0039] 图2UBXNl分别在失水率高低组mRNA表达水平
[0040] 图3转录起始位点上游379bp处SNP突变位点模式
[0041] 其中，A图是失水率H组突变位点模式，该位点为G;B图是失水率L组突变位点模 式，该位点为T
[0042] 图4突变位点基