一种水稻金属硫蛋白基因OsMT2bL启动子及其应用

一种水稻金属硫蛋白基因OsMT2bL启动子及其应用【专利摘要】本发明涉及一种水稻金属硫蛋白OsMT2bL基因启动子及其应用。该启动子通过采用PCR技术从“水稻黎榆B(OryzasativaL.ssp.japonicaC.V.LiyuB)”基因组中克隆得到一个植物MT?2类基因Metallothionein2b?Like(OsMT2bL)的启动子序列，全长2063bp，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。该启动子驱动GUS基因的表达活性比CaMV35S基因启动子高出3倍以上。本发明水稻金属硫蛋白OsMT2bL基因启动子pMT2bL可应用于植物转基因工程及作物分子改良育种领域。【专利说明】一种水稻金属硫蛋白基因0sMT2bL启动子及其应用
技术领域：
[00011本发明属植物基因工程
技术领域：
，具体地涉及水稻金属硫蛋白0sMT2bL基因启动子及其应用，尤其是在植物组织中启动表达目的基因的用途。【
背景技术：
】[0002]水稻(OryzasativaL.)作为一种重要的模式植物，其遗传发育模式的基因表达调控一直是研究的热点。金属硫蛋白（metallothionein，MT)是一类富含半胱氨酸的蛋白，具有结合金属离子的能力，参与调控细胞内金属的代谢平衡和解毒。由于植物MT基因具有组织表达特异性、发育阶段特异性以及高效的可诱导性，人们对植物MT基因的表达调控及其功能的研究越来越重视。金属硫蛋白广泛存在于生物体内，具有结合金属离子的能力，参与调控细胞内金属的代谢平衡和解毒，不同的MT基因的启动子可以受到不同的金属离子调控其活性水平。最新研究发现(YuanJ.，etal.，Characteristicandexpressionanalysisofametallothioneingene,0sMT2b,down-regulatedbycytokininsuggestsfunctionsinrootdevelopmentandseedembryogerminationofrice,PlantPhysiology,2008,146(4):1637-1650；ffuC.S.etal.,Thepromoterandthe57-untranslatedregionofricemetallothionein0sMT2bgenearecapableofdirectinghigh-levelgeneexpressioningerminatedriceembryos，PlantCellReports，2014,33(5):793-806)，水稻0sMT2b基因启动子的不同区间在调控0sMT2b基因在不同组织中的表达发挥重要作用；而且该基因还参与了植物体内细胞分裂素的调控，因此0sMT2b基因启动子具有组织特异性表达的特性，其活性很有可能还受到植物激素的调控。[0003]金属硫蛋白MT基因启动子属于诱导型启动子，可以被二价金属离子诱导，如络、锌等。Robinson在大肠杆菌中进行了拟南芥MT2的表达，发现MT2具有结合Zn2+的能力(RobinsonN.B.,etal.,Ventilation-perfusionrelationshipsafterhemorrhageandresuscitation:aninertgasanalysis,JournalofAppliedPhysiology?1983?54[4]:1131-1140);Zhou等人研究水稻OsMT-la基因发现该基因可以被出〇2、？?1\5即、乙烯利、脱落酸等诱导表达（ZhouG.K.，etal.，CharacterizationofariceclassIImetallothioneingene:tissueexpressionpatternsandinductioninresponsetoabioticfactors，JournalofPlant卩1178；!_〇1〇87,2005，162(6):686-696)。有研究者从水稻胚乳cDNA文库中克隆了一个编码80个氨基酸的ricMT基因（LiuJ.，etal.，AnalysisofrandomlyisolatedcDNAsfromdevelopingendospermofrice(0ryzasativaL.)：evaluationofexpressedsequencetags,andexpressionlevelsofmRNAs，PlantMolecularBiology?1995?29(4)：685-689；YuL.H.etal.,AnovelMTgeneofriceplantsisstronglyexpressedinthenodeportionofthestem,Gene,1998,206(1):29-35)，RNA杂交表明其在水稻茎部高效特异表达，其表达量是叶片中的100多倍，推测ricMT基因的5'-上游存在一个高效特异表达的启动子;计算机同源分析显示，ricMT基因5'-上游区域的TATA-box(TATAAA)位于2935bp处，CAAT-box(CCAAT)位于2754bp处;特别值得注意的是，在该基因2739bp处(ATG上游300bp左右)存在着一段与动物典型的金属应答元件(1^七31-代8口〇118；!_￥661611^1^，]\11^)高度同源的序列（16060606)(余蒸华等，水稻金属硫蛋白核基因的克隆及其序列特征，科学通报，1999,44(15):1645-1648)。[0004]MT基因的启动子部分含有多个金属应答元件(metal-responsiveelement，MRE)和激素应答元件（glucolorticoidresponsiveelement，GER)DMER的通用序列为TGCRCNCX(其中1?=6/^;)(=6/(：;~=六八/6/〇。比如，果蝇11'基因中的]^1?序列为了60六(：1^;水稻]?1'基因中的MER序列为TGCGCGCG。已经有直接证据表明MT-like基因的表达需要顺式作用元件的参与调控。Fcmiham-Sketon等人研究PsMTA基因启动子表明，-583到-285区域负责调控β-葡萄糖醛酸酶(GUS)在根中的表达，在这段300bp左右的序列中存在三个拷贝的乙烯应答元件(EREs;ATTCAA)(Fordham-SkeltonA.P.?etal.，GUSexpressioninArabidopsisdirectedby57-regionsofthepeametallothionein-1ikegenePsMTA,Plantmolecularbiology，1997,34(4):659-668)。有趣的是，研究者们发现，到目前为止，所有被鉴定出来的植物MT-like基因中至少存在一个ERE，还包括大麦B22E基因（KlemsdalS.S.，etal.,Primarystructureofanovelbarleygenedifferentiallyexpressedinimmaturealeuronelayers，MolecularandGeneralGeneticsMGG,1991,228(1-2):9-16)和番前LeMTB基因（WhitelawC.A.，etal.，TheisolationandcharacterisationoftypeIImetallothionein-1ikegenesfromtomato(LycopersiconesculentumL.),PlantMolecularBiology，1997，33(3):503-511hMT-like基因启动子中的一个根特异表达元件（root-specificelement，RSE)分别在碗豆（Fordham-SkeltonA.P.，etal.，GUSexpressioninArabidopsisdirectedby57-regionsofthepeametallothionein-likegenePsMTA，Plantmolecularbiology，1997,34(4):659-668)、玉米（DeFramondA.J.,Ameta11othionein-1ikegenefrommaize(Zeamays)C1oningandcharacterization，FEBSletters，1991，290(1):103-106)和棕榈中被鉴定（AbdullahS.N.A.,etal·，Isolationandcharacterisationoftwodivergenttype3metallothioneinsfromoilpalm,Elaeisguineensis.PlantPhysiologyandBiochemistry，2002，40(3):255-263)〇[0005]虽然，已经有多种植物的MT基因5'-上游区域被克隆出来，但是目前对于植物MT基因启动子的研究主要还停留在MT基因的组织表达水平检测方面（GuoW.J.，etal.，CharacterizationoftheArabidopsismetallothioneingenefami1：tissue-specificexpressionandinductionduringsenescenceandinresponsetocopper,NewPhytologist,2003,159(2):369-381；ChatthaiM.,etal.,FunctionalanalysisofaDouglas-firmetallothionein-likegenepromoter:transientassaysinzygoticandsomaticembryosandstabletransformationintransgenictobacco，Planta，2004,220(l):118_128;FukuzawaH.，etal·，Thericemetallothioneingenepromoterdoesnotdirectforeigngeneexpressioninseedendosperm,Plantcellreports，2004,23(4):231-235;LiiS.，etal·，TheGUSreporter-aidedanalysisofthepromoteractivitiesofaricemetallothioneingenerevealsdifferentregulatoryregionsresponsiblefortissue-specificandinducibleexpressionintransgenicArabidopsis，TransgenicResearch，2007，16(2):177-191)。对转基因（OsMT2b::GUS)水稻植株组织化学分析表明，种子发芽阶段，OsMT2b基因启动子在幼苗分生组织、种子的胚中表现出较高活性;对启动子序列研究发现，OsMT2b基因启动子5'-上游区域-351到-121之间含有G-box和TA-box的一致序列，主要调控启动子在水稻胚中的高活性表达（WuC.S.，etal.，Thepromoterandthe5~untranslatedregionofricemetallothionein0sMT2bgenearecapableofdirectinghigh-levelgeneexpressioningerminatedriceembryos,PlantCellReports，2014,33(5):793-806)。因此，0sMT2b基因启动子在根的发育以及种子胚的发育和生长阶段起着重要的调控作用。[0006]Yuan等人报道了OryzasativaMETALL0THI0NEIN2b(0sMT2bL)和OryzasativaMETALL0THI0NEIN2bLIKE(0sMT2bL)两个基因。氨基酸序列比对分析发现，0sMT2bL和0sMT2b氨基酸序列仅仅在第21个氨基酸位置不同，0sMT2b第21个氨基酸为丝氨酸(Ser)，而0sMT2bL第21个氨基酸为甘氨酸(Gly);多重序列比对分析表明，0sMT2bL、0sMT2b以及其他MT-2型蛋白包含两个富含半胱氨酸(Cys)的结构域，中间被40个氨基酸残基隔开;N-末端结构域存在高度保守序列(MSCCGGNCGCGS)，C-末端结构域包含三个Cys-X-Cys结构基元(YuanJ.，etal.,Characteristicandexpressionanalysisofametallothioneingene，0sMT2b,down-regulatedbycytokininsuggestsfunctionsinrootdevelopmentandseedembryogerminationofrice，PlantPhysiology，2008,146(4):1637-1650)。到目前为止，关于水稻金属硫蛋白基因0sMT2bL启动子pMT2bL克隆和相关特性的鉴定还未见报道。[0007]目前，基因工程中被广泛使用的启动子主要有来自花椰菜花叶病毒的CaMV35S组成型启动子和来自植物的Actl、Ubi-l等组成型启动子。由于组成型启动子驱动基因在植物不同组织器官中均有不同程度的表达，而很多时候，人们并不希望外源基因在转基因植物的整个生长发育期的整个植株中表达，外源蛋白不仅增加植物代谢负担，而且有些外源蛋白对植物本身具有毒害作用，不利于植物的正常生长（KasugaM.，etal.，Improvingplantdrought,salt,andfreezingtolerancebygenetransferofasinglestress-inducibletranscriptionfactor,NatureBiotechnology，1999，17(3):287-291)。因此，研究和利用组织器官特异性启动子和诱导型启动子具有非常重要的意义。【
发明内容】[0008]本发明的目的在于提供水稻金属硫蛋白基因0sMT2bL启动子pMT2bL及其应用。[0009]本发明的技术方案如下：[0010]1.一种水稻金属硫蛋白0sMT2bL基因启动子pMT2bL，其核苷酸序列如SEQIDN0:1所示。[0011]2.-种水稻金属硫蛋白0sMT2bL基因启动子pMT2bL，其特征在于，所述水稻金属硫蛋白0sMT2bL基因启动子pMT2bL为：[0012](a)技术方案1所述的一种水稻金属硫蛋白0sMT2bL基因启动子pMT2bL所示的核苷酸序列中取代一个或一个以上核苷酸后所获得的且具有启动子功能的核苷酸序列；[0013]或者(b)技术方案1所述的一种水稻金属硫蛋白0sMT2bL基因启动子pMT2bL所示的核苷酸序列中添加一个或一个以上核苷酸后所获得的且具有启动子功能的核苷酸序列；[0014]或者(C)技术方案1所述的一种水稻金属硫蛋白0sMT2bL基因启动子pMT2bL所示的核苷酸序列缺失一个或一个以上核苷酸后所获得的且具有启动子功能的核苷酸序列；[0015]或者(d)技术方案1所述的一种水稻金属硫蛋白0sMT2bL基因启动子pMT2bL所示的核苷酸序列具有至少90%同源性，且具有启动子功能的核苷酸序列；[0016]或者(e)技术方案1所述的一种水稻金属硫蛋白0sMT2bL基因启动子pMT2bL所示的核苷酸序列杂交且具有启动子功能的核苷酸序列。[0017]3.技术方案1或2所述的一种水稻金属硫蛋白0sMT2bL基因启动子pMT2bL在改良植物生长特性的应用。[0018]4.技术方案3所述的一种水稻金属硫蛋白0sMT2bL基因启动子pMT2bL在改良植物生长特性的应用指在水稻营养生长与生殖生长阶段，用于改良作物感光或感温特性。[0019]5.技术方案1或2所述的一种水稻金属硫蛋白0sMT2bL基因启动子pMT2bL在植物基因工程中的应用。[0020]6.技术方案5所述的一种水稻金属硫蛋白0sMT2bL基因启动子pMT2bL在植物基因工程中的应用指用于开发单子叶植物中高启动效率的启动子用于基因表达研究。[0021]7.技术方案1或2所述的一种水稻金属硫蛋白0sMT2bL基因启动子pMT2bL在作物分子改良育种中的应用。[0022]8.技术方案7所述的一种水稻金属硫蛋白0sMT2bL基因启动子pMT2bL在作物分子改良育种中的应用指用于转基因水稻育种研究中，功能基因的高效表达应用。[0023]与现有技术相比，本发明的有益效果：[0024]经⑶S报告基因分析实验证明：本发明水稻金属硫蛋白基因0sMT2bL启动子pMT2bL的表达活性是CaMV35S基因启动子的3倍还多，而且在水稻的营养生长和生殖生长阶段的组织器官中高效表达。因此，本发明水稻金属硫蛋白0sMT2bL基因启动子pMT2bL的克隆及验证，在理论上将为研究水稻金属硫蛋白0sMT2bL基因的表达调控机理提供良好的实验基础；在应用方面为利用本发明水稻金属硫蛋白基因0sMT2bL启动子pMT2bL构建表达载体高效表达外源基因创造了条件；另外，也为研究本发明水稻金属硫蛋白基因0sMT2bL启动子pMT2bL可能具有的特异表达性和诱导表达性的研究创造了实验基础，具有重要的理论意义和潜在的应用价值。[0025]序列表中SEQIDN0:1所示的是水稻金属硫蛋白基因0sMT2bL启动子pMT2bL的核苷酸序列。[0026]SEQID从):2所示的是引物阶2131^+的碱基序列。[0027]SEQID从):3所示的是引物阶2131^-1?的碱基序列。[0028]SEQID从):4所示的是引物113+的碱基序列。[0029]SEQID从):5所示的是引物113-郎勺碱基序列。[0030]SEQID从):6所示的是(；1^表达载体特异性引物即61]869-31?的碱基序列。[0031]SEQID从):7所示的是引物》^3+的碱基序列。[0032]SEQID从):8所示的是引物》^3-1?的碱基序列。[0033]SEQID从):9所示的是引物(；1]5]\^3+的碱基序列。[0034]SEQID从):10所示的是引物(；1]5]\^3-1?的碱基序列。【附图说明】[0035]图1是基于水稻雌性不育突变体（fst)基因芯片数据对水稻基因Ubiquitinl(UBIl)、0sCcl(CYC)、0sRAcl(ACTl)、G0S2和0sMT2bL在不同发育时期表达水平的分析结果图。图1中横坐标表示不同的三个发育时期，ME1表示减数分裂期，JBF指颖花即将开放的时期，5DAP表示开花后5天;纵坐标表示基因的表达量;图1中，一·-表示UBI1，一》^表示CYC，[0036]表示ACT1，表示G0S2，一表示MT2bL。[0037]图2是PCR扩增水稻金属硫蛋白基因0sMT2bL启动子pMT2bL电泳结果图。图中Μ表示DNAMarker;pMT2bL表示水稻金属硫蛋白基因0sMT2bL的启动子pMT2bL。[0038]图3是水稻金属硫蛋白基因0sMT2bL及其启动子pMT2bL的结构示意图。[0039]图4是克隆载体上标记基因的PCR检测结果，其中：a图是农杆菌阳性克隆潮霉素抗性基因位点的PCR检测结果图。a图中CK1为空白对照ddH20;CK2为阳性对照GUS载体质粒DNA;泳道1至泳道12为不同的农杆菌阳性单克隆，泳道1为农杆菌阳性单克隆-1，泳道2为农杆菌阳性单克隆-2，泳道3为农杆菌阳性单克隆-3，泳道4为农杆菌阳性单克隆-4，泳道5为农杆菌阳性单克隆-5,泳道6是为农杆菌阳性单克隆-6,泳道7为农杆菌阳性单克隆-7,泳道8为农杆菌阳性单克隆_8,泳道9为农杆菌阳性单克隆-9,泳道10为农杆菌阳性单克隆-10，泳道11为农杆菌阳性单克隆-11，泳道12为农杆菌阳性单克隆-12;M为DNAMarkerj图是转基因To植株GUS报告基因位点的PCR检测结果图。b图中CK1和CK2为阳性对照，分别为DTG4065和GUS表达载体质粒DNA;CK3和CK4为空白对照，分别为LiyuB和ddH20;泳道1至4为转基因植株AT45(pCYC::GUS);泳道5至8为转基因植株AT49(pACTl::⑶S);泳道9至12为转基因植株AT50(pMT2bL::GUS));Μ为DNAMarker。c图是转基因T!代植GUS报告基因位点的PCR检测结果图。图中CK1和CK2为阳性对照，分别为DTG4065和GUS表达载体质粒DNA;CK3和CK4为空白对照，分别为LiyuB和ddH20;泳道1至3为转基因植株DTG4065(pCaMV35S::GUS);泳道4至5为转基因植株AT44(pUbi1::GUS);泳道6至7为转基因植株AT45(pCYC::GUS);泳道8至9为转基因植株AT49(pACTl::GUS);泳道10至13为转基因植株AT50(pMT2bL::⑶S);M为DNAMarker〇[0040]图5-图10中，箭头所指部分为GUS组织化学染色较深部分，染色越深表明启动子在该部位活性越强，启动效率越高。[0041]图5为To代转基因植株减速分裂期(ME1)叶片的GUS组织化学染色结果。图中从左至右，左边第一幅图是1^7此为空白对照；然后依次为转基因植株0164049(?0&1^355::GUS)、AT50(pMT2bL::⑶S)和AT47(pG0S2::⑶S)的叶片，其中转基因植株DTG4049和AT47做为阳性对照植株;标尺大小为1ΟΟμπι。[0042]图6为To代转基因植株减速分裂期(ΜΕ1)颍花的GUS组织化学染色结果。图中a和b为阳性对照植株DTG4049(pCaMV35S::⑶S);f和g为阳性对照植株AT47(pG0S2::⑶S);c和d为转基因植株AT50(pMT2bL::⑶S);e为转基因植株AT50开花后10天（10DAP)的未成熟种子。图中b、d和g为水稻颍花去掉一半颖壳后的内部结构。标尺大小为100μπι。[0043]图了为!^代转基因植株种子幼苗期幼苗胚芽(a~g)的GUS组织化学染色结果。a为空白对照LiyuB;b至g分别为转基因植株DTG4065(pCaMV35S::GUS)、AT50(pMT2bL::GUS)、AT44(pUbil::⑶S、AT45(pCYC::GUS)、AT47(pG0S2::⑶S)和AT49(pACTl::⑶S)的幼苗胚芽；标尺大小为100μπι。[0044]图8为1^代转基因植株种子幼苗期幼苗胚芽鞘(h~η)的⑶S组织化学染色结果。h为空白对照LiyuB;i至η分别为转基因植株DTG4065(pCaMV35S::⑶S)、AT50(pMT2bL::⑶S)、AT44(pUbil::⑶S)、AT45(pCYC::GUS)、AT47(pG0S2::⑶S)和AT49(pACTl::⑶S)的幼苗胚芽鞘;标尺大小为100μπι。[0045]图9为1^代转基因植株种子幼苗期幼苗的胚和胚乳(〇~u)的GUS组织化学染色结果，〇为空白对照LiyuB;p至u分别为转基因植株DTG4065(pCaMV35S::GUS)、AT50(pMT2bL::⑶S)、AT44(pUbil::GUS)、AT45(pCYC::GUS)、AT47(pG0S2::⑶S)和AT49(pACTl::⑶S)的幼苗的胚和胚乳;标尺大小为100μπι。[0046]图lOSh代转基因植株种子幼苗期幼苗根尖(al~gl)的GUS组织化学染色结果，al为空白对照LiyuB;bl至gl分别为转基因植株DTG4065(pCaMV35S::GUS)、AT50(pMT2bL::⑶S)、AT44(pUbil::GUS)、AT45(pCYC::GUS)、AT47(pG0S2::⑶S)和AT49(pACTl::⑶S)的幼苗的根尖;标尺大小为1ΟΟμπι。[0047]图11为!^代转基因植株幼苗叶片中GUS蛋白表达活性的荧光定量检测结果。横坐标表示不同的启动子，横坐标从左至右的启动子依次是空白对照LiyuB，阳性对照DTG4065，转基因植株AT44，AT45，AT49，AT47，AT50;LiyuB为空白对照，GUS蛋白表达活性为0;DTG4065(pCaMV35S::GUS)作为阳性对照，定义其GUS蛋白表达量为100。纵坐标表示GUS蛋白的活性。[0048]图12为融合表达载体pMT2bL::⑶S结构图及其限制内切酶位点。（KmR:卡那霉素抗性基因；pVSlrep，pVSlsta分别是pVSl质粒复制增强子序列和复制起始区；Spel和Hindlll之间的区域为0sMT2bL基因启动子;GusPlus为⑶S报告基因。【具体实施方式】[0049]以下结合实施例及附图对本发明做进一步详细描述。以下各实施例所用的载体、引物、试剂、水稻等材料均为市售，各实施例无特殊说明为常规方法。[0050]实施例1:水稻金属硫蛋白0sMT2bL基因启动子pMT2bL的克隆及序列分析[005111.根据基因芯片分析水稻不同发育时期基因表达量结果（图1)，参考改进的CTAB法（（Murrayetal.，1980)提取水稻黎输B(0ryzasativaL.ssp.japonicaC.V.LiyuB)的基因组DNA。在GenBank数据库（http://www.ncbi·nlm.nih·gov/genbank/)上，查询基因0sMT2bL全长序列（GenBank:EF533993·1)，并在NetGene2网站（http://www·cbs·dtu·dk/861^；[068/如七661162/)上，对08]\^2131^基因5'-1]11?上游序列进行预测，用。1'；[11161'-131已8七(http://www·ncbi·nlm.nih·Gov/tools/primer-blast/Index·)设计引物（0sMT2bLP_F/R)扩增0sMT2bL基因5'-UTR上游区域序列，并在正反向引物序列5'端引入限制性内切酶位点。结果如图2、图3所示，图2表明目的序列PCR扩增片段大小为2000bp左右。所述引物MT2bLP-F/R由引物MT2bLP-F和引物MT2bLP-R组成，所述引物MT2bLP-F的碱基序列如SEQIDN0:2所示，所述引物MT2bLP-R的碱基序列如SEQIDN0:3所示。PCR体系（25yL)及反应程序为：10XLAPCRBuffer2.50yL，2.5mmol/LdNTPmixture2.00yL，MT2bLP-F0.20yL，MT2bLP-R0·20yL，Anti-Taq0·20yL，LATaq(5U/yL)0·20yL，DNA模板（水稻LiyuB基因组DNA)0·50yL，ddH20补充到25.00yL;94°C预变性5min，从94°C变性308,60°(：退火308,72°(：延伸31^11运行35个循环，72°C延伸15min后4°C保存。PCR产物回收纯化后经连接反应连接到y&TA克隆载体，使用PDRAW321.1.107软件构建质粒酶切图谱，根据图谱所示酶切位点选择限制性内切酶进行酶切(37°C适温酶切消化质粒2~4hr)，l%琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段大小，筛选正向插入片段阳性克隆。图3为水稻金属硫蛋白OsMT2bL基因及其启动子pMT2bL的结构简图。[0052]2.使用通用引物M13-F/R对y&TA正向阳性克隆载体质粒进行双向测序，在Blast(http://blast.ncbi.111111.11；[11.80￥/13]^1:.〇8；〇中进行序列比对，确定克隆得到的0嫩片段为水稻金属硫蛋白基因0sMT2bL上游的启动子区域，全长为2063bp。在PLACE和PlantCARE数据库对本发明水稻金属硫蛋白基因0sMT2bL的启动子pMT2bL区域的顺式作用元件进行分析预测。上述克隆的本发明水稻金属硫蛋白基因0sMT2bL的启动子pMT2bL的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。上述引物M13-F/R由引物M13-F和引物M13-R组成，所述引物M13-F的碱基序列如SEQIDN0:4所示。所述引物M13-R的碱基序列如SEQIDN0:5所示。[0053]实施例2本发明水稻金属硫蛋白0sMT2bL基因启动子pMT2bL的⑶S融合表达载体的构建[0054]使用限制性内切酶SpeI和HindllI酶切经蓝白斑筛选得到的y&TA克隆阳性载体质粒，回收酶切目的片段(2063bp);另外，同样用Spel和Hindlll酶切pCAMBIA1305双元表达载体后回收表达载体片段（l〇926bp，图2);最后，通过连接反应将二者融合成融合表达载体，艮PpMT2bL::GUS融合表达载体，使用pDRAW32软件(pDRAW321.1.107)构建质粒酶切图谱如图12所示。根据酶切图谱对构建的载体进行酶切检测，且以GUS表达载体特异性引物HPGUseq-3R对pMT2bL::GUS融合表达载体进行测序。GUS表达载体特异性引物HP⑶seq-3R的碱基序列如SEQIDN0:6所示。[0055]实施例3水稻遗传转化及转基因植株的获得[0056]将水稻金属硫蛋白0sMT2bL基因启动子pMT2bL的⑶S融合表达载体质粒导入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105感受态细胞，根瘤农杆菌EHA105感受态细胞由本实验室用购买的Transgene公司的EHA105菌株，参考魏綺超的方法(魏?奇超等，根癌农杆菌感受态细胞的制备及保存方法研究[J].安徽农业科学，2009，37(14):6342-6343)自行制备，-80°C冰箱保存。并对导入融合表达载体的根癌农杆菌进行菌落PCR检测，引物为融合表达载体的特异引物HmMAS-F/R，PCR体系（15yL)及反应程序为：10XBuffer(NH4)2S〇4)1.50yL,2.5mmol/LdNTPmixture1.20yL,25mMMgCl20.90yL,MT2bLP-F0.12yL,MT2bLP-R0·12yL，Taq(5U/yL)0·12，DNA模板（单克隆菌落)0·1OyL，ddH20补充到15·OOyL,94°C预变性5min，从94°C变性20s，60°C退火20s，72°C延伸20s运行30个循环，72°C延伸lOmin后4°C保存。检测结果如图4-a，表明PCR扩增片段大小为392bp左右，能扩增出该条带的菌落为转基因阳性克隆。经过菌落PCR检测后的根癌农杆菌恒温震荡培养(28°C，150r/min)后，介导转化水稻黎榆B(0ryzasativaL.ssp.japonicaC.V.LiyuB)胚性愈伤组织，具体方法参照Hiei等（1994)。成熟的黎榆B(LiyuB)种子去壳后，经70%乙醇消毒3min，50%次氯酸钠(加入0.05%的Tween-20)消毒lOmin后，再用50%次氯酸钠消毒3〇111；[11;然后用灭菌的(1(1!120漂洗数次，直至次氯酸钠溶液的味道消失，充分晾干种子后接种到N6D愈伤诱导培养基上，28°C培养箱中避光培养30天，挑取色泽鲜亮、呈圆形或椭圆形颗粒状的胚性愈伤组织接种于新的N6D愈伤诱导培养基上，预培养2~3天后，用于农杆菌介导的遗传转化。所述特异引物HmMAS-F/R由引物HmMAS-F和引物HmMAS-R组成，引物HmMAS-F的碱基序列如SEQIDN0:7所示，引物HmMAS-R的碱基序列如SEQIDN0:8所示。[0057]利用融合表达载体上报告基因⑶S的特异性引物(GUSMAS-F/R)对转基因再生株系进行叶片PCR鉴定，筛选转基因阳性植株(如图4-b和图4-c)。图4-b表明PCR扩增片段大小为382bp左右，能扩增出该条带的转基因To植株为阳性。图4-c也表明PCR扩增片段大小为382bp左右，能扩增出该条带的转基因T!植株为阳性。PCR体系（15yL)及反应程序为：10XBuffer((NH4)2S〇4)l.50yL,2.5mmol/LdNTPmixture1.20yL,25mMMgCl20.90yL,GUSMAS-F0·12yL，⑶SMAS-R0·12yL，Taq(5U/yL)0·12yL，DNA模板(转基因植株叶片）0·1μL，ddH20补充到15.00yL，94°C预变性5min，从94°C变性20s，60°C退火20s，72°C延伸20s运行30个循环，72°C延伸lOmin后4°C保存。所述特异性引物⑶SMAS-F/R由引物GUSMAS-F和引物⑶SMAS-R组成，引物⑶SMAS-F的碱基序列如SEQIDN0:9所示，引物⑶SMAS-R的碱基序列如SEQIDNO:10所示。[0058]实施例4本发明水稻金属硫蛋白0sMT2bL基因启动子pMT2bLGUS表达活性的检测[0059]1.转基因水稻植株的GUS组织化学染色[0060]剪取实施案例3获得的转基因To植株减速分裂期的叶片、颍花(Floret)和开花后10天的未成熟种子进行GUS染色，结果如图5和图6。图5表明除野生型LiyuB空白对照外，其他转基因植株叶片组织均有不同程度的GUS显色（图5从左往右依次为LiyuB，DTG4049，八丁5〇4了47)，〇81?'21^基因启动子?1?'2此高水平的61^表达活性则在几乎整个叶片中检测到，在叶片横向创口处也表现出较强的GUS表达活性，且GUS表达活性明显高于pCaMV35S启动子表达活性。图6表明对转基因To植株减速分裂期的颍花（Floret)进行GUS染色，pCaMV35S(图6-a，b)、pMT2bL(图6-c，d，e)和pG0S2(图6-f，g)三个启动子在颍壳均检测到GUS基因的高表达活性;对转基因植株AT50(pMT2bL::GUS)开花后10天的未成熟种子进行GUS染色表明，pMT2bL启动子在开花后种子的发育阶段也有高水平的表达活性。[0061]另外，对实施案例3获得的h代种子幼苗期的植株进行GUS染色，结果如图7至10。图7至10表明本发明水稻金属硫蛋白基因0sMT2bL启动子pMT2bL与空白对照和阳性对照相比较，分别在水稻幼苗的胚芽（图7-a~g)、胚芽鞘（图8-h~n)、胚和胚乳（图9-〇~u)以及根尖（图10-&1~81)部位均有高水平的表达活性。GUS染色方法参照RichardA.Jefferson(1987)方法（Jeffersonetal.，1987)〇[0062]2.转基因水稻植株的⑶S荧光定量检测[0063]用黎榆B(0ryzasativaL.ssp.Japonica，LiyuB)作为空白对照，纯合转基因植株DTG4065(pCaMV35S::⑶S)作为阳性对照，且将其⑶S的表达量定义为100。收集实施案例3获得的转基因Τι代幼苗期植株的新鲜叶片50mg，加入250yL事先预冷的GUSExtractionBuffer后，立即将叶片研磨至衆液；12000rpm，4°C离心10min，收集200yL上清液于新的离心管中，再次离心后，收集150yL植物总蛋白提取液(上清液)于新的离心管中，4°C保存。取50μL蛋白提取液加入到37°C预热的500yLAssayBuffer中，37°C水浴30min后，立即加入900yL的反应终止溶液(0.2MNa2C03)终止反应进行。然后测定波长为455nm下的吸光度，记录数据并统计分析，结果如图11。图11表明启动子pUbil、pCYC、pACTl、pG0S2、pMT2bL驱动⑶S基因表达蛋白活性的平均值分别为539、357.5、449、301.5和313。本发明水稻金属硫蛋白基因0sMT2bL启动子pMT2bL在转基因1^代幼苗叶片中⑶S基因的表达活性比CaMV35S基因启动子的3倍还多。GUS焚光定量测定详细参照SeanR.Gallagher(1992)、RichardA·Jefferson(1987)提出的方法。【主权项】1.一种水稻金属硫蛋白0sMT2bL基因启动子pMT2bL，其核苷酸序列如SEQIDN0:l所不。2.-种水稻金属硫蛋白OsMT2bL基因启动子pMT2bL，其特征在于，所述的水稻金属硫蛋白OsMT2bL基因启动子pMT2bL包含：(a)权利要求1所述的一种水稻金属硫蛋白OsMT2bL基因启动子pMT2bL所示的核苷酸序列中取代一个或一个以上核苷酸后所获得的且具有启动子功能的核苷酸序列；或者(b)权利要求1所述的一种水稻金属硫蛋白OsMT2bL基因启动子pMT2bL所示的核苷酸序列中添加一个或一个以上核苷酸后所获得的且具有启动子功能的核苷酸序列；或者(c)权利要求1所述的一种水稻金属硫蛋白OsMT2bL基因启动子pMT2bL所示的核苷酸序列缺失一个或一个以上核苷酸后所获得的且具有启动子功能的核苷酸序列；或者(d)权利要求1所述的一种水稻金属硫蛋白OsMT2bL基因启动子pMT2bL所示的核苷酸序列具有至少90%同源性，且具有启动子功能的核苷酸序列；或者(e)权利要求1所述的一种水稻金属硫蛋白OsMT2bL基因启动子pMT2bL所示的核苷酸序列杂交且具有启动子功能的核苷酸序列。3.权利要求1或2所述的一种水稻金属硫蛋白OsMT2bL基因启动子pMT2bL在改良植物生长特性的应用。4.权利要求3所述的的一种水稻金属硫蛋白OsMT2bL基因启动子pMT2bL在改良植物生长特性的应用指在水稻营养生长与生殖生长阶段，用于改良作物感光或感温特性。5.权利要求1或2所述的一种水稻金属硫蛋白OsMT2bL基因启动子pMT2bL在植物基因工程中的应用。6.权利要求5所述的一种水稻金属硫蛋白OsMT2bL基因启动子pMT2bL在植物基因工程中的应用指用于开发单子叶植物中高启动效率的启动子用于基因表达研究。7.权利要求1或2所述的一种水稻金属硫蛋白OsMT2bL基因启动子pMT2bL在作物分子改良育种中的应用。8.权利要求7所述的一种水稻金属硫蛋白OsMT2bL基因启动子pMT2bL在作物分子改良育种中的应用指用于转基因水稻育种研究中，功能基因的高效表达应用。【文档编号】C12N15/113GK105907761SQ201610546803【公开日】2016年8月31日【申请日】2016年7月12日【发明人】李东宣,陈丽娟,李伟,吴超,张小玲,朱骞,郭效琼,董陈文华,李成云【申请人】云南农业大学