一种羧基磁珠固定化谷氨酸脱羧酶及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种羧基磁珠固定化谷氨酸脱羧酶及其制备方法和应用，所述羧基磁珠固定化谷氨酸脱羧酶，以羧基磁珠为载体，所述谷氨酸脱羧酶通过氨基和羧基偶联固定在羧基磁珠表面，所述谷氨酸脱羧酶的编码基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。所述制备方法包括以下步骤：(1)提供谷氨酸脱羧酶和羧基磁珠；(2)将谷氨酸脱羧酶与经活化的羧基磁珠混合，反应完成后，分离得到所述羧基磁珠固定化谷氨酸脱羧酶。本发明羧基磁珠固定化谷氨酸脱羧酶具有易分离、可反复回收利用、热稳定性高、操作稳定性高等优点；与游离酶相比，羧基磁珠固定化谷氨酸脱羧酶半失活温度提高了2.1℃；重复催化10次后，仍保持90.42％的活性。
【专利说明】
一种羧基磁珠固定化谷氨酸脱羧酶及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种羧基磁珠固定化谷氨酸脱羧酶及 其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 谷氨酸脱駿酶(glutamate decarboxylase，简称GAD;EC4.1.1.15)，是一类磷酸P比 哆醛依赖性酶，能以磷酸吡哆醛(PLP)为辅酶专一性地催化L-谷氨酸脱羧合成γ -氨基丁酸 (γ -aminobutyrate，GABA)，是生物催化法制备GABA的关键酶。GABA是一种天然存在的非蛋 白质氨基酸，具有降血压、镇静安神、改善睡眠和记忆力等多种重要的生理功能，在食品、医 药、畜牧业、农业等领域都具有广阔的应用前景。作为一种新型的功能性因子，GABA正越来 越引起人们的注意，它既可以开发成为一种具有显著药理作用的药物，又可以开发成为一 种具有保健作用的食品，因而在医药和食品领域均具有重要的应用价值。
[0003] 目前，制备GABA的方法主要是化学合成法和生物合成法两大类。
[0004] 化学合成GABA虽然反应迅速，但是具有反应条件苛刻、安全性差、能耗大、成本高、 副反应多以及环境污染严重等缺点。与传统的化学催化剂相比，作为天然催化剂的酶具有 催化效率高和底物特异性强等优点，在食品、医药、轻工等工业生产上具有巨大的应用潜力 和良好的发展前景。
[0005] 在工业生产过程中，良好的热稳定性是理想的生物催化剂所应具备的特征之一， 同时酶的重复利用率也是节约成本的关键，作为生物催化法制备GABA的关键酶，提高谷氨 酸脱羧酶稳定性及重复利用性在GABA的工业生产上具有重要的战略意义。
[0006] 固定化酶指经物理或化学方法处理后，使酶变成不易随水流失，即运动受限制，而 又能发挥催化作用的酶制剂。与游离酶相比，固定化酶的优点有:可多次重复使用，且酶的 稳定性高;反应后，固定化酶易与底物和产物分离;反应条件易于控制，有利于自动化生产。
[0007] 超顺磁性纳米微球（Superparamagnetism nanomicrosphere，简称磁珠 SMNs)的主 要特点是在外加磁场的作用下可以被磁化而显示出磁性，能够被迅速分离出来。当外加磁 场撤离后它没有剩磁，因而又可重新分散到液体中，其生物相溶性和悬浮稳定性较好。
[0008] 羧基化磁珠表面生物分子的修饰是利用碳二亚胺类中的1-乙基_(3-二甲基氨基 丙基）（EDC)缩合的方法，生物活性分子可通过磁珠表面的官能基团结合到SMNs上，应用于 分离、检测和临床诊断等领域中，是医学、分子生物学、免疫学等研究中的重要载体工具。
[0009] 现有技术中，关于固定化酶的研究较多，但固定化的谷氨酸脱羧酶在热稳定性、操 作稳定性方面仍有待提尚，例如：
[0010] 1、乔春楠等以海藻酸钠法固定化谷氨酸脱羧酶，获得的固定化酶连续催化5次后， 剩余酶活仅为50 % (乔春楠，刘萍，孙君社.海藻酸钠法固定化谷氨酸脱羧酶的研究.中国生 化药物杂志· 2008，29(1): 16-18)。
[0011] 2、公布号为CN102120995A的发明专利申请文献公开了一种固定化谷氨酸脱羧酶 及其制备方法，该固定化谷氨酸脱羧酶的制备以棉绒布为载体固定化乳酸菌谷氨酸脱羧 酶，得到的固定化酶连续进行10次催化反应后，酶活回收率达75%。
[0012] 3、朱菲采用pvA-sA凝胶为载体固定化谷氨酸脱羧酶，得到的固定化酶连续催化7 次，剩余活力为87% (朱菲.固定化谷氨酸脱羧酶的制备与酶学性质研究[D].杭州:浙江大 学，2011)。
[0013] 4、LeeSeungwoon等用Eupergit 250C and calcium alginate固定化谷氨酸酸脱 羧酶，得到的固定化酶连续催化10次后，固定化酶保留了58.1 %的活性（Seungwoon Lee， Jungoh Ahn，Yeon_Gu Kim，Joon_Ki Jung,Hongweon Lee and Eun Gyo Lee. Gamma-Aminobutyric Acid Production Using Immobilized Glutamate Decarboxylase Followed by Downstream Processing with Cation Exchange Chromatography[J] .International Journal of Molecular Sciences，2013，14:1728-1739)〇
[0014] 5、Han Lei、Wei Wang等以羧基磁珠为载体，固定化木瓜蛋白酶，得到的固定化酶 连续催化十次后，酶的剩余活力为70%(他111^；[，16丨131^，1^1^-1^01611，乂丨30-&31^1^， Bin Yi，Le Deng.The preparation and catalytically active characterization of papain immobilized on magnetic composite microspheres[J].Enzyme and Microbial Technology,2004,35:15-21)〇
【发明内容】
[0015] 本发明提供了一种热稳定性和活力回收率高的羧基磁珠固定化谷氨酸脱羧酶。
[0016] -种羧基磁珠固定化谷氨酸脱羧酶，以羧基磁珠为载体，所述谷氨酸脱羧酶通过 氨基和羧基偶联固定在羧基磁珠表面，所述谷氨酸脱羧酶的编码基因的碱基序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0017] 本发明还提供了所述羧基磁珠固定化谷氨酸脱羧酶的制备方法，包括以下步骤：
[0018] (1)提供谷氨酸脱羧酶和羧基磁珠；
[0019] (2)将谷氨酸脱羧酶与经活化的羧基磁珠混合，反应完成后，分离得到所述羧基磁 珠固定化谷氨酸脱羧酶。
[0020] 作为优选，所述谷氨酸脱羧酶通过如下方法制备得到：
[0021] (a)构建含目的基因的表达载体，将所述表达载体转化至大肠杆菌，获得含目的基 因的工程菌；
[0022] (b)诱导培养所述工程菌，收集菌体，破碎菌体细胞后，得到粗酶液；
[0023] (c)纯化。
[0024] 作为优选，所述表达载体为pET-28a( + );宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。
[0025] 所述羧基磁珠的合成方法包括以下步骤：
[0026] (A)在氮气保护下，向含Fe3+和Fe2+的水溶液中加碱和分散剂，调节溶液pH至碱性， 制得包被的Fe3〇4纳米磁性粒子；
[0027] (B)加入氧化剂进行氧化反应，反应完成后，分离得到所述羧基磁珠。
[0028] 具体地，所述分散剂为油酸，其既具有表面改性作用，又具有分散作用。上述羧基 磁珠为功能化的具有单层羧基的亲水性磁性纳米粒子。
[0029] 作为优选，所述溶液pH调至9.5~10.5;更为优选，所述pH调至10。
[0030]作为优选，所述氧化剂为KMn〇4。
[0031] 作为优选，Fe3+与Fe2+的摩尔比为2 · 0~2 · 5:1。
[0032] 作为优选，氧化反应的温度为20~30°C，时间为7~9h。
[0033] 作为优选，所述羧基磁珠与谷氨酸脱羧酶的质量比为1:0.05~0.1。
[0034] 固定化的时间和温度对谷氨酸脱羧酶的固定量有影响。作为优选，步骤(2)中所述 反应的温度为20~30°C，时间为10~13h。更优选，所述反应的温度为25°C，时间为12h。
[0035] 本发明还提供了所述羧基磁珠固定化谷氨酸脱羧酶在合成γ-氨基丁酸中的应 用。
[0036] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0037] (1)本发明以羧基磁珠作为载体，固定化如SEQ ID NO. 1所示的谷氨酸脱羧酶，获 得的羧基磁珠固定化谷氨酸脱羧酶具有易分离、可反复回收利用、热稳定性高、操作稳定性 尚等优点；
[0038] (2)与游离酶相比，本发明羧基磁珠固定化谷氨酸脱羧酶的半失活温度提高了2.1 °C ;重复催化10次后，仍保持90.42 %的活性；
[0039] (3)本发明羧基磁珠固定化谷氨酸脱羧酶的制备方法简单，易于实现；
[0040] (4)本发明羧基磁珠固定化谷氨酸脱羧酶可以利用磁铁直接从反应体系中完全分 离、操作方便简单且可反复回收利用。
【附图说明】
[0041 ]图1为实施例1中羧基磁珠的SEM图。
[0042] 图2为实施例1中游离酶的热稳定性曲线。
[0043] 图3为实施例1中固定化酶的热稳定性曲线。
[0044]图4为实施例1中固定化酶的操作稳定性曲线。
【具体实施方式】
[0045] 实施例1
[0046] -、含目的基因的工程菌的制备
[0047] 利用质粒pET_28a( + )构建重组质粒pET-28a( + )-gad;以pET_28a( + )为载体， GAD1407碱基序列（如SEQ ID NO.1所示)为目的片段，经过优化酶切、回收纯化和连接，构建 表达质粒，将连接反应产物转化E.coli BL21(DE3)，得到表达谷氨酸脱羧酶GAD的工程菌 E·co1i BL21(DE3)-pET-28a(+)-GAD1407。
[0048]二、谷氨酸脱羧酶的分离与纯化
[0049] 将保存的工程菌培养于5ml含有50yg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C、 200rpm摇床中振荡培养过夜。以2%的接种量接种到含有5(^8/11^卡那霉素1^液体培养基 中，在37 °C、200rpm摇床中振荡培养，当菌体OD600达到0.6~0.8时，加入适量体积的IPTG(终 浓度为〇. 5mmol/L)，在25°C、150rpm摇床中诱导培养过夜。
[0050]诱导培养结束后，在4°C、4000g的条件下离心10min，弃去上清液，收集菌体沉淀， 菌体用pH 7.4的PBS缓冲液洗涤两次。除尽培养基后，用原发酵液体积1/10的pH 7.4的PBS 缓冲液重悬细胞，在冰浴中超声破胞90次(500W，工作3s，间隙6s)，在4°C、12000g的条件下， 将破胞液离心30min，收集上清液，即得到含有谷氨酸脱羧酶的粗酶液。
[0051 ] 采用Ni-NTA亲和层析，对所得的粗酶液进行分离纯化，经上样（Loading)、清洗 (Washing)和洗脱(Elution)，收集洗脱液，超滤除去咪唑后留待固定化用。
[0052]所用缓冲液的配制如下：
[0053] PBS 缓冲液：
[0054] 磷酸二氢钾 2mmol/L;
[0055] 磷酸氢二钠 10mm〇l/L;
[0056] KC1 2.7mmol/L;
[0057] NaCl 137mmol/L;
[0058] HC1 调节pH 7.4。
[0059] 清洗缓冲液(wash buffer):
[0060] Tris-HCl(pH 7.8) 20mmol/L；
[0061] NaCl 500mmol/L；
[0062] 咪唑 40mmol/L。
[0063] 洗脱缓冲液（elution buffer):
[0064] Tris-HCl(pH 7.8) 20mmol/L；
[0065] NaCl 500mmol/L；
[0066] 咪唑 400mmol/L。
[0067] 三、羧基磁珠的合成方法
[0068] 称取FeCl3 · 6H20 4.05g、FeCl2 · 4H20 1.65g溶解于72mL水中，用恒压漏斗逐滴加 入10mL浓氨水至pH=10左右，80°C下反应30min，将温度调至70°C，继续反应30min后，用恒 压漏斗逐滴加入2.33g油酸（约2.5mL)，70°C下反应lh。整个合成反应过程均在犯保护下搅 拌进行。
[0069] 反应结束后，在混合物中加入适量无水乙醇进行磁分离。用无水乙醇洗去多余油 酸后，用去离子水洗至中性。磁分离后向沉淀物中加入80mL KMn〇4(浓度为10mg/mL)，超声 震荡下反应8h，反应结束后进行磁分离，用乙醇和水交替洗涤沉淀，制得羧基磁珠。
[0070]采用共沉淀法合成上述羧基磁珠，制备工艺简单、成本低廉。对该羧基磁珠做SEM 测试，将制得的羧基磁珠表面进行喷金处理，用HitachiS-4700m(II)型扫描电镜观察和分 析样品表面形貌特征，加速电压15kV，结果如图1所示，从图1中我们可以看出，制得的羧基 磁珠粒子比表面大，吸附量高，纯度高，对传质影响较小;粒径均一，理化性质稳定。
[0071 ]四、羧基磁珠固定化谷氨酸脱羧酶的方法 [0072] 1、磁珠的活化
[0073] 取lmg羧基磁珠(约100yL磁悬液)于离心管中，在样品混合仪上震荡5-10min，然后 将离心管放置于磁分离架上，待磁珠完全被吸附，把上清液抽掉(小心不要抽掉磁珠），加入 lmL 15mM 2-(N-吗啉）乙磺酸一水合物(MES)(pH6.0)溶液洗涤磁珠，重复洗涤一次之后，再 加入100yL 15mM MES(pH6.0)溶液重悬磁珠，再加入100yL(10mg/mL)碳二亚胺(EDC)(使用 预冷的15mM MES(pH6.0)溶液，并且现配现用），最后混合均匀，25 °C条件下，在混合仪上活 化30min。
[0074] 2、磁珠的包被
[0075] 使用lmL 15mM的MES(pH6.0)溶液洗涤活化后的磁珠一遍，进行磁分离，弃上清液， 接着加入500yL谷氨酸脱羧酶酶液，室温反应过夜。
[0076]五、谷氨酸脱羧酶热稳定性的考察 [0077] 1、游离酶稳定性的考察
[0078]将20yL游离酶(GAD1407)分别在不同温度（20°C、40°C、45°C、50°C、55 °C、60°C、65 °C、70°C)恒温水浴条件下保存lOmin;保温结束后，迅速放置在冰上冷却，然后分别测定不 同的处理条件下的酶活性。
[0079]酶活测定方法为：取400yL底物溶液(pH 4.8、0.2mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲 液，含0.01 mmol/L PLP、100mmol/L底物L-MSG)加入到1.5mL离心管中，置于37°C金属浴中预 热，然后加入20yL纯酶迅速混匀，在37°C的条件下反应40min，反应结束后，取样品O.lmL加 入0.2mol/L pH 9.8的NaHC03 0.9mL以终止反应，离心，然后取0.5mL，再加入等量DNS-C1丙 酮(8g/L)溶液，避光，置于30°C下衍生lh，衍生后的样品经0.22μπι微孔滤膜过滤后，采用高 效液相色谱法(HPLC法)测定反应生成的GABA的含量，以测定酶的活力。
[0080] 2、羧基磁珠固定化后酶稳定性的考察
[0081] 向固定化后的谷氨酸脱羧酶磁珠中，加入32(^1^?85溶液(1〇11^，？!17.4)在震荡仪 (1400r/min、5min、室温）中分散处理，得到均勾分散的羧基磁珠固定化后的酶溶液;各自取 20yL加入到离心管中，分别在40~70°C水浴中保温10min(每个温度梯度设置一个平行，同 时做一个空白对照）；保温结束后，迅速放置冰上，冷却5分钟后，置于磁力架上，除去上清 液;再分别加入取400μL底物溶液在震荡仪（1400r/min、室温)上震荡40min，反应结束后，取 上清液0. lmL加入0.2mol/L pH 9.8的NaHC030.9mL以终止反应，离心；然后取0.5mL上清液， 再加入等量DNS-C1丙酮(8g/L)溶液，避光，置于30°C下衍生lh;衍生后的样品经0.22μπι微孔 滤膜过滤后，采用高效液相色谱法(HPLC法)测定反应生成的GABA的含量，以测定固定化后 每个温度处理下的酶活力。
[0082]最后，以温度为横坐标，以热处理后与处理前的比活力的比值为纵坐标作图，计算 半失活温度(T501())，实验结果如下图2、图3所示。游离酶和固定化酶的T501()分别为60.6Γ、 62.7°C ;相比游离酶，固定化酶半失活温度提高了2.1°C。
[0083] 3、HPLC操作条件
[0084] 色谱分离柱为Hypersil 0DS2C18(250mmX4.6mm)(伊利特公司），紫外检测波长为 254nm，进样量为10yL，控制柱温25 °C，流动相A为甲醇，流动相B为：四氢呋喃：甲醇： 0 · 05mo 1/L醋酸钠(pH6 · 2) (5:75:420，V/V/V)。
[0085] 梯度洗脱程序，见表1:
[0086] 表1 HPLC梯度洗脱程序
[0087]
[0088] 六、谷氨酸脱羧酶的操作稳定性考察
[0089] 酶的操作稳定性的测定方法:将固定化酶于适宜反应条件下进行催化反应，并测 定酶活力，反应结束后，回收固定化酶并用PBS溶液冲洗，再重新置于新取的底物溶液，重复 使用10次，测其剩余酶活。以第一次酶活力为100%，用相对活力来表示酶活力的变化趋势。 结果如图3所不。
[0090]实验结果表明，重复使用10次后，羧基磁珠固定化谷氨酸脱羧酶仍保持90.42%活 性。
【主权项】
1. 一种羧基磁珠固定化谷氨酸脱羧酶，以羧基磁珠为载体，所述谷氨酸脱羧酶通过氨 基和羧基偶联固定在羧基磁珠表面，其特征在于，所述谷氨酸脱羧酶的编码基因的碱基序 列如SEQ ID NO. 1所示。2. 如权利要求1所述羧基磁珠固定化谷氨酸脱羧酶的制备方法，包括以下步骤： (1) 提供谷氨酸脱羧酶和羧基磁珠； (2) 将谷氨酸脱羧酶与经活化的羧基磁珠混合，反应完成后，分离得到所述羧基磁珠固 定化谷氨酸脱羧酶。3. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述谷氨酸脱羧酶通过如下方法制备得 到： (a) 构建含目的基因的表达载体，将所述表达载体转化至大肠杆菌，获得含目的基因的 工程菌； (b) 诱导培养所述工程菌，收集菌体，破碎菌体细胞后，得到粗酶液； (c) 纯化。4. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述表达载体为pET-28a( + );宿主细胞 为E.coli BL21(DE3)。5. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述羧基磁珠的合成方法包括以下步 骤： (A) 在氮气保护下，向含Fe3+和Fe2+的水溶液中加碱和分散剂，调节溶液pH至碱性，制得 包被的Fe3〇4纳米磁性粒子； (B) 加入氧化剂进行氧化反应，反应完成后，分离得到所述羧基磁珠。6. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，Fe3+与Fe2+的摩尔比为2.0~2.5:1。7. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述羧基磁珠与谷氨酸脱羧酶的质量比 为 1:0.05 ~0.1〇8. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2)中，所述反应的温度为20~30 °C，时间为10~13h。9. 如权利要求1所述羧基磁珠固定化谷氨酸脱羧酶在合成γ-氨基丁酸中的应用。
【文档编号】C12R1/19GK105907742SQ201610455225
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月21日
【发明人】黄 俊, 梅乐和, 李佳男, 胡升, 谢湉, 谢东芳, 方卉
【申请人】浙江科技学院