专利名称：：一种检测女性骨质疏松症易感遗传风险的试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测女性骨质疏松症易感遗传风险的试剂盒，通过同时检测与女性骨质疏松症易感遗传风险密切相关的白细胞介素6基因(IL-6)、骨保护素基因TNFRSF11B(OPG)、肿瘤坏死因子-a基因(TNF-a)、维生素D受体基因(VDR)的单核苷酸多态性位点基因型来评估女性骨质疏松症易感遗传风险。
背景技术：
：骨质疏松症(osteoporosis,0P)是一种以低骨量和骨组织微结构破坏为特征，导致骨质脆性增加和易于骨折的代谢性疾病。OP可分为原发性和继发性两类。继发性者的原发病因明确，常由内分泌代谢疾病(如性腺功能减退症、甲亢、甲旁亢、Cushing综合症、l型糖尿病等)或全身性疾病(如器官移植术后、肠吸收不良综合症、神经性厌食、肌营养不良症、慢性肾衰竭、骨髓纤维化、白血病、系统性红斑狼疮、营养不良症等)引起。原发性者又可分为两种亚型，即I型和II型。I型即绝经后骨质疏松症(postmenopausalosteoporosis,PM0P)发生于绝经后妇女，其中多数患者的骨转换(turnover)率增高，亦称高转换型0P;II型(老年性)OP多见于60岁以上的老人，女性的发病率为男性的2倍以上。己知，编码白细胞介素6(IL-6)、骨保护素TNFRSF11B(0PG)、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、维生素D受体(VDR)四种基因与女性骨骼健康有密切关系。基因编码的白细胞介素6(IL-6)是一种多功能细胞因子，参与多种细胞的生长、分化和功能调节，在免疫和炎症反应中具有重要作用，是机体重要的免疫-神经-内分泌调节因子。其功能的多样性与许多细胞表面有IL-6受体的表达，IL-6受体和信号传导部分GP130将多种生物信号传给不同的组织和细胞有关。IL-6可由T细胞、B细胞、单核细胞和非淋巴细胞产生，其基因表达的变化与某些疾病的生理和病理变化密切相关。近来研究发现IL-6参与骨代谢，IL-6的主要作用是诱导破骨细胞产生和破骨细胞活化，IL-6和IL-1可以直接加强破骨细胞的活性、抑制其凋亡、并延长破骨细胞的寿命；另外，IL-6还通过细胞核因子-kB(NF-kB)受体活化因子(RANK)的配基(RANKL)依赖机制加强破骨细胞的能力，这主要是经由骨保护素(0PG)/RANKL/RANK系统实现的。两方面协同作用促使破骨活动加强，骨丢失增加。有人认为IL-6对成骨细胞有一定的增殖分化作用。IL-6的表达状况受基因调控，特别是IL-6的基因调控区与IL-6的表达具有更直接的关系；其血清水平的变化与一些疾病的病理生理过程密切相关。随着人们对分子病理学和疾病相关基因研究的不断深入，一些学者发现IL-6可能参与了脑血管疾病的病理生理过程。目前国外研究表明IL-6的基因调控区一174G/C的多态性(rsl800795)可改变IL-6的转录，G等位基因导致血清与组织中IL-6髙水平表达，与骨质疏松、动脉粥样硬化、冠心病等疾病密切相关。肿瘤坏死因子受体超家族，成员lib(TNFRSF11B),即骨保护素(osteoprotegerinOPG)是肿瘤坏死因子受体(tumornecroticfactorrec印torTNFR)超家族成员之一。0PG是一种分泌型糖蛋白，以单体形式在胞内合成，以双体形式分泌到胞外。OPG缺少跨膜和胞浆区域，但包含7个主要结构域。研究发现OPG不仅涉及骨重塑、免疫调节、血管的发生等过程，而且是影响破骨细胞分化、生成及活性的最终途径，在骨质疏松的发生机制中扮演着重要的角色。OPG基因存在多个核苷酸多态性，国内外研究已证明，rs2073618位点是位于OPG基因第一外显子上的C/G变异。OPG基因外显子1编码的是OPG信号肽部分，是OPG从细胞中分泌所必需的。这一多态性使该外显子的第三个氨基酸由赖氨酸Lys(AAG)变成了天冬酰氨Asn(MC)，赖氨酸是一种必需氣基酸而天冬氨酰是一种极性氨基酸。这种在基因信号肽区域的点多态性可能会影响OPG的分泌动力学或OPGraRNA的表达其中GG基因型将增加妇女骨质疏松的发病风险。TNF-a(T咖ornecrosisfactor-a)为编码单核细胞和巨噬细胞所产生的肿瘤坏死因子的基因，由该基因编码的蛋白是一种多功能的细胞因子，它能显著诱导巨噬细胞以抑制细菌生长，诱导多种细胞因子产生间接调节免疫细胞的活性，增强特异性免疫保护功能。它不仅促进破骨前体细胞增殖、分化，而且对成骨细胞也有多种效应。rsl800629是位于第六号染色体上6p21.3区TNF-a基因启动区一个G/A多态，被认为可能与该基因的转录调节有关。该位点的多态性与骨疾病、胰岛素耐受性、过氧化脂质，血脂，血糖等因素相关。VDR(vitaminD(1,25-dihyd而yvitaminD3)rec印tor)编码维生素D3的核激素受体，该奪白也是胆石酸的第一受体。VDR属于转录调控因子，为类固醇激素/甲状腺类激素受体超家族的成员。该蛋白对基因表达的调节主要通过一系列代谢反应通路，包括免疫反应和肿瘤激活通路。该基因的多态性会导致维生素D缺乏引起的佝偻病。目前报导的VDR基因多态性主要与rsl544410和rs731236单核苷酸多态性位点有关，可用限制性长度多态性分析，因此其多态性位点相应的BsmI和TaqI限制酶命名，分别为第9内含子的BsmI(G/A)多态性位点，及第10外显子的TaqI位点，TaqI位点为T/C多态性，导致编码氨基酸密码子352ATT/ATC多态性。一般用b和t表示存在这2种内切酶的多态性位点，用B和T表示缺乏这2种内切酶的多态性位点。
发明内容基于编码白细胞介素6基因(IL-6)、骨保护素TNFRSF11B基因(OPG)、肿瘤坏死因于-a基因(TNF-a)、维生素D受体基因(VDR)上的5个SNPs位点多态性可用来评估骨质疏松症易感遗传风险的基础上，本发明提供一种检测女性骨质疏松症易感遗传风险的试剂盒。该试剂盒包括检测编码白细胞介素6基因上rsl800795号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；检测骨保护素TNFRSFllB基因上rs2073618号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对:检测肿瘤坏死因子-a基因上rsl800629号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；检测维生素D受体基因上rsl544410号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；检测维生素D受体基因上rs731236号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；荧光定量PCR反应组件(包括Taq嗨、dNTP混合液、MgCL溶液、反应缓冲液、去离子水等)。本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对编码白细胞介素6基因上rsl800795号SNP位点、骨保护素TNFRSF11B基因上rs2073618号SNP位点、肿瘤坏死因子-a基因上rs1800629号SNP位点、维生素D受体基因上rsl544410号和rs731236号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含这5个SNPs位点的DNA片段的引物对。设计这类引物对是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQIDN0:1和2、3和4、5和6、7和8、9和10所示序列的引物对。特异性引物对可用常规的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的引物不限于这五对引物。本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是指针对编码白细胞介素6基因上rsl800795号SNP位点、骨保护素TNFRSFllB基因上rs2073618号SNP位点、肿瘤坏死因子-a基因上rsl800629号SNP位点、维生素D受体基因上rsl544410号和rs731236号SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出这五个SNPs位点基因型的Taqman探针对。设计这类探针是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQIDNO:11和12、13和14、15和16、17和18、19和20所示序列的T叫man探针对。特异性荧光探针对可用常规的探针合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的特异性荧光Taqman探针对不限于这五对探针，所有可用于荧光定量PCR法检测本发明中所述用来评估骨质疏松症易感遗传风险的五个SNPs位点的探针均在本发明范围内。本发明试剂盒的组分和含量包括5jd10X荧光定量PCR反应缓冲液，0.5nl25mMdNTP混合液，3jd25mMMgCh溶液，0.125^1(5units/jxl)T叫DNA聚合酶，20nM特异性引物对每条引物各0.225nl，10jiM特异性荧光探针对每条探针各0.25fil，去离子水26.625nl。本试剂盒供一人份检測应用，试剂盒的保存温度为-20'C。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。卜列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。实施例l.检测试剂盒的使用步骤l:DNA模板的抽取用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。步骤2:荧光定量PCR反应使用检测女性骨质疏松症易感遗传风险的荧光定量PCR检测试剂盒，其中，含有下列引物对和荧光探针对有义引物l:5'-ACTTTTCCCCCTAGTTG-3'(SEQIDNO:1)反义引物1:5，-TGTGCMTGTGACGTC-3'(SEQIDNO:2)有义引物2:5，-TTACCACGAGCGCG-3'(SEQIDNO:3)反义引物2:5'-GGTTTCCGGGGACC-3'(SEQIDNO:4)有义引物3:5'-GAGGCAATAGGTTTTGAGGG-3'(SEQIDNO:5)反义引物3:5，-GGACCCTGGAGGCTGM-3'(SEQIDNO:6)有义引物4:5'-GAGCAGAGCCTGAGTATT-3'(SEQIDNO:7)反义引物4:5'-TTCCTGGGGCCACAGA-3'(SEQIDNO:8)有义引物5:5'-TGGACAGGCGGTCC_3'(SEQIDNO:9)反义引物5:5'-CTGGGGTGCAGGAC-3'(SEQIDNO:10)带VIC荧光基团探针l:5'-CTTGCcATGCTAAA-3'(SEQIDNO:11)带FAM荧光基团探针l:5'-CTTGCgATGCTAAA-3'(SEQIDNO:12)带VIC荧光基团探针2:5,-AGCAAcTTGTTCATT-3'(SEQIDNO:13)带FAM荧光基团探针2:5'-AGCAAgTTGTTCATT_3'(SEQIDNO:14)带VIC荧光基团探针3:5'-CATGaGGACGG-3'(SEQIDNO:15)带FAM荧光基团探针3:5'-CATGgGGACG-3'(SEQIDNO:16)带VIC荧光基团探针4:5，-GGMTGcGCAGGC-3'(SEQIDNO:17)带FAM荧光基团探针4:5'-GGGAATGtGCAGGC-3'(SEQIDNO:18)带VIC荧光基团探针5:5'-TGGCCTCaATCAG-3'(SEQIDNO:19)带FAM荧光基团探针5:5'-TGGCCTCgATCAG-3'(SEQIDNO:20)有义引物l,反义引物l、带VIC荧光基团探针1、带FAM荧光基团探针l特异地针对检测编码白细胞介素6基因上rsl800795号SNP位点多态性；有义引物2，反义引物2、带VIC荧光基团探针2、带FAM荧光基团探针2特异地针对检测骨保护素TNFRSF11B基因上rs2073618号SNP位点多态性；有义引物3，反义引物3、带VIC荧光基团探针3、带FAM荧光基团探针3特异地针对检测肿瘤坏死因子-a基因上rsl800629号SNP位点多态性有义引物4，反义引物4、带VIC荧光基团探针4、带FAM荧光基团探针4特异地针对检测维生素D受体基因上rsl544410号SNP位点多态性；有义引物5,反义引物5、带VIC荧光基团探针5、带FAM荧光基团探针5特异地针对检测维生素D受体基因上rs731236号SNP位点多态性；5个SNPs位点分别进行5次独立的荧光定量PCR反应，每个反应的体系为总体积10^1，包含浓度为20ng/nl的DNA模板2fd、lpl10X荧光定量PCR反应缓冲液、0.lnl25mMdNTP混合液、0.6nl25mMMga溶液、0.025nl(5units/jU)TaqDNA聚合酶、20-的有义引物和反义引物各0.225^1、10一的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0.25jil,去离子水5.325jil。在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为5(TC、2分钟，95'C、10分钟，进行60个循环的95'C、30秒，6(TC、l分钟。反应结束后在ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。步骤3:SNP基因型分析熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。实施例2.对人们进行女性骨质疏松症易感遗传风险检测的服务步骤l:DNA提取由医院检验科医师指导被检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。步骤2:基因分型检测使用本发明提供的试剂盒,对被检测者基因组DNA的编码白细胞介素6基因上rsl800795号SNP位点、骨保护素TNFRSFllB基因上rs2073618号SNP位点、肿瘤坏死因子-a基因上rsl800629号SNP位点、维生素D受体基因上rsl544410号和rs731236号位点分别进行荧光定量PCR检测，确定这五个SNPs位点的基因型。步骤3:女性骨质疏松症易感遗传风险的分析通过对被检测者SNPs基因型的分析，出具女性骨质疏松症易感遗传风险的分析报告单。报告中详细说明了被检测者骨质疏松症易感遗传风险的高低，并由医师向被检者详细说明和解读女性骨质疏松症易感遗传风险分析报告单。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><223>引物<400>4GGTTTCCGGGGACC14〈210〉<211>〈212〉〈213>520DNA人工序列<220><223>引物■>5GAGGCAATAGGTTTTGAGGG20〈210><211〉〈212〉<213>617薩人工序列<220><223>引物<400〉6GGACCCTGGAGGCTGAA17<210><211〉<212><213>18醒人工序列<220〉<223>引物〈400〉7GAGCAGAGCCTGAGTATT18<210>8〈211〉16〈212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<柳〉8TTCCTGGGGCCACAGA16<210〉<211〉<212〉<213〉914DNA人工序列<220><223〉引物<400>9TGGACAGGCGGTCC14<210〉<211〉<212〉<213>1014卵A人工序列<220〉<223〉引物<柳〉10CTGGGGTGCAGGAC14<210><211><212〉<213>1114DNA人工序列<220〉<223>探针<400〉11CTTGCCATGCTAAA14<210><211〉<212〉〈213〉1214DNA人工序列<220><223〉探针<400〉12CTTGCgATGCTAAA14〈210〉13〈211>15<212>DNA<213>人工序列〈220〉<223>探针<400>13AGCAAcTTGTTCATT115〈210><211>〈212〉<213〉1415DNA人工序列<220><223>探针<400〉14AGCAAgTTGTTCATT15<210><211><212><213>1511DNA人工序列<220><223>探针<柳〉15CATGaGGACGG11<210><211><212〉<213>1610DNA人工序列〈220〉〈223>探针<柳〉16CATGgGGACG10<210>17<211〉13<212〉DNA<213>人工序列<220>〈223>探针<400〉17GGAATGcGCAGGC13〈210〉<211>〈212〉<213>1814DNA人工序列<220><223>探针<400>18GGGAATGtGCAGGC14<210>〈211><212><213〉1913DNA人工序列<220><223>探针〈400>19TGGCCTCaATCAG13<210><211><212><213>2013DNA人工序列<220>〈223〉探针<400>20TGGCCTCgATCAG1权利要求1.一种检测女性骨质疏松症易感遗传风险的试剂盒，其特征在于包括同时检测编码白细胞介素6基因上rs1800795号SNP位点、骨保护素TNFRSF11B基因上rs2073618号SNP位点、肿瘤坏死因子-α基因上rs1800629号SNP位点、维生素D受体基因上rs1544410号和rs731236号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物对是指针对编码白细胞介素6基因上rsl800795号SNP位点、骨保护素TNFRSF11B基因上rs2073618号SNP位点、肿瘤坏死因子-a基因上rsl800629号SNP位点、维生素D受体基因上rsl544410号和rs731236号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含这5个SNPs位点的DNA片段的引物对。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性荧光探针对是指针对编码白细胞介素6基因上rsl800795号SNP位点、骨保护素TNFRSF11B基因上rs2073618号SNP位点、肿瘤坏死因子-a基因上rsl800629号SNP位点、维生素D受体基因上rsl544410号和rs731236号SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出这五个SNPs位点基因型的Taqman探针对。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性引物对选自具有SEQIDNO:l和2、3和4、5和6、7和8、9和IO所示序列的引物对。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性荧光探针选自具有SEQIDNO:11和12、13和14、15和16、17和18、19和20所示序列的Taqman探针对。6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括5^1IOX荧光定量PCR反应缓冲液、0.5jxl25mMdNTP混合液、3pl25mMMgCh溶液、0.125^1(5units/nl)TaqDNA聚合酶、20pM特异性引物对每条引物各0.225jxl、10jiM特异性荧光探针对每条探针各0.25nl、去离子水26.625^1。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。全文摘要本发明公开了一种检测女性骨质疏松症易感遗传风险的试剂盒。该试剂盒包括同时检测编码白细胞介素6基因上rs1800795号SNP位点、骨保护素TNFRSF11B基因上rs2073618号SNP位点、肿瘤坏死因子-α基因上rs1800629号SNP位点、维生素D受体基因上rs1544410号和rs731236号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、用于荧光定量PCR检测的常规组件等。本发明的试剂盒通过同时检测与骨质疏松症易感遗传风险密切相关的单核苷酸多态性位点基因型来评估女性骨质疏松症易感遗传风险。文档编号C12N15/11GK101240322SQ20071003717公开日2008年8月13日申请日期2007年2月6日优先权日2007年2月6日发明者冯哲民,邹祖烨申请人:上海主健生物工程有限公司