基于体外滚环复制的pcv2毒株感染性克隆构建试剂盒及方法

基于体外滚环复制的pcv2毒株感染性克隆构建试剂盒及方法
【专利摘要】本发明公开一种基于体外滚环复制的PCV2毒株感染性克隆构建试剂盒及方法。所述基于体外滚环复制的PCV2毒株感染性克隆构建试剂盒中含有如下引物：PCV2特异性上游引物：5’?CCATATGAAATAAATTACTGAG?3’（SEQ ID NO.1）；PCV2特异性下游引物：5’?CAGCGCACTTCTTTCGTTTTCAG?3’（SEQ ID NO.2）；随机引物：5′?NNNNNN?3′（SEQ ID NO.3）。PCV2毒株感染性克隆的方法是利用上述引物对PCV2 DNA进行多引物滚环扩增后得到PCV2全基因组，然后将全基因组通过单酶切分离纯化后连接，并重新环化，构建成PCV2毒株感染性克隆。
【专利说明】
基于体外滚环复制的PCV2毒株感染性克隆构建试剂盒及方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于体外滚环复制的PCV2(猪圆环病毒2 型)毒株感染性克隆构建试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 滚环扩增(rolling-circle amplification，RCA)是1998年建立的可用于恒温扩 增环状DNA模板的一种DNA扩增技术。该技术是借鉴自然界中病原微生物环状DNA分子的滚 环复制方式而建立的一种核酸扩增技术。目前RCA可利用Phi29、Bst和Phage T7等聚合酶完 成体外滚环复制，这几种酶都具有很强的持续性和链置换能力，能够满足RCA扩增机理的要 求。聚合酶借助引物可以不断延伸单链环状DNA模板，在完成一轮复制后，又再次借助引物 识别序列重新进入下一轮复制，核酸链间的位移活动使得新合成核酸链进一步取代之前的 旧链作为聚合前体，因此延伸过程可以进一步循环。除非外界因素（如核酸耗尽，温度变化 破坏酶活性等）的影响终止RCA反应，RCA会充分利用核酸链的位移和高活性的DNA聚合酶将 环状DNA进行高速循环复制。RCA借助于引物的特异性，可以直接扩增特异的环状DNA分子， 目前是现阶段应用广泛的恒温扩增技术之一。
[0003] 猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus type 2，PCV2)是圆环病毒科 (Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)成员，是目前哺乳动物中发现的最小的无囊膜、 单链环状DNA病毒。PCV2被认为是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning Multi systemic Wasting Syndrome，PWVIS)等PCV2相关性系统疾病（PCV2_systemic disease, PCV2-SD)的主要病原体。PCV2呈现全球性分布，能损伤猪的免疫系统，引起猪严重的免疫抑 制，同时临床上PCV2与其他病原体(如猪瘟病毒、猪蓝耳病毒等）多重感染和混合感染常常 发生，给养猪业造成重大经济损失，也对人类健康造成潜在的危害。
[0004] PCV2的复制主要是借助于宿主细胞的DNA聚合酶和相关原料。目前，PCV2感染性克 隆的构建主要通过PCR方法获得PCV2全基因组或与质粒重组后，利用脂质体介导转染PK-15 细胞，从而分离获得PCV2感染性克隆。近年来，2011年杨顺利等用PCR法将扩增得到的PCV2 全长基因组插入到真核生物表达载体PcDNA3.1中，获得了单拷贝重组质粒P-PCV2和串连双 拷贝重组质粒P-2PCV2,分别转染PK-15细胞，连续传代培养后间接免疫荧光试验表明，在细 胞中含有PCV2病毒抗原，RT-PCR检测有PCV2特异性基因转录发生。免疫小鼠后35天病毒几 乎都能检测到衣壳蛋白特异性抗体，在小鼠致死后体内能检测到病毒DNA，验证了 2种重组 质粒均能表达并在体外组装出有感染性PCV2病毒粒子。2015年王伟丞等将采用PCR方法从 PCV2阳性的病料中扩增出的PCV2全长基因组片段定向克隆至PVAX1载体，构建了PCV2的 PVAX1-PCV2感染性克隆质粒，将其转染细胞进行病毒拯救成功，通过免疫过氧化物酶和RT-PCR进行拯救病毒检测，结果表明其体外增殖能力稳定。2016年邵小雪等利用设计特异性引 物进行PCR反应的方法，以PCV1基因组为骨架，将PCV2衣壳基因替换为衣壳基因，成功构建 嵌合猪圆环病毒（PCV1-2)DNA克隆，将该克隆转染H(-15细胞获得拯救病毒，成功构建出 PCV1-2DNA克隆，一步生长曲线显示其在PK-15细胞中的增殖特性与亲本病毒较一致，成功 构建体外增殖能力较高的嵌合猪圆环病毒。
[0005] 2010年翟少伦等对检出的PCV2阳性DNA样品通过随机引物进行RCA，反应产物经单 一限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳鉴定并对目的条带进行回收、克隆与测序，成功获 得2株新疆株大小皆为1768bp的PCV2的全基因组，基因型分别为PCV2a和PCV2e;2015年汤智 慧等以通过随机引物或特异性引物的RCA方法均成功扩增出病毒的全基因组片段，建立了 PCV2体外滚环复制方法。
[0006] 相对于常规PCR，RCA仅需要恒温设备就可以获得环状基因组病毒的全基因组，这 将在PCV突变和分型等流行性的调查和研究发挥作用。如果病毒的基因组序列未知，也可以 通过随机引物来扩增，但是引物的非特异性会导致其他环状病毒的全基因组等环状DNA的 非特异性扩增干扰，这也是该种RCA对模板的灵敏度不如PCR方法的一个缺陷。

【发明内容】

[0007] 本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种基于体外滚环复制的PCV2毒株感染性 克隆构建试剂盒及方法。
[0008] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
[0009] 所述基于体外滚环复制的PCV2毒株感染性克隆构建试剂盒中含有如下引物：
[0010] PCV2特异性上游引物：5 ' -CCATATGAAATAAATTACTGAG-3 '（SEQ ID N0 · 1);
[0011] PCV2特异性下游引物：5'-CAGCGCACTTCTTTCGTTTTCAG-3'（SEQ ID N0.2);
[0012] 随机引物 W-NNNNNNI'(SEQ ID N0.3)。
[0013] 所述构建PCV2毒株感染性克隆的方法是利用上述试剂盒中的引物对PCV2DNA和 PUC19质粒(pUC19质粒为对照)进行多引物滚环扩增后得到PCV2全基因组，然后将全基因组 通过单酶切分离纯化后连接，并重新环化，构建成PCV2毒株感染性克隆。
[0014] 更具体地，所述构建PCV2毒株感染性克隆的方法是以从PCV2毒株或猪病料提取的 总DNA为模板，用权利要求1中所述的PCV2特异性上游引物、PCV2特异性下游引物和随机引 物混合对总DNA进行多引物滚环扩增，然后对多引物滚环扩增的产物进行EcoRI单酶切，将 酶切产物经过凝胶回收纯化后进行连接环化后，获得PCV2基因组DNA，该DNA再转染至PK15 细胞，获得PCV2毒株感染性克隆。
[00?5]下面结合原理对本发明作进一步说明：
[0016] 本发明利用多引物滚环扩增（Multiply-primed rolling-circle amplification，MPRCA)方法对PCV2检测呈阳性病料中获得PCV2全基因组，通过单酶切分离 纯化后连接重新环化，构建感染性克隆。MPRCA方法能快速简便的获得环状PCV2全基因组 DNA，利用随机引物的兼容性和特异性引物的识别，合理的避开了 PCV2不同亚型及基因突变 造成基因组的不确定性对PCR全长扩增的影响，也简化了毒株的分离过程。本研究为RCA的 临床应用开辟了新的方向。而MPRCA的技术优势可应用于病毒宏基因组研究，也将有助于分 子流行病学调查和病毒新毒株的发现，所形成的研究结果也为环状病毒的全基因组分离研 究提供新的技术途径。
[0017] 如果病毒的基因组序列已知，可以选择各分型基因组的保守区设计病毒特异性引 物，例如RCA方法利用特异性引物能快速简便的获得环状PCV2全基因组DNA。本发明选择 PCV2各分型基因组的保守区设计该病毒基因的特异性引物;利用随机引物的兼容性，可以 合理的避开了PCV2不同亚型及基因突变造成基因组的不确定性对PCR全长扩增的影响，而 利用特异性引物，可以保证RCA方法的病毒专一性，可以克服该种RCA对PCV2基因组模板的 灵敏度不如PCR方法的缺陷。所以利用随机引物和PCV2特异性引物的混合，可以克服单独使 用引物带来的影响和缺陷，也将简化了PCV2毒株的基因组分离和感染性克隆构建的过程， 尤其是PCV2不同亚型及基因突变造成其基因组序列的保守区变异的毒株，随机和PCV2特异 性混合引物的RCA表现出独有的易行性。
[0018] 根据本发明中基于MPRCA产物获得的感染性克隆收获的病毒能感染仔猪，具有 PCV2病毒感染性。与常规感染性克隆构建的方法相比，本方法不需使用质粒载体，为环状病 毒的全基因组分离和感染性克隆的构建研究提供新的技术途径，也为PCV2毒株的复制机理 和致病机理的研究提供有效的感染性毒株。
【附图说明】
[0019] 图1为PCV2基因组MPRCA产物鉴定；
[0020] 图2为PCV2基因组MPRCA产物进行单酶切产物鉴定；
[0021] 图3为重组质粒的酶切鉴定；
[0022]图4为PCV2HNLYYA1株单股环状DNA转染的PK-15细胞的间接免疫荧光检测；
[0023]图5为PK15细胞转染后的PCV2检测；图中：N，阴性对照;P，阳性对照；1，第3代带毒 PK15细胞;2,第6代带毒PK15细胞；
[0024]图6为转染前及转染后细胞传代培养的PCV2基因组序列比对；
[0025] 图7为MPRCA组猪淋巴组织的PCV2检测；图中：N，阴性对照;P，阳性对照；1-10MPRCA 组猪淋巴组织DNA;
[0026]图8为HNLYYA1株PCV2感染的猪淋巴结组织切片的免疫组化结果。
【具体实施方式】
[0027] 第一部分：
[0028] 1.1PCV2 基因组MPRCA
[0029] 对 PCV2DNA(GenBank 登录号 KJ867555)和 pUC19 质粒（2686bp，MPRCA 阳性对照）进行 MPRCA。其体系如下：在PCR管中分别加入模板4yL或pUC19 0.5yL，20yL样本缓冲液（10mM Tris-HCl，0.1 mMEDTA)，放入ABI 2700PCR仪中95°C运行3min，冷却到4°C 后，再加入20yL反 应缓冲液【330mM Tris_acetate(pH 7.9at 37°C)，100mM Mg_acetate，660mM K-acetate, l%(v/v)Tween 20，10mM DTT，30pmol PCV2特异性上 3'（SEQ ID N0.1)、PCV2特异性上游引物5'-CAGCGCACTTCTTTCGTTTTCAG-3'（SEQ ID N0.2) 和随机引物5'-丽丽NN-3YSEQ ID N0.3)和0.8yL phi29DNA聚合酶（购置Thermo Scientific公司），在30°C反应18h，然后于65°C10min，最后冷却到4°C，MPRCA反应终产物 于-20°C保存。
[0030] 1.2PCV2病毒DNA MPRCA后的酶切与连接反应
[0031] 将上述MPRCA的产物进行EcoRI单酶切，酶切体系依照Thermo公司限制性内切酶说 明书，配置i〇yL酶切体系如下： EcoR I 1 lOxBulTcr 1 μL
[0032] RCA 产物 1 μL dd H20 7,uL 总体积： l〇 .UL
[0033] 酶切反应条件如下:37°C，1.5h。反应结束后取5μL产物进行琼脂糖（10g/L)凝胶电 泳分析。并对酶切产物经核酸电泳后进行胶回收，回收片段进行浓度测定（30ngAxL)，连接 反应20yL体系如下： MPRCA酶切产物 4pL I 〇x Buffer 2 μL
[0034] T4DNA 连接酶 ΙμΙ^ dd H2Q 13μΙ 总体积 20 μL
[0035] 连接反应条件如下：于PCR仪中22°C连接反应lh。获得PCV2DNA连接产物放于-20°C 备用。
[0036] 1 · 3PCV2DNA 转染 PK-15 细胞
[0037] 按照LipoRxlaniinc? 3000试剂实验方案，将上述PCV2DNA转染至PK-15细胞，转染方 案如下：
[0038] 1)将PK-15细胞铺于24孔板上，共4孔，观察细胞生长至70-80% (贴壁细胞0.2-5 X 1〇6)时进行转染备用。
[0039] 2 )使用 Opti-MEM:? 培养基稀释 LipoRjctamine? 3000 试剂（2 管），每管 25yL 0|)这-1姬歸@培养基分别加入1.5yL或0.75μΙ丄ip〇l'ectami.ne?3000试剂。祸旋振荡2-3s，充分 混匀。
[0040] 3)使用Opti-MEM?培养基分别稀释连接产物，制备DNA预混液，然后添加 P3000? 试剂，充分混匀。体系如下：50yL〇pti-MEM?培养基，lyg连接产物和PEGFP-C3质粒，2μ LP3000? 试剂。
[0041 ] 4)在每管已稀释的Lipo!bctaminc?3000试剂中加入稀释的DNA(1:1比例），即在两 管25yL稀释的Lipoibctaminc?3000试剂中分别加入已稀释连接产物25yL和25yL PEGFP-C3 质粒。室温孵育5min。
[0042] 5)备用PK-15细胞中加入50yL DNA-脂质体复合物。37°C孵育细胞2-4天。然后使用 荧光显微镜分析转染细胞。
[0043] 6)将获得的转染细胞按常规方法进行细胞传代培养，培养用5%血清DMEM培养基， 传代时分成2瓶，1瓶用于保存和传代，1瓶用于收获病毒。
[0044] 1.4PCV2 病毒收集
[0045] 1)细胞长满时，培养瓶盖口用封口膜封住，_80°C冰箱冻存12h。
[0046] 2) 12h后常温下融化，融化后放入-80 °C冰箱lh，再常温下融化，反复3次。
[0047] 3)融化的细胞裂解液离心，4000rpm，30min，收获上清。
[0048] 1.5PCV2 的检测
[0049 ]检测引物由本实验室设计及提供。
[0050] 检测引物序列：
[0051] P1(上游引物）：CCATATGAAATAAATTACTGAG(SEQ ID N0.4)，
[0052] P2(下游引物）：CAGCGCACTTCTTTCGTTTTCAG(SEQ ID N0.5)，扩增片段大小为 785bp〇
[0053] 按下面反应体系：DNAlyL、Pl 0.5yL、P2 0.5yL、2XTaq PCR Master Mix5yL、双蒸 水 3yL，于 PCR 仪中按反应程序：94 °C 5min、94 °C 30 s、55 °C 30 s、72 °C 3min，35 个循环；72 °C 延伸 7min，进行PCR反应。取5yL PCR产物进行1 %的琼脂糖凝胶电泳检测。
[0054] 第二部分：
[0055] 2.1PCV2感染性克隆单股环状DNA的制备
[0056] 对1份PCV2检测呈阳性病料总DNA分别进行PCV2基因组MPRCA、PCV2病毒DNA MPRCA 产物的酶切与连接反应(按具体步骤1.1、1.2中描述），制备PCV2感染性克隆单股环状DNA (GenBank登录号KJ867555)，利用常规琼脂糖凝胶电泳检测上述DNA(GenBank登录号 KJ867555)。
[0057]结果显示，PCV2基因组MPRCA产物与预期大小、条带一致(图1)。
[0058] 2.2PCV2感染性克隆单股环状DNA序列的酶切鉴定
[0059]按具体步骤1.2描述，MPRCA产物进行单酶切实验，利用常规琼脂糖凝胶电泳显示 酶切结果。
[0060]结果显示，获得了大量分子量约为1.7kb大小的目的条带，与PCV2常见基因组大小 一致（图2)，随后进行胶回收(按OMEGA公司琼脂糖凝胶回收试剂盒说明操作），测定浓度后 保存于_20°C备用。
[0061 ] 2.3PCV2感染性克隆单股环状DNA测序
[0062]按照具体步骤1.2中描述，将pSP72质粒进行酶切反应后常规琼脂糖凝胶电泳，胶 回收目的条带(2462bp)并测定浓度。将胶回收获得的pSP72质粒片段及MPRCA反应产物片段 按浓度比1:3进行连接反应，获得的连接产物与DH5a(Trans-CD201-Trans5aChemically Competent Cell)进行转化，使用含氨苄抗生素（100yg/mL)LB固体培养基，37°C过夜培养， 挑取长出单菌落接种于5mL含Amp的液体培养基中，37 °C 220rpm摇床培养12h后，提取质粒。 [0063] 经酶切验证结果显示（如图3)，酶切后重组质粒释放约1.7kb和2.4kb条带，分别与 PCV2基因组和pSP72质粒的大小相符。最后将提取的质粒送至南京金斯瑞公司进行测序，利 用DNAstar软件对测序结果(命名:HNLYYA1-MPRCA)进行分析。
[0064] 2.4酶切后的？(^2病毒0嫩1^此4的连接反应
[0065]将PCV2DNA MPRCA产物酶切后胶回收获得的片段按具体步骤1.2中描述进行连接 反应，重新获得环状的PCV2基因组。
[0066] 2.5PCV2DNA 转染 PK-15 细胞
[0067]按具体步骤1中描述将获得的PCV2HNLYYA1株的单股环状DNA转染PK-15细胞。
[0068] 2.5.1PCV2DNA转染PK-15细胞的间接免疫荧光检测
[0069]将转染后细胞培养瓶培养的PK-15细胞用0.25 %胰酶消化，分装到96孔板，37°C培 养24h，roS洗1次，并换上10 % DMEM继续培养，以PCV2转染的PK-15细胞作为阳性对照、正常 的ΡΚ-15细胞作为阴性对照。48h后倾去细胞培养液，PBS洗涤后用冷甲醇固定20min，弃去固 定液，将96孔板自然琼干，将已固定的细胞板用PBS洗條，自然干燥;加入1:1000稀释的猪源 PCV2阳性血清，37°C水浴作用lh，PBS洗3次，5min/次，拍干;加入用PBST 1:4000稀释酶标二 抗羊抗猪IgG-HRP，37 °C水浴作用45min，PBS洗3次，5min/次，拍干，荧光显微镜下观察。
[0070] 结果显示，PCV2HNLYYA1株单股环状DNA转染的PK-15细胞可观察到明显绿色荧光 信号（图4B)，而正常的PK-15细胞没有荧光信号（图4A)，表明PCV2HNLYYA1株在PK15细胞中 复制，产生的病毒粒子可以识别猪源PCV2阳性血清，具有PCV2抗原性。
[0071] 2.5.2?(^20嫩转染?1(-15细胞后?〇?检测和序列鉴定
[0072] 1)转染(按具体步骤1.3描述)并传代培养后PCR检测
[0073]将转染后细胞培养瓶培养的PK-15细胞用0.25 %胰酶消化，使用roS悬浮收集，-70 °C保存。提取细胞DNA保存于-20 °C。使用检测引物(按具体步骤1.5描述)对提取的细胞DNA 进行检测。
[0074]结果显示，转染后能正常检测到PCV2阳性（图5)，表明PCV2基因组随细胞传代培养 进行复制增殖。
[0075] 2)转染并传代培养后序列鉴定
[0076]提取转染并传代培养后的第6代带毒PK15细胞DNA，进行序列鉴定(按实施案例2.3 描述)后将测序结果(命名：HNLYYA1-MPRCA-1)与MPRCA反应产物测序结果(命名:HNLYYA1-MPRCA)比对分析。
[0077] 结果显示，HNLYYA1-MPRCA-1和HNLYYA1-MPRCA测序结果完全一致，见图6，说明转 染及细胞传代培养的PCV2基因组未发生改变，且稳定。
[0078] 2.6PCV2 病毒收集
[0079] 1)细胞长满时，培养瓶盖口用封口膜封住，-80 °C冰箱冻存12h。
[0080] 2) 12h后常温下融化，融化后放入-80 °C冰箱lh，再常温下融化，反复3次。
[00811 3)融化的细胞裂解液离心，4000rpm，30min，收获上清。
[0082] 2.7PCV2病毒的猪攻毒实验
[0083]将9头7周龄、平均体重7.1公斤的PCV2抗体为阴性的三元仔猪(公母各半），随机分 为3组：1组、MPRCA法制备的HNLYYA1株PCV2病毒组(MPRCA组)3头；2组、PCV2野生型HNLYYA1 株细胞培养组(野生组）3头；3组、对照组3头。MPRCA组颈背部肌肉注射利用MPRCA方法制备 的病毒感染性克隆获得的PCV2病毒液2ml，对照组颈背部肌肉注射正常PK-15细胞悬液2ml， 野生型毒株组颈背部肌肉注射野生型PCV2病毒液2ml。相互隔离饲养。
[0084]攻毒后第21天(三周)采集血液后扑杀，采集猪淋巴结组织，进行DNA提取，利用检 测引物进行PCV2的PCR检测。取脾脏进行病毒分离，分离的病毒判为病毒阳性，每组至少有7 头猪病毒分离为阳性(图7)。
[0085] 结果表明：攻毒后三周MPRCA组及野生组的猪淋巴组织内检测到PCV2阳性，正常 PK-15细胞组的猪淋巴组织未检测到PCV2阳性（图7)。
[0086] 2.8攻毒后猪淋巴组织的免疫组化鉴定
[0087] 所选材料为经PCR验证后确定有HNLYYA1株PCV2感染的猪淋巴结组织，阴性对照为 无 PCV2感染的猪淋巴结组织，按照常规方法固定并制作石蜡切片。具体免疫组化检测步骤 如下：
[0088] a.石蜡切片，常规脱蜡至水。3%H202和去离子水孵育lOmin，以消除上述材料的石 蜡切片上内源性过氧化物酶活性。
[0089] b.分别用蒸馏水冲洗、PBS(0.01M pH=7.2)浸泡5min，然后置于抗原修复液中，95 °C 修复 15min。
[0090] c.滴加山羊血清封闭，室温孵育15min，倾去，勿洗。
[0091] d.滴加用ros按照1:600稀释的抗PCV2VLPS的单克隆抗体作为一抗，37°C孵育2~ 3h或4°C过夜。PBS冲洗3次，每次冲洗3min。
[0092] e.滴加生物素标记羊抗鼠 IgG二抗，室温或37°C孵育10~ISmiruPBS冲洗3次，每次 冲洗3min。
[0093] f.滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温或37 °C孵育10~15min JBS冲洗3次， 每次冲洗3min。
[0094] g. DAB显色剂显色并在显微镜下观察，并及时终止反应。自来水充分冲洗。苏木素 染液复染30s，然后用梯度乙醇脱水，二甲苯透明。封片，观察。
[0095]判定标准：阴性对照无特异性显色，阳性对照的细胞核或细胞浆反应产生棕黄色 沉淀，被检组织的免疫组化切片结果与阳性对照相同则判定为阳性。
[0096] 结果显示，MPRCA法制备的HNLYYA1株PCV2感染的猪淋巴结组织切片中细胞核或细 胞浆可见棕黄色沉淀（图8A、B)，野生型HNLYYA1株PCV2感染的猪淋巴结组织切片中细胞核 或细胞浆也可见棕黄色沉淀（图8C、D)，无 PCV2感染的猪淋巴结组织（阴性对照)切片中细胞 核或细胞浆无特异性显色（图8E、F)。
【主权项】
1. 一种基于体外滚环复制的PCV2毒株感染性克隆构建试剂盒，其特征在于，所述试剂 盒中含有如下引物： PCV2特异性上游引物:5 ' -CCATATGAAATAAATTACTGAG-3 ' ； PCV2特异性下游引物：5 ' -CAGCGCACTTCTTTCGTTTTCAG-3 ' ； 随机引物:5' -NNNNNN-3'。2. 利用权利要求1所述试剂盒构建PCV2毒株感染性克隆的方法，其特征在于，所述方法 是利用权利要求1中所述的引物对PCV2 DNA进行多引物滚环扩增后得到PCV2全基因组，然 后将全基因组通过单酶切分离纯化后连接，并重新环化，构建成PCV2毒株感染性克隆。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法是以从PCV2毒株或猪病料提取的总 DNA为模板，用权利要求1中所述的PCV2特异性上游引物、PCV2特异性下游引物和随机引物 混合对总DNA进行多引物滚环扩增，然后对多引物滚环扩增的产物进行EcoR I单酶切，将酶 切产物经过凝胶回收纯化后进行连接环化后，获得PCV2基因组DNA，该DNA再转染至PK15细 胞，获得PCV2毒株感染性克隆。
【文档编号】C12N15/10GK105907752SQ201610300662
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月9日
【发明人】王乃东, 王占峰, 杨毅, 王爱兵, 邓治邦, 杨林, 张颜, 朱哲
【申请人】湖南农业大学