专利名称：一种检测少儿铅中毒遗传易感风险的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测少儿铅中毒遗传易感风险的试剂 盒，通过同时检测与少儿铅中毒遗传易感风险密切相关的S氨基-y酮戊酸脱氡酶基H (ALAD)、基质y-羧基谷氨酸蛋白基因(MGP)、维生素D受体基因(VDR)和X射线交错互补修复基因1 (XRCC1)的单核苷 酸多态性位点基因型来评估少儿铅中毒遗传易感风险。
背景技术：
铅中毒是环境污染和不良生活习惯引起、易影响少年儿童健康的一类中毒。由亍少年儿童处于生长发 育阶段，因其特有的生理特征，容易发生铅中毒。铅中毒会影响少年儿童的体格生长和神经精神发育。随 着我国经济的迅速发展，环境污染及不良生活习惯引起的少年儿童健康问题也日显严重和受到关注。人体 对铅吸收、代谢的程度是由环境和遗传体质共同决定的，不同的人在相同的环境下受到铅的毒害程度是不 同的。因此，遗传体质不同的人应对潜在的铅中毒环境风险需要采取不同的策略。铅一旦进入到体内以后，首先与红细胞结合，然后转移到骨骼当中而沉积下来，在体内80%_90%的铅 储存在骨骼当中，而血液中的铅则随血流到达身体的各个器官，如大脑、肝脏、肾脏、免疫器官等，从而 造成损害，因此表现出的特征是多种多样的。对于儿童来说，常见的症状主要表现在神经系统和生长发育 方面注意力不集中、多动，学习成绩不好或下降。血铅水平与智商之间存在负相关关系，血铅水平每升 高10ug/dl智商下降2-3分。有些孩子会表现出性情、行为问题，如脾气暴躁、爱发脾气、啃手指、逃 学、旷课等。有的孩子则表现出体格生长发育受影响(身材瘦小)，锌、钙、铁等微量元素缺乏。还有些 表现出易患感冒、免疫力低下、腹痛、腿痛等。己知，编码S氨基-Y酮戊酸脱氢酶(ALAD)、基质Y-羧基谷氨酸蛋白(MGP)、维生素D受体(VDR) 和X射线交错互补修复基因1 (XRCC1)的四种基因与儿童铅中毒有密切关系。S氨基-Y酮戊酸脱氢酶(ALAD)基因编码的酶是血红素合成的关键酶之一，其功能是催化两个分子 的ALA(delta-aminolevulinate)聚合成卟胆原。研究已经发现ALAD的表型和基因型在人群中分布的多态 现象。Potluri等研究发现，控制ALAD遗传性状的基因位点位于染色体9q34，有2个等位基因(ALAD1和 ALAD2)，后者是导致ALAD缺乏的基因。这两种等位基因的不同表达组成了 3种遗传表现型ALAD1-1、 ALAD1-2和ALAD2-2。杂合子ALAD卜2的S - ALAD活力相当于正常人的50%,而ALAD2-2的酶活力仅仅是 正常人的2%。有学者报告ALAD基因还影响到铅在体内的分布和毒性,在同样血铅水平下携带ALAD1-2和 ALAD2-2基因者膑骨和腔骨中铅水平增高,且对肾脏的毒性也高于ALAD1-1基因型。基质Y-羧基谷氨酸蛋白(MGP)是维生素K依赖性蛋白，存在于骨骼、软骨、心脏、肾脏和肺等脏器 中。MGP具有抑制钙离子在软骨、血管壁和其他软组织发生异常沉积的作用，MGP的水平越高则它抑制钙 离子异常沉积的作用越强。有研究发现，血清中MGP浓度与该基因的启动子区(T-138C)，即rsl800802位 点的多态性密切相关，在三种基因型中，CC基因型最高、CT基因型次之、TT基因型最低。铅和钙均为二 价阳离子，它们有相同的吸收代谢途径。由于MGP影响钙的代谢，因此被认为能以相似的途径影响铅的代 谢。而关联分析研究则证明了这种推测。2003年，张文众等为探讨基质y-羧基谷氨酸蛋白(MGP)基因多 态性和血铅水平的关系,寻找与儿童铅中毒易感性有关的基因,测定了 355名6 12岁的中国汉族儿童的 血铅水平。采用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)分析MGP基因T-138C位点的多态 性。结果表明，在铅污染地区TT基因型儿童的血铅水平显著高于CC基因型儿童(468.24ug/L. vs. 430.31 ng/L, P<0.05)。结果显示MGP基因启动子区T-138C多态性影响生活在铅污染环境中儿童的血铅水平。 2006年，张文众等对345名6-12岁中国汉族儿童的研究中，再一次肯定了 MGP基因T-138C位点TT基因型是儿童铅中毒的易感基因。维生素D受体(VDR)编码维生素D3的核激素受体，该蛋白也是胆石酸的第二受体。VDR属于转录调 控因子，为类固醇激素/甲状腺类激素受体超家族的成员。该蛋白对基因表达的调节主要通过一系列代谢 反应通路，包括免疫反应和肿瘤激活通路。该基因的突变会导致维生素D缺乏引起的徇偻病。已知VDR基 因中有多个多态性位点。其中Bsra I位点(rsl544410)位于VDR基因内含子9处，该多态可能和基因的转录效率有关。Fokl位点(rsl0735810)变异使VDR翻译从第2个密码子开始，结果翻译出的蛋白质少3 个氨基酸，为424个氨基酸。T叫I位点(rs731236)位于VDR基因外显子10处，该多态可能与基因的转 录效率有关。这些位点的变异，都可以导致VDR基因转录水平下降或影响VDR蛋白的活性。多项国内外研 究证实，VDR基因与钙等金属离子在体内的吸收代谢有显著相关性。铅和钙在体内的代谢非常相似而且互 相影响，VDR可以通过影响钙代谢，间接影响铅的吸收。X射线交错互补修复基因l (XRCC1)编码的蛋白对因电离辐射和烷基化物引起的DNA单链断裂能起到 有效的修复作用。XRCC1编码的蛋白与DNA连接酶III、聚合酶e 、多聚ADP核糖转移酶交互作用，参与 DNA的碱基切除修复(Base Excision R印air， BER)通路。研究证实，铅接触可诱发机体引起氧化应激所 致DNA损伤。XRCC1作为重要的DNA损伤修复基因，因此与铅中毒产生一定关联性。在关联分析研究方面 结果显示XRCC1 A194W (rsl799782位点)的CT+TT在病例组和内对照组的分布频率差异有统计学意义 (P〈0.05) , CT+TT基因型能增加铅中毒的易感性(0R-2. 46, 95% CI=1. 16 5. 21),提示XRCC1基因A194W 的多态性可能与铅中毒易感性有关。发明内容基于S氨基-y酮戊酸脱a酶基因(ALAD)、基质y-羧基谷氨酸蛋白基因(MGP)、维生素D受体基因 (VDR)和X射线交错互补修复基因1 (XRCC1)上的5个SNPs位点多态性可用来评估少儿铅中毒遗传易感 风险的基础上，本发明提供一种检测少儿铅中毒遗传易感风险的试剂盒。 该试剂盒包括检测S氨基-y酮戊酸脱氢酶基因上rsl800435号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探 针对；检測基质Y-羧基谷氨酸蛋白基因上rsl800802号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探 针对；检測维生素D受体基因上rsl544410号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；检测维生素D受体基因上rs731236号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；检测X射线交错互补修复基因1上rsl799782号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCh溶液、反应缓冲液、去离子水等)。本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对S氨基-Y酮戊酸脱氢酶基因上rsl800435号SNP位点、基 质Y -羧基谷氨酸蛋白基因上rsl800802号SNP位点、维生素D受体基因上rsl544410号和rs731236号SNP 位点、X射线交错互补修复基因1上rsl799782号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含这5个SNPs位点 的DNA片段的引物对。设计这类引物对是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO: l和2、 3和4、 5和6、 7和8、 9和10所示序列的引物对。特异性引物对可用常规的合成技术进 行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的引物不限-丁这五对引物。本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是指针对S氨基-y酮戊酸脱氢酶基因上rsl800435号SNP位点、 基质Y -羧基谷氨酸蛋白基因上rsl800802号SNP位点、维生素D受体基因上rsl544410号和rs731236号 SNP位点、X射线交错互补修复基因1上rsl799782号SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性 检测出这五个SNPs位点基因型的Taqman探针对。设计这类探针是本领域技术人员能够轻易完成的。优选 地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO: 11和12、 13和14、 15和16、 17和18、 19和20所示序列的Taqman 探针对。特异性荧光探针对可用常规的探针合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的特 异性荧光Taq腿n探针对不限于这五对探针，所有可用丁荧光定量PCR法检测本发明中所述用来评估骨质 疏松症易感遗传风险的五个SNPs位点的探针均在本发明范围内。本发明试剂盒的组分和含量包括5^1 10 X荧光定量PCR反应缓冲液，0.5^1 25mM dNTP混合液，3nl 25mM MgCh溶液，0. 125^1 (5units/Vl) Taq DM聚合酶， 20nM特异性引物对每条引物各0.225(xl， 10pM特异性荧光探针对每条探针各0. 25nl， 去离子水26. 625^1。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20'C 。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，或按照厂商所建议的条件。实施例l.检测试剂盒的使用 步骤l: DNA模板的抽取 用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。 步骤2:荧光定量PCR反应使用检测少儿铅中毒遗传易感风险的荧光定量PCR检测试剂盒，其中，含有下列引物对和荧光探针对 有义引物l: 5' - CCCCTCTACCCACACC -3' (SEQ ID NO: 1) -GCGTAGGCCCTCTTCC -3' (SEQ ID NO: 2) GGGAAAACTGCCCACTC -3' (SEQ ID NO: 3) GMGGGTTGGCACTGAAC -3' (SEQ ID NO: 4) GAGCAGAGCCTGAGTATT -3' (SEQ ID NO: 5) TTCCTGGGGCCACAGA -3' (SEQ ID NO: 6) TGGACAGGCGGTCC _3' (SEQ ID NO: 7) CTGGGGTGCAGGAC -3' (SEQ ID NO: 8) TGGACAGGCGGTCCTG -3' (SEQ ID NO: 9) CTGGGGTGCAGGACGC -3' (SEQ ID NO: 10)TGGTGTGAAgCGGCTGGA -3' (SEQ ID NO: 11) TGGTGTGMaCGGCTGGA -3' (SEQ ID NO: 12) MTGACtGTTTGGGM -3' (SEQ ID NO: 13) MTGACcGTTTGG -3， (SEQ ID NO: 14) GGGAATGtGCAGGC -3' (SEQ ID NO: 15) GGAATGcGCAGGC -3， (SEQ ID NO: 16) TGGCCTCgATCAG -3' (SEQ ID NO: 17) TGGCCTCaATCAG -3' (SEQ ID NO: 18) CTTCAGCcGGATCA -3' (SEQ ID NO: 19) TTCTTCAGCtGGATCA -3， (SEQ ID NO: 20) 有义引物l,反义引物l、带VIC荧光基团探针1、带FAM荧光基团探针l特异地针对检测编码白细胞 介素6基因上rsl800795号SNP位点多态性有义引物2，反义引物2、带VIC荧光基团探针2、带FAM荧光基团探针2特异地针对检测骨保护素 TNFRSF11B基因上rs2073618号SNP位点多态性；有义引物3，反义引物3、带VIC荧光基团探针3、带FAM荧光基团探针3特异地针对检测肿瘤坏死因子-a基因上rsl800629号SNP位点多态性；有义引物4，反义引物4、带VIC荧光基团探针4、带FAM荧光基团探针4特异地针对检测维生素D受 体基因上rsl544410号SNP位点多态性有义引物5，反义引物5、带VIC荧光基团探针5、带FAM荧光基团探针5特异地针对检测维生素D受 体基因上rs731236号SNP位点多态性反义引物l: 5'有义引物2: 5'反义引物2: 5'有义引物3: 5'反义引物3: 5'有义引物4: 5'反义引物4: 5'有义引物5: 5'反义引物5: 5' 带VIC荧光基团探针1: 5'带FAM荧光基团探针1: 5' 带VIC荧光基团探针2: 5' 带FAM荧光基团探针2: 5' 带VIC荧光基团探针3: 5' 带FAM荧光基团探针3: 5' 带VIC荧光基团探针4: 5' 带FAM荧光基团探针4: 5' 带VIC荧光基团探针5: 5' 带FAM荧光基团探针5: 5'5个SNPs位点分别进行5次独立的荧光定量PCR反应，每个反应的体系为总体积10jil，包含浓度为 20ngAd的DNA模板2nl、 lfd 10 X荧光定量PCR反应缓冲液、0. 1^1 25mM dNTP混合液、0. 6^1 25mM MgCl2 溶液、0.025^1 (5units/nl) Taq DNA聚合酶、20一的有义引物和反义引物各0. 225^1、 10一的带VIC 荧光探针和带FAM荧光探针各0. 25^1 ，去离子水5. 325"。在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50'C、 2分钟，95°C、 IO分钟，进行60个循环的 恥'C、 30秒，60'C、 l分钟。反应结束后在ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。步骤3: SNP基因型分析熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根 据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。实施例2.对人们进行少儿铅中毒遗传易感风险检测的服务 步骤l: DM提取由医院检验科医师指导被检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮 细胞的DNA抽提。步骤2:基因分型检测使用本发明提供的试剂盒，对被检测者基因组DNA的编码白细胞介素6基因上rsl800795号SNP位点、 骨保护素TNFRSF11B基因上rs2073618号SNP位点、肿瘤坏死因子-a基因上rsl800629号SNP位点、维生 素D受体基因上rsl544410号和rs731236号位点分别进行荧光定量PCR检测，确定这五个SNPs位点的基 因型。步骤3:少儿铅中毒遗传易感风险的分析通过对被检测者SNPs基因型的分析，出具少儿铅中毒遗传易感风险的分析报告单。报告中详细说明 了被检测者骨质疏松症易感遗传风险的高低，并由医师向被检者详细说明和解读少儿铅中毒遗传易感风险 分析报告单。序列表<110>上海主健生物工程有限公司<120> —种检测少儿铅中毒遗传易感风险的试剂盒<勝20<210> 1 <211〉 16 〈212〉, <213>人工序列<220>〈223〉引物 <400〉 1CCCCTCTACC CACACC 16<210〉 2 <211〉 16 <212〉腿 <213>人工序列<220〉<223〉引物. <400〉 2GCGTAGGCCC TCTTCC 16<210〉 3 <211〉 17 <212> DNA <213>人工序列<220><223>引物 <400> 3GGGAAAACTG CCCACTC 17<210〉 4 <211> 18 <212> ■ <213>人工序列<220>200710037176. 4<223>引物 <■ 4GAAGGGTTGG CACTGAAC<210> 5 <211> 18 <212> DNA <213>人工序列〈220><223>引物 <400> 5GAGCAGAGCC TGAGTATT<210> 6 <211> 16 〈212〉 DM <213〉人工序列<220〉<223>引物 <400> 6TTCCTGGGGC CACAGA<210〉 7 <211〉 14 <212〉 DNA <213〉人工序列<220><223〉引物 <揚7TGGACAGGCG GTCC<210> 8 <211> 14 <212〉鹏 <213>人工序列<220><223>引物说明书第6/9页181816〈400》CTGGGGTGCA GGAC<210〉 9 <211> 16 <212>隨 <213>人工序列<220><223>引物 <400〉 9TGGACAGGCG GTCCTG<210> 10<21D 16〈212〉 DNA <213〉人工序列<220〉<223〉引物 <400〉 10CTGGGGTGCA GGACGC<210〉 11 <211> 18 <212〉 DNA 〈213〉人工序列<220〉<223〉探针 催〉11TGGTGTGAAg CGGCTGGA<210〉 12<211> 18<212> DNA <213>人工序列<220><223>探针 < 12TGGTGTGAAa CGGCTGGA说明书第7/9页141616189<210〉 13 〈211> 16 <212> DNA <213>人工序列〈220〉<223>探针 <400〉 13AATGACtGTT TGGGAA 16<210> 14 <211> 13 〈212> DNA 〈213>人工序列<220><223>探针 <400> 14AATGACcGTT TGG 13<210> 15 <211〉 14 <212〉腿 〈213〉人工序列<220〉<223>探针 <400> 15GGGAATGtGC AGGC "<210> 16<211> 13<212> ■ <213>人工序列〈220>〈223〉探针 〈400〉 16GGAATGcGCA GGC 13 <210> 17<211> 13 <212> DNA <213>人工序列<220><223>探针 <400> 17TGGCCTCgAT CAG 13<210> 18 <211> 13 <212> DNA <213〉人工序列<220> <223>探针■> 18TGGCCTCaAT CAG 13〈210〉 19<211〉 14<212〉 DNA <213〉人工序列<220〉<223〉探针 <400> 19CTTCAGCcGG ATCA 14<210> 20 <211〉 16 <212> DNA <213>人工序列<220〉<223>探针 < 20TTCTTCAGCt GGATCA 1权利要求
1. 一种检测少儿铅中毒遗传易感风险的试剂盒，其特征在于包括同时检测δ氨基-γ酮戊酸脱氢酶基因上rs1800435号SNP位点、基质γ-羧基谷氨酸蛋白基因上rs1800802号SNP位点、维生素D受体基因上rs1544410号和rs731236号SNP位点、X射线交错互补修复基因1上rs1799782号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物对是指针对S氨基-y酮戊酸脱氢 酶基因上rsl800435号SNP位点、基质Y -羧基谷氨酸蛋白基因上rsl800802号SNP位点、维生素D受体 基因上rsl544410号和rs731236号SNP位点、X射线交错互补修复基因1上rsl799782号SNP位点而设计， 能特异性扩增出包含这5个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性荧光探针对是指针对S氨基-Y酮戊酸 脱氢酶基因上rsl800435号SNP位点、基质y -羧基谷氨酸蛋白基因上rsl800802号SNP位点、维生素D 受体基因上rsl544410号和rs731236号SNP位点、X射线交错互补修复基因1上rsl799782号SNP位点而 设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出这五个SNPs位点基因型的T叫man探针对。
4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性引物对选自具有SEQIDNO: l和2、 3 和4、 5和6、 7和8、 9和IO所示序列的引物对。
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性荧光探针选自具有SEQ ID NO: 11和 12、 13和14、 15和16、 17和18、 19和20所示序列的Taqman探针对。
6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括5nl IOX荧光定量PCR反 应缓冲液、0. 5nl25mMdNTP混合液、3jil 25mMMgCl2溶液、0.125^1 (5units/nl) TaQDNA聚合酶、20pM 特异性引物对每条引物各0. 225^1、 l(HiM特异性荧光探针对每条探针各0.25^1、去离子水26.625|il。本 试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20'C 。
全文摘要
本发明公开了一种检测少儿铅中毒遗传易感风险的试剂盒。该试剂盒包括同时检测δ氨基-γ酮戊酸脱氢酶基因上rs1800435号SNP位点、基质γ-羧基谷氨酸蛋白基因上rs1800802号SNP位点、维生素D受体基因上rs1544410号和rs731236号SNP位点、X射线交错互补修复基因1上rs1799782号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、用于荧光定量PCR检测的常规组件等。本发明的试剂盒通过同时检测与少儿铅中毒遗传易感风险密切相关的单核苷酸多态性位点基因型来评估少儿铅中毒遗传易感风险。
文档编号C12N15/11GK101240326SQ20071003717
公开日2008年8月13日 申请日期2007年2月6日 优先权日2007年2月6日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司