一种黄缘盒龟唾液及口腔上皮中提取dna的方法
【专利摘要】本发明涉及一种黄缘盒龟唾液及口腔上皮中提取DNA的方法，属于DNA分离纯化技术领域。用口拭子插入黄缘盒龟的口腔，在口腔上下部来回擦拭后放入装有PBS溶液中，震荡；加入裂解液，混匀后水浴；离心，沉淀加碘化钾溶液，漩涡，再分别加入NaCl和酚/氯仿溶液，震荡，离心；取上清液，加入与上清同样体积的异丙醇，涡旋震荡离心；弃上清液，在沉淀中加入70%乙醇洗涤，离心；沉淀室温晾干，当沉淀块变透明时，加入TE缓冲液溶解。将发明应用于黄缘盒龟DNA提取，具有操作便捷、黄缘盒龟损伤小等优点。
【专利说明】
一种黄缘盒龟唾液及口腔上皮中提取DNA的方法
技术领域
[00011本发明涉及一种黄缘盒龟唾液及口腔上皮中提取DNA的方法，属于DNA分离纯化技 术领域。
【背景技术】
[0002] 黄缘盒龟（Cistoclemmys flavomarginata,Yellow-margined Box Turtle)隶属 于龟鳖目（Testudinata)、淡水龟科(Geoemydidae)、盒龟属（Cistoclemmys)。因其背甲缘盾 腹部黄色，眼眶上有一条金黄色条纹，故得名。黄缘盒龟在我国主要分布于浙江、安徽、福 建、江苏、河南、广西、广东、台湾等地，邻国日本也有分布。我省主要分布在临安、建德、安 吉、龙游、天台、新昌等地。由于黄缘盒龟为龟中珍品，是高级的滋补品，其药用价值较高，还 具有较大的观赏价值。近年来，由于人为过渡捕捉，野生黄缘盒龟资源及其栖息地受到严重 破坏，野生数量急剧减少。1998年该种群已被列入国家珍稀濒危动物，2006年被联合国列为 濒危级动物种群（IUCN，2006)。除人为因素以外，由于野生黄缘盒龟生长缓慢，加之，全球气 候变暖以及恶劣反常天气的频繁出现，使其交配环境、孵化条件等与最适条件有了不小的 差距，所以性成熟后产卵量极少，受精率、孵化率及成活率均极低，并且对其性别分化等也 产生了较大影响，导致野生种群濒临灭绝。
[0003] 目前，对我省野生黄缘盒龟的种质资源调查，以及与临近省份野生种群亲缘关系 分析鉴定尚未有效开展，对黄缘盒龟拟生态驯养繁殖开展尚处于探索阶段。我省已有几家 养殖企业开始试探性养殖黄缘盒龟，但由于黄缘盒龟生长周期长，纯系和杂交龟在稚龟期 差异较小，养殖6-8年后珍品黄缘盒龟性状才能显现，从而产生了较大的养殖风险。传统用 于DNA提取的样本主要来源于血液或组织块，但是对于野生濒危动物，取血和获取组织块都 对动物本身具有伤害并有可能带来疾病感染，对其生存具有一定的隐患。
[0004] 基于此，做出本申请。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有黄缘盒龟鉴定所存在的上述缺陷，本申请提供一种简便易行、采集 方便、无创伤的黄缘盒龟唾液及口腔上皮中提取DNA的方法。
[0006] 为实现上述目的，本申请采取的技术方案如下：
[0007] -种黄缘盒龟唾液及口腔上皮中提取DNA的方法，包括如下步骤：（1)用口拭子插 入黄缘盒龟的口腔，在口腔上下部来回擦拭后放入装有500yL的0.01m 〇l/L PBS溶液中，用 涡旋振荡器震荡2min，取出口拭子；（2)加入lmL二硫苏糖醇(DTT)裂解液，混匀后水浴；（3) 离心，沉淀加碘化钾溶液，漩涡，再分别加入NaCl和酚/氯仿溶液，震荡，离心；（4)取上清液， 加入与上清同样体积的异丙醇，涡旋震荡离心；（5)弃上清液，吸去沉淀中的多余液体，在沉 淀中加入70%乙醇洗涤2次，离心；（6)沉淀室温晾干，当沉淀块变透明时，加入TE缓冲液溶 解。
[0008] 进一步的，作为优选：
[0009]步骤(2)中，裂解液构成为：100mmol/L Tris-HCl，pH8，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA,0.4mol/L DTT〇
[0010] 步骤⑵中，水浴温度为40~60°C冰浴时间1-4小时。
[0011] 步骤(3)中，碘化钾溶液的浓度为3-5mol/L。
[0012] 步骤(3)中，NaCl溶液质量浓度为0.5-1.5% ;酚/氯仿溶液中，酚:氯仿=25:24(体 积比）;NaCl与酚/氯仿溶液添加体积比为1:1-2。
[0013] 通过本申请技术方案的实施，通过收集评价野生黄缘盒龟种质资源，采用"唾液" 取样方式，这种方式可在不伤害甚至不必见到动物的情况下，利用这些样品提取动物DNA并 进行PCR扩增，再利用mtDNA，PCR等遗传学、分子生物学技术，建立黄缘盒龟种质分子鉴定分 析方法，实现在不影响野生种群分布的前提下探明黄缘盒龟野生资源现状，所建立的黄缘 盒龟种质分子鉴定方法，有利于探明野生黄缘盒龟种质资源，并通过对野生黄缘盒龟的生 活、交配、繁育等条件调查，构建黄缘盒龟拟生态驯养繁殖体系，从而进行生物个体遗传信 息的分析;最终有效的保护这一濒危物种，为保护物种多样性，也为中医药自然资源的可持 续利用提供途径。
【附图说明】
[0014] 图1为本申请的琼脂糖核酸电泳检测谱图。
【具体实施方式】
[0015] 实施例1
[0016] 取O.lmL黄缘盒龟唾液置于1.5mL离心管中，加0.01mol/L PBS溶液500yL，反复吹 打几下，加入裂解液（100mmol/L Tris_HCl，pH = 8，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA， 0.4mol/L DTT)，混匀后40°C水浴4小时；12000g离心5min;沉淀加50yL 3mol/L的碘化钾溶 液，漩涡308，再加10(^1^0.5%似(：1和10(^1^酚/氯仿溶液（酚：氯仿=25:24)，震荡30 8， 12000g离心5min;取上清，加入与上清等体积的异丙醇，混勾，12000g离心5min;沉淀加入 500yL无水乙醇洗涤，12000g离心5min。沉淀室温晾干，用TE缓冲液溶解。
[0017] 实施例2
[0018] 取O.lmL黄缘盒龟唾液置于1.5mL离心管中，加0.01mol/L PBS溶液500yL，反复吹 打几下，加入裂解液（100mmol/L Tris_HCl，pH = 8，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA， 0.4mol/L DTT)，混匀后45°C水浴3小时；12000g离心5min;沉淀加50yL 4mol/L的碘化钾溶 液，漩涡308，再加10(^1^1.2%似(：1和12(^1^酚/氯仿溶液（酚：氯仿=25:24)，震荡30 8， 12000g离心5min;取上清，加入与上清等体积的异丙醇，混勾，12000g离心5min;沉淀加入 500yL无水乙醇洗涤，12000g离心5min。沉淀室温晾干，用TE缓冲液溶解。
[0019] 实施例3
[0020] 取O.lmL黄缘盒龟唾液置于1.5mL离心管中，加0.01mol/L PBS溶液500yL，反复吹 打几下，加入裂解液（100mmol/L Tris_HCl，pH = 8，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA， 0.4mol/L DTT)，混匀后55°C水浴2小时；12000g离心5min;沉淀加50yL 5mol/L的碘化钾溶 液，漩涡308，再加10(^1^0.9%似(：1和15(^1^酚/氯仿溶液（酚：氯仿=25:24)，震荡30 8， 12000g离心5min;取上清，加入与上清等体积的异丙醇，混勾，12000g离心5min;沉淀加入 500yL无水乙醇洗涤，12000g离心5min。沉淀室温晾干，用TE缓冲液溶解。
[0021] 实施例4
[0022] 取O.lmL黄缘盒龟唾液置于1.5mL离心管中，加0.01mol/L PBS溶液500yL，反复吹 打几下，加入裂解液（100mmol/L Tris_HCl，pH = 8，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA， 0.4mol/L DTT)，混匀后60°C水浴1小时；12000g离心5min;沉淀加50yL 5mol/L的碘化钾溶 液，漩涡308，再加10(^1^1.5%似(：1和20(^1^酚/氯仿溶液（酚：氯仿=25:24)，震荡30 8， 12000g离心5min;取上清，加入与上清等体积的异丙醇，混勾，12000g离心5min;沉淀加入 500yL无水乙醇洗涤，12000g离心5min。沉淀室温晾干，用TE缓冲液溶解。
[0023]将上述实施例的溶解液进行如下处理：
[0024] (a)PCR引物设计
[0025] 表1黄缘盒龟线粒体基因组全序列扩增引物
[0026]
[0027] (b)PCR 扩增
[0028] PCR扩增使用东洋纺(上海)生物技术有限公司的高保真酶K0D FX。
[0029] 表2 PCR反应组分
[0030]
[0031] 表3 PCR反应程序
[0032]
[0033] 对线粒体基因 PCR产物进行琼脂糖电泳检测，并用凝胶回收试剂盒（DNA GelExtractionKit，Takara)进行目的片断的回收;对微卫星PCR产物进行聚丙稀酰胺电泳 检测；用纯化试剂盒(￡.2.1'1.4〇7〇16?11代1(;[1:，0111683)进行纯化回收。回收后的产物进行测 序，该序列可用于在NCBI数据库中比对分析，即完成整个DNA的提取和检测应用。
[0034]电泳检测：1 %琼脂糖电泳，结合图1，可以看到DNA条带明显，DNA采集纯度较高。
[0035] 通过本申请技术方案的实施，通过收集评价野生黄缘盒龟种质资源，采用"唾液" 取样方式，这种方式可在不伤害甚至不必见到动物的情况下，利用这些样品提取动物DNA并 进行PCR扩增，再利用mtDNA，PCR等遗传学、分子生物学技术，建立黄缘盒龟种质分子鉴定分 析方法，实现在不影响野生种群分布的前提下探明黄缘盒龟野生资源现状，所建立的黄缘 盒龟种质分子鉴定方法，有利于探明野生黄缘盒龟种质资源，并通过对野生黄缘盒龟的生 活、交配、繁育等条件调查，构建黄缘盒龟拟生态驯养繁殖体系，从而进行生物个体遗传信 息的分析;最终有效的保护这一濒危物种，为保护物种多样性，也为中医药自然资源的可持 续利用提供途径。
[0036] 以上内容是结合本发明创造的优选实施方式对所提供技术方案所作的进一步详 细说明，不能认定本发明创造具体实施只局限于上述这些说明，对于本发明创造所属技术 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干简单推演 或替换，都应当视为属于本发明创造的保护范围。
【主权项】
1. 一种黄缘盒龟唾液及口腔上皮中提取DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)用口拭子插入黄缘盒龟的口腔，在口腔上下部来回擦拭后放入装有500 yL的O. Ol mol /LPBS溶液中，用涡旋振荡器震荡2min，取出口拭子； (2 )加入ImL裂解液，混匀后水浴； (3) 离心，沉淀加碘化钾溶液，漩涡，再分别加入NaCl和酚/氯仿溶液，震荡，离心； (4) 取上清液，加入与上清同样体积的异丙醇，涡旋震荡离心； (5 )弃上清液，在沉淀中加入70%乙醇洗涤2次，离心； (6)沉淀室温晾干，当沉淀块变透明时，加入TE缓冲液溶解。2. 如权利要求1所述的一种黄缘盒龟唾液及口腔上皮中提取DNA的方法，其特征在于： 步骤（2)中，裂解液构成为：100 mmol/LTris-HCl，pH=8，1.4 mol/LNaCl，20mmol/LEDTA， 0.4 mol/L DTT03. 如权利要求1所述的一种黄缘盒龟唾液及口腔上皮中提取DNA的方法，其特征在于： 步骤(2)中，水浴温度为40~60°C，水浴时间1-4小时。4. 如权利要求1所述的一种黄缘盒龟唾液及口腔上皮中提取DNA的方法，其特征在于： 步骤(3 )中，碘化钾溶液的浓度为3-5mo I /L。5. 如权利要求1所述的一种黄缘盒龟唾液及口腔上皮中提取DNA的方法，其特征在于： 步骤(3)中，NaCl溶液质量浓度为0.5-1.5%;酚/氯仿溶液中，酚:氯仿=25:24(体积比）;NaCl 与酚/氯仿溶液添加体积比为1:1-2。
【文档编号】C12N15/10GK105907750SQ201610431671
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月17日
【发明人】寿建昕
【申请人】绍兴文理学院元培学院